2604795 - Стабилизированная альфа-галактозидаза и ее применение

Стабилизированная альфа-галактозидаза и ее применение

Иллюстрации

Показать все

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлены варианты мультимерной белковой структуры, которая гидролизует концевой α-галактозильный фрагмент глоботриаозилцерамида и содержит два мономера α-галактозидазы, ковалентно связанных друг с другом через связывающий фрагмент, где мультимерная белковая структура представляет собой димерную белковую структуру. Представлены способы получения указанных вариантов мультимерных белковых структур, включающие взаимодействие α-галактозидазы со сшивающим агентом. Представлена фармецевтическая композиция, включающая указанную мультимерную белковую структуру. Группа изобретений позволяет получать мультимерные белковые структуры с более высокой стабильностью и повышенной активностью in vivo по сравнению с нативной формой α-галактозидазы, которые могут быть использованы при лечении болезни Фабри. 5 н. и 20 з.п. ф-лы, 83 ил., 10 табл., 19 пр.

Реферат

ОБЛАСТЬ И УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Некоторые варианты настоящего изобретения относятся к новым мультимерным белковым структурам, включая, но не ограничиваясь, мультимерными белковыми структурами α-галактозидазы, и их применению для лечения болезни Фабри.

Лизосомальный фермент α-галактозидаза-А (α-GAL или α-Gal, EC 3.2.1.22) катализирует отщепление галактозы от олигосахаридов, гликопротеинов и гликолипидов при катаболизме макромолекул. Недостаток лизосомальных ферментов приводит к накоплению их субстратов в тканях, данные состояния известны как лизосомальные болезни накопления. У людей отсутствие функциональной α-галактозидазы приводит к накоплению в тканях гликолипидов, содержащих концевые остатки α-галактозы (в первую очередь глоботриаозилцерамида, который также называют «церамид-тригексозид», «CTH» или «Gb3»), что приводит к болезни Фабри. Болезнь Фабри является сцепленным с Х-хромосомой рецессивным заболеванием, впервые описанным в 1898 году, характеризующимся хроническими болями, помутнением зрения, поражением печени и почек, поражением кожи, повреждением сосудов и/или сердечной недостаточностью. Рекомбинантная человеческая α-галактозидаза-А обладает способностью восполнять ферментативную активность у больных, и заместительная терапия с использованием фермента (ERT) α-GAL была одобрена в США в 2003 году для лечения болезни Фабри. α-GAL стал вторым рекомбинантным белком, одобренным для лечения лизосомальной болезни накопления после β-глюкозидазы, применяемой для лечения болезни Гоше.

Эндогенная и рекомбинантная α-Gal катализируют гидролиз терминально галактозилированных гликолипидов в лизосомах клеток таких органов как печень, почки, селезенка, сердце и т.д. Лизосомы характеризуются низким рН, достигающим 4,5. Лизосомальные ферменты, в том числе α-GAL, следовательно, проявляют максимальную активность при указанных низких уровнях рН.

Считается, что современное ERT лечение болезни Фабри, основанное на полученной в клетках млекопитающих рекомбинантной α-GAL, обладает ограниченной эффективностью. Указанное лечение только замедляет развитие болезни, но не остановливает его и не приводит к действительному и полному излечению. Альтернативно, в некоторых случаях ERT с применением коммерческой рекомбинантной α-Gal должно быть прекращено в связи с развитием иммунного ответа на лечение, а в некоторых случаях лечение не может быть начато вследствие проблем с иммуногенностью.

Рентгеноструктурный анализ показал, что человеческая α-GAL представляет собой гомодимерный гликопротеин, в котором каждый мономер состоит из двух доменов, (β/α)₈ домена, содержащего активный центр, и С-концевого домена, содержащего восемь антипараллельных β-тяжей в составе двух листов в β-сэндвиче [Garman & Garboczi, J Mol Biol 2004, 337:319-335]. Два мономера расположены в ориентации голова к хвосту, и их димеризация является нековалентной. Два мономеров взаимодействуют, образуя поверхность взаимодействия, которая простирается на 75 Ǻ в ширину и включает площадь 2200 Ǻ². В формировании поверхности взаимодействия димера участвуют 30 остатков каждого мономера. Два активных центра димера разделяет приблизительно 50 Ǻ.

Кристаллическая структура α-Gal была разрешена для белка без лигандов, а также для белка, связавшего в качестве лиганда галактозу. Указанные две структуры характеризуются небольшими изменениями при связывании лиганда по сравнению отсутствием связания лиганда. Однако, следует отметить, что использование галактозы вместо природного субстрата, глоботриаозилцерамида (Gb3), где последний характеризуется наличием протяженных липидных цепей, способных взаимодействовать с гидрофобным доменом одного мономера, в то время как концевая галактоза способна взаимодействовать с активным центром второго мономера, может привести к невозможности обнаружения кооперативности активных центров. Альтернативно, биохимические характеристики позволяют предположить наличие такой кооперативности, иллюстрирующей важность гомодимерной четвертичной структуры [Bishop & Desnick, J Biol Chem 1981, 256:1307-1316]. Были изучены кинетические свойства человеческой α-Gal и была показана кооперативность между мономерами гомодимерного фермента, каждый из которых имел взаимодействующий каталитический центр. Поэтому было предложено, что ферментативная активность и стабильность фермента может зависеть от его димеризации.

В WO 2009/024977, также поданной заявителями настоящего изобретения, которая включена в настоящий документ в полном объеме посредством отсылки, раскрыты конъюгаты сахарида и биомолекулы, ковалентно связанных между собой через не гидрофобный линкер, а также медицинские применения с использованием таких конъюгатов.

В международной заявке PCT/IL 2010/000956, также поданной заявителями настоящего изобретения, раскрыта методика, в которой используют α-галактозидазу, которая проявляет лизосомальную активность при более высоком рН, чем рН в лизосомах.

Уровень техники также включает Bendele et al. [Toxicological Sciences 1998, 42:152-157], патенты США №№5,256804, 5,580757 и 5766897, Международную заявку PCT/NL 2007/050684 (опубликована как WO 2008/075957) и Seely & Richey [J Chromatography A 2001, 908:235-241].

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения предусмотрены мультимерные белковые структуры, содержащие, по меньшей мере, два мономера α-галактозидазы, ковалентно связанных друг с другом через связывающий фрагмент, где мультимерная белковая структура обладает характеристиками, выбранными из группы, состоящей из:

(a) проявления α-галактозидазной активности при помещении мультимерной белковой структуры в условия человеческой плазмы на один час, которая, по меньшей мере, на 10% выше, чем активность нативной α-галактозидазы при помещении нативной α-галактозидазы в условия человеческой плазмы на один час;

(b) проявления α-галактозидазной активности, которая уменьшается при помещении мультимерной белковой структуры в условия человеческой плазмы на один час, по меньшей мере, на 10% меньше, чем активность нативной α-галактозидазы при помещении нативной α-галактозидазы в условия человеческой плазмы на один час

(c) проявления α-галактозидазной активности, которая остается практически неизменной при помещении мультимерной белковой структуры в условия человеческой плазмы на один час;

(d) проявления α-галактозидазной активности при помещении мультимерной белковой структуры в лизосомальные условия на одну неделю, которая, по меньшей мере, на 10% выше, чем активность нативной α-галактозидазы при помещении нативной α-галактозидазы в лизосомальные условия на одну неделю;

(e) проявления α-галактозидазной активности, которая уменьшается при помещении мультимерной белковой структуры в лизосомальные условия на одну неделю, по меньшей мере, на 10% меньше, чем активность нативной α-галактозидазы при помещении нативной α-галактозидазы в лизосомальные условия на одну неделю;

(f) проявления α-галактозидазной активности, которая остается практически неизменной при помещении мультимерной белковой структуры в лизосомальные условия на один день;

(g) проявления α-галактозидазной активности немедленно после помещения мультимерной белковой структуры в лизосомальные условия которая, по меньшей мере, на 10% больше, чем активность нативной α-галактозидазы немедленно после помещении нативной α-галактозидазы в лизосомальные условия;

(h) проявления α-галактозидазной активности немедленно после помещения мультимерной белковой структуры в водный раствор, имеющий рН 7 и температуру 37°C, которая, по меньшей мере, на 10% выше, чем активность нативной α-галактозидазы немедленно после помещении нативной α-галактозидазы в водный раствор, имеющий рН 7 и температуру 37°C и

(i) времени полураспада в кровотоке в физиологической системе, которое, по меньшей мере, на 20% больше, чем время полураспада в кровотоке нативной α-галактозидазы.

В соответствии с аспектами некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены мультимерные белковые структуры, содержащие, по меньшей мере, два мономера α-галактозидазы, ковалентно связанных друг с другом через связывающий фрагмент, где связывающий фрагмент отсутствует в нативной α-галактозидазе.

В соответствии с аспектами некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, включающая мультимерную белковую структуру, описанную в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В соответствии с аспектами некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения болезни Фабри, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества мультимерной белковой структуры, описанной в настоящем документе, что приводит к лечению болезни Фабри.

В соответствии с аспектами некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения мультимерной белковой структуры, описанной в настоящем документе, где способ включает взаимодействие α-галактозидазы со сшивающим агентом, который содержит связывающий фрагмент, описанный в настоящем документе, и, по меньшей мере, две реакционноспособные группы.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения связывающий фрагмент, описанный в настоящем документе, отсутствует в нативной α-галактозидазе. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, мультимерная белковая структура имеет характеристики, выбранные из группы, состоящей из:

(i) времени полураспада в кровотоке в физиологической системе, которое больше, чем время полураспада в кровотоке нативной α-галактозидазы. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения α-галактозидазная активность мультимерной белковой структуры, которая остается практически неизменной при помещении мультимерной белковой структуры в лизосомальные условия на один день, далее остается практически неизменной при при помещении мультимерной белковой структуры в лизосомальные условия на одну неделю. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения большее время полураспада в кровотоке мультимерной белковой структуры по сравнению с временем полураспада в кровотоке нативной α-галактозидазы, по меньшей мере, на 20% больше, чем время полураспада в кровотоке нативной α-галактозидазы. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения большее время полураспада в кровотоке мультимерной белковой структуры по сравнению с временем полураспада в кровотоке нативной α-галактозидазы, по меньшей мере, на 50% больше, чем время полураспада в кровотоке нативной α-галактозидазы. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения мультимерная белковая структура характеризуется α-галактозидазной активностью в органе при введении мультимерной белковой структуры позвоночным, где орган выбран из группы, состоящей из селезенки, сердца и почек.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения мультимерная белковая структура состоит из двух мономеров α-галактозидазы и белковая структуры представляет собой димерную белковую структуру. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения α-галактозидаза представляет собой человеческую α-галактозидазу. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения α-галактозидаза представляет собой растительную рекомбинантную α-галактозидазу. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения α-галактозидаза имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения α-галактозидаза представляет собой щелочную α-галактозидазу.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения α-галактозидаза представляет собой кислую α-галактозидазу.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения связывающий фрагмент содержит поли(алкиленгликоль).

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения поли(алкиленгликоль) содержит, по меньшей мере, две функциональные группы, где каждая функциональная группа образует ковалентную связь с одним из мономеров α-галактозидазы.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, по меньшей мере, две функциональные группы являются концевыми группами поли(алкиленгликоля).

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, по меньшей мере, один связывающий фрагмент имеет общую формулу:

-X₁-(CR₁R₂-CR₃R₄-Y)n-X₂-

где каждый из X₁ и Х₂ представляет собой функциональную группу, которая образует ковалентную связь, по меньшей мере, с одним мономером α-галактозидазы;

Y представляет собой О, S или NR₅;

n представляет собой целое число от 1 до 200,

каждый из R₁, R₂, R₃, R₄ и R₅ независимо выбран из группы, состоящей из водорода, алкильной, циклоалкильной, алкенильной, алкинильной, алкоксильной, гидроксильной, оксо, тиольной и тиоалкоксильной групп.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, по меньшей мере, одна из функциональных групп образует амидную связь с мономером α-галактозидазы.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения n представляет собой целое число от 5 до 150.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения n представляет собой целое число от 40 до 70.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит галактозу.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения мультимерная белковая структура предназначена для применения в качестве лекарственного средства.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения болезни Фабри.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения мультимерная белковая структура предназначена для применения в лечении болезни Фабри. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения способ получения включает взаимодействие димерной α-галактозидазы со сшивающим агентом. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения реакционноспособные группы включают уходящую группу.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения реакционноспособная группа реагирует с аминогруппой с образованием амидной связи. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения каждая из реакционноспособных групп способна образовывать ковалентную связь между связывающим фрагментом, и, по меньшей мере, одним мономером α-галактозидазы. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения молярное соотношение сшивающего агента к мономеру α-галактозидазы находится в диапазоне от 5:1 до 500:1.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения молярное соотношение находится в диапазоне от 75:1 до 300:1.

Если не указано иное, все технические и/или научные термины, используемые здесь, имеют тот же смысл, как это обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится изобретение. Примеры методов и/или материалов, которые могут быть использованы при практическом применении или тестировании вариантов осуществления изобретения, описаны ниже, хотя могут быть сипользованы методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь. В случае возникновения патентного спора описание патента, в том числе определения, будет иметь определяющее значение. Материалы, способы и примеры приведены только в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Патент или заявка содержит, по меньшей мере, одну Фигуру, выполненную в цвете. Копии данного патента или патентной заявки с цветной Фигурой (Фигурами) будут предоставлены Патентным ведомством по запросу и после необходимой оплаты. Некоторые варианты осуществления изобретения описаны здесь со ссылкой на прилагаемые Фигуры только в качестве примеров. Что касается непосредственно приводимых здесь Фигур, необходимо подчеркнуть, что показанные данные приведены в качестве примеров в иллюстративных целях для демонстрации вариантов осуществления изобретения. В связи с этим, описание, приведенное к Фигурам, делает очевидными для специалистов в данной области варианты воплощения изобретения.

Фиг.1 представляет собой график, показывающий активность Fabrazyme® α-GAL, Replagal® α-GAL и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I в зависимости от времени инкубации в искусственных условиях, соответствующих условиям в лизосоме (цитрат-фосфатный буфер, рН 4,6, 37°C);

Фиг.2 представляет собой график, показывающий активность Fabrazyme® α-GAL, Replagal® α-GAL и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I по отношению к галактозе (100 мг/мл) как функцию времени инкубации при моделируемых физиологических условиях (рН 7,4, 37°C);

Фиг.3 представляет собой график, показывающий активность Fabrazyme® α-GAL, Replagal® α-GAL и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I в зависимости от времени инкубации в плазме крови человека при 37°C;

Фиг.4 представляет собой график, показывающий активность Fabrazyme® α-GAL, Replagal® α-GAL, полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I и полученной в растениях рекомбинантной α-GAL-I по отношению к галактозе (100 мг/мл) как функцию времени инкубации при моделируемых условиях в лизосоме (цитрат-фосфатный буфер, рН 4,6, 37°C);

Фиг.5 представляет собой схему, изображающую молекулярную структуру примера сшивающего агента бис-N-гидроксисукцинимид-поли(этиленгликоля) (бис-NHS-PEG);

Фиг.6 представляет собой схему, изображающую димерный белок, который был введен в реакцию с бис-NHS-PEG сшивающим агентом;

Фиг.7 представляет собой сканированное изображение SDS-PAGE геля, показывающее полученную в растениях рекомбинантную α-GAL-I, прореагировавшую с бис-NHS-PEG₅ (дорожки 1-3), бис-NHS-PEG₈ (дорожки 7-9) и бис-NHS-PEG₄₅ (дорожки 4-6) при молярном соотношении бис-NHS-PEG:α-GAL 50:1 (дорожки 1, 4 и 7), 100:1 (дорожки 2, 5 и 8) и 200:1 (дорожки 3, 6 и 9), а также маркеры молекулярной массы (Mw) и не введенную в реакцию полученную в растениях рекомбинантную α-GAL-I в качестве контроля (Std) (стрелки показывают полосу, соответсвующую димеру α-GAL);

Фиг.8 представляет собой сканированное изображение геля после изоэлектрофокусирования, показывающее полученную в растениях рекомбинантную α-GAL-I, прореагировавшую с бис-NHS-PEG₅ (дорожки 1-3), бис-NHS-PEG₈ (полосы 7-9) и бис-NHS-PEG₄₅ (дорожки 4-6) при молярном соотношении бис-NHS-PEG:α-GAL 50:1 (дорожки 1, 4 и 7), 100:1 (дорожки 2, 5 и 8) и 200:1 (дорожки 3, 6 и 9), а также рН маркеры (М) и не введенную в реакцию полученную в растениях рекомбинантную α-GAL-I в качестве контроля (Std) (стрелками показаны значения рН для различных полос);

Фиг.9 представляет собой MALDI-TOF масс-спектр полученной в растениях рекомбинантной α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₄₅ (ось Х указывает значения m/z, также приведены m/z значения пиков);

Фиг.10 представляет собой MALDI-TOF масс-спектр полученной в растениях рекомбинантной α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₈ (ось Х указывает значения m/z, также приведены m/z значения пиков);

Фиг.11 представляет собой фотографию, показывающую субстрат α-GAL N-додеканоил-нитробензоксадиазол-церамид тригексозид (Gb3-NBD) и продукт реакции α-GAL лактозил церамид-нитробензоксадиазол (лактозил церамид-NBD), визуализируемые с помощью облучения УФ-светом (365 нм) после высокопроизводительной тонкослойной хроматографии после инкубации субстрата Gb3-NBD с полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₄₅ (левая дорожка), с Replagal® α-GAL (средняя дорожка) и без инкубации с α-GAL (правая дорожка);

Фиг.12А, 12В и 12С представляют собой графики, показывающие активность Fabrazyme® α-GAL, Replagal® α-GAL, полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, сшитой 6HC-NHS-PEG₅ (Фиг.12А), бис-NHS-PEG₈ (Фиг.12В) и бис-NHS-PEG₄₅ (Фиг.12С) при молярном соотношении бис-NHS-PEG:α-GAL 50:1 («1» на Фиг.12А, «7» на Фиг.12В и «4» на Фиг.12С), 100:1 («2» на Фиг.12А, «8» на Фиг.12В и «5» на Фиг.12С) и 200:1 («3» на Фиг.. 12А, «9» на Фиг.12В и «6» на Фиг.12С) в зависимости от времени инкубации при моделируемых условиях в лизосоме (цитрат-фосфатный буфер, рН 4,6, 37°C);

Фиг.13 представляет собой график, показывающий фармакокинетический профиль Replagal® α-GAL, полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₄₅, в плазме страдающих болезнью Фабри мышей; остаточная активность каждой α-GAL представлена в процентах от максимальной остаточной активности каждой α-GAL как функция от времени после введения α-Gal;

Фиг.14А и 14В представляют собой график (Фиг.14А), показывающий активность Replagal® α-GAL, полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I (prh-альфа-GAL-I) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₈ (prh-альфа-GAL-I-CL8) или бис-NHS-PEG₄₅ (prh-альфа-GAL-I-CL45) в селезенке страдающих болезнью Фабри мышей через 2 часа после инъекции α-GAL, и фотографию Вестерн-блоттинга (Фиг.14В), показывающего Replagal® α-GAL (дорожки 10-12 и 15), полученную в растениях рекомбинантную человеческую α-GAL-I (дорожки 7-9 и 13) и полученную в растениях рекомбинантную человеческую α-GAL-I, сшитую бис-NHS-PEG₈ (дорожки 4-6) или бис-NHS-PEG₄₅ (дорожки 1-3 и 14) в селезенке страдающих болезнью Фабри мышей после введения α-GAL (дорожки 1-12) или в качестве контроля 50 нг α-GAL (дорожки 13-15);

Фиг.15А и 15В представляют собой график (Фиг.15А), показывающий активность Replagal® α-GAL, полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I (prh-альфа-GAL-I) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₈ (prh-альфа-GAL-I-CL8) или бис-NHS-PEG₄₅ (prh-альфа-GAL-I-CL45) в печени страдающих болезнью Фабри мышей через 2 часа после инъекции α-GAL, и фотографию Вестерн-блоттинга (Фиг.15В), показывающего Replagal® α-GAL (дорожки 10-12 и 15), полученную в растениях рекомбинантную человеческую α-GAL-I (дорожки 7-9 и 13) и полученную в растениях рекомбинантную человеческую α-GAL-I, сшитую бис-NHS-PEG₈ (дорожки 4-6) или бис-NHS-PEG₄₅ (дорожки 1-3 и 14) в печени страдающих болезнью Фабри мышей после введения α-GAL (дорожки 1-12) или в качестве контроля 50 нг α-GAL (дорожки 13-15);

Фиг.16 представляет собой график, показывающий активность Replagal® α-GAL, полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I (prh-альфа-GAL-I) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₈ (prh-альфа-GAL-I-) или бис-NHS-PEG₄₅ (prh-альфа-GAL-I-CL45), в сердце страдающих болезнью Фабри мышей через 2 часа после введения α-GAL;

Фиг.17 представляет собой график, показывающий активность Replagal® α-GAL, полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I (prh-альфа-GAL-I) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₈ (prh-альфа-GAL-I-CL8) или бис-NHS-PEG₄₅ (prh-альфа-GLA-I-GL45), в почках страдающих болезнью Фабри мышей через 2 часа после введения α-GAL;

Фиг.18 представляет собой график, показывающий активность Replagal® α-GAL, полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I (prh-альфа-GAL-I) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₈ (prh-альфа-GAL-I-CL8) или бис-NHS-PEG₄₅ (prh-альфа-GAL-I-CL45), в селезенке страдающих болезнью Фабри мышей через 2 часа, 24 часа, 3 дня и 7 дней после введения α-GAL (эндогенная α-GAL дикого типа (WT) приведена в качестве контроля);

Фиг.19 представляет собой график, показывающий активность Replagal® α-GAL, полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I (prh-альфа-GAL-I) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₄₅ (prh-альфа-GAL-I-CL45), в печени страдающих болезнью Фабри мышей через 2 часа, 24 часа, 3 дня и 7 дней после введения α-GAL (эндогенная α-GAL дикого типа (WT) приведена в качестве контроля);

Фиг.20 представляет собой график, показывающий активность Replagal® α-GAL, полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I (prh-альфа-GAL-I) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₄₅ (prh-альфа-GAL-I-CL45), в сердце страдающих болезнью Фабри мышей через 2 часа, 24 часа, 3 дня и 7 дней после введения α-GAL (эндогенная α-GAL дикого типа (WT) приведена в качестве контроля);

Фиг.21 представляет собой график, показывающий активность Replagal® α-GAL, полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I (prh-альфа-GAL-I) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₄₅ (prh-альфа-GAL-I-CL45), в почках страдающих болезнью Фабри мышей через 2 часа, 24 часа, 3 дня и 7 дней после введения α-GAL (эндогенная α-GAL дикого типа (WT) приведена в качестве контроля);

Фиг.22 представляет собой фотографию SDS-PAGE геля, показывающего полученную в клетках млекопитающих рекомбинантную человеческую α-GAL Replagal® (левая дорожка) и полученную в клетках млекопитающих рекомбинантную человеческую α-GAL Replagal®, прореагировавшую с бис-NHS-PEG₄₅ (средняя дорожка), а также маркеры молекулярной массы (правая дорожка; молекулярные массы маркеров указаны в кДа);

Фиг.23 представляет собой фотографию геля после изоэлектрофокусирования, показывающего полученную в клетках млекопитающих рекомбинантную человеческую α-GAL Replagal® (левая дорожка) и полученную в клетках млекопитающих рекомбинантную человеческую α-GAL Replagal®, прореагировавшую с бис-NHS-PEG₄₅ (средняя дорожка), а также маркеры рН (правая дорожка);

Фиг.24А и 24В представляют собой MALDI-TOF масс-спектры полученной в клетках млекопитающих рекомбинантной человеческой α-GAL Replagal® (Фиг.24А) и полученной в клетках млекопитающих рекомбинантной человеческой α-GAL Replagal®, прореагировавшей с бис-NHS-PEG₄₅ (ось Х указывает значения m/z, также приведены m/z значения (в Да) пиков);

Фиг.25 представляет собой график Михаэлиса-Ментен, показывающий скорость (V) гидролиза п-нитрофенил-α-D-галактопиранозида (pNP-G) полученной в клетках млекопитающих рекомбинантной человеческой α-GAL Replagal® (Replagal) и полученной в клетках млекопитающих рекомбинантной человеческой α-GAL Replagal®, сшитой бис-NHS-PEG₄₅ (ReplagalCL45), как функцию от концентрации pNP-G;

Фиг.26А и 26В представляют собой графики, показывающие активность полученной в клетках млекопитающих рекомбинантной человеческой α-GAL Replagal® (Replagal) и полученной в клетках млекопитающих рекомбинантной человеческой α-GAL Replagal®, сшитой 6HC-NHS-PEG45 (Replagal-CL45), как функцию от времени инкубации в моделируемых лизосомальных условиях (цитрат-фосфатный буфер, рН 4,6, 37°C) (Фиг.26, А) или в плазме крови человека при 37°C (Фиг.26В);

Фиг.27A-27D представляют собой графики, показывающие активность α-GAL Replagal® (R) и α-GAL Replagal®, сшитой бис-NHS-PEG₄₅, (R-CL45) в селезенке (Фиг.27А), печени (Фиг.27В), сердце (Фиг.27С) и почках (Фиг.27D) страдающих болезнью Фабри мышей через 2 часа после введения α-GAL;

Фиг.28A-28D представляют собой графики, показывающие уровни Gb3 в сердце (Фиг.28А), почках (Фиг.28В), печени (Фиг.28С) и селезенке (Фиг.28D) страдающих болезнью Фабри мышей как функцию от времени после инъекции α-GAL Replagal® (R) или α-GAL Replagal®, сшитой бис-NHS-PEG₄₅ (R-CL45);

Фиг.29А и 29В представляют собой сканированное изображение SDS-PAGE геля, показывающего полученную в растениях рекомбинантную человеческую α-GAL-II (Фиг.29А и 29В, дорожка 2) и полученную в растениях рекомбинантную человеческую α-GAL-II, прореагировавшую с бис-NHS-PEG₂₁ (Фиг.29А, дорожка 3), бис-NHS-PEG₄₅ (Фиг.29А, дорожка 4) или бис-NHS-PEG₆₈ (Фиг.29В, дорожка 3), а также маркеры молекулярной массы (Фиг.29А и 29В, дорожка 1, молекулярные массы маркеров указаны в кДа);

Фиг.30А-30С представляют собой MALDI-TOF масс-спектры полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-II (Фиг.30А) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-II, сшитой бис-NHS-PEG₂₁ (Фиг.30А) или бис-NHS-PEG₄₅ (Фиг.30С) (ось абсцисс указывает значения m/z, указаны значения m/z (в Да) пиков);

Фиг.31A-31D представляют собой графики, показывающие активность полученной в клетках млекопитающих рекомбинантной человеческой α-GAL Replagal® (Replagal), полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-II (prh-альфа-GAL-II) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-II, сшитой бис-NHS-PEG₂₁ (prh-альфа-GAL-II-CL21; Фиг.31А и 31С), бис-NHS-PEG₄₅ (prh-альфа-GAL-II-CL45, Фиг.31A-31D) или бис-NHS-PEG₆₈ (prh-альфа-GAL-II-CL68, Фиг.31В и 31D), в зависимости от времени инкубации в моделируемых условиях в лизосоме (цитрат-фосфатный буфер, рН 4,6, 37°C) (Фиг.31А и 31В) или в плазме крови человека при 37°C (Фиг.31С и 31D) (данные, показанные на Фиг.31С и 31D, получены из разных экспериментов);

Фиг.32А и 32В представляют собой графики, показывающие фармакокинетические профили α-GAL Replagal® (Replagal), полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-II (prh-альфа-GAL-II) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-II, сшитой бис-NHS-PEG₄₅ (prh-альфа-GAL-II-CL45), в плазме страдающих болезнью Фабри мышей; концентрация каждой α-GAL представлена как функция от времени после инъекции α-GAL (Фиг.32А и 32В представляют те же данные в разные промежутки времени);

Фиг.33A-33L представляют собой графики, показывающие активность α-GAL Replagal® (Replagal), полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-II (prh-альфа-GAL-II) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-II, сшитой бис-NHS-PEG₄₅ (prh-альфа-GAL-II-CL45, Фиг.33A-33L) или бис-NHS-PEG₂₁ (prh-альфа-GAL-II-CL21; Фиг.33E-33L) в сердце (Фиг.33A, 33Е и 33I), почках (Фиг.33B, 33F и 33J), печени (Фиг.33C, 33G и 33K) и селезенке (Фиг.33D, 33H и 33L) страдающих болезнью Фабри мышей через 2 часа (Фиг.33A-33H), 7 дней (Фиг.33A-33D и 33I-33L), 14 дней (Фиг.33A-33D) и 28 дней (Фиг.33A-33D) после инъекции α-GAL;

Фиг.34А-34С представляют собой графики, показывающие кинетические параметры Vмакс (Фиг.34А), К_М (Фиг.34 В) и k_кат (Фиг.34С) для полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-II (prh-альфа-GAL-II) и полученной в растениях рекомбинантных человеческой α-GAL-II, сшитой бис-NHS-РЕ045 (prh-альфа-GAL-II-CL45) в зависимости от рН;

Фиг.35 представляет собой сканированное изображение SDS-PAGE геля, показывающего полученную в растениях рекомбинантную человеческую α-GAL-I (prh-α-Gal-I) и полученную в растениях рекомбинантную человеческую α-GAL-I, прореагировавшую с метокси-замещенным NHS-PEG, имеющим молекулярный вес 2 кДа (prh-α-Gal-I-PEG 2000), 5 кДа (prh-α-Gal-I-PEG 5000) и 10 кДа (prh-α-Gal-I-PEG 10000), а также маркеры молекулярной массы (левая дорожка; молекулярные массы маркеров указаны в кДа);

Фиг.36А и 36В представляют собой графики, показывающие активность полученной в клетках млекопитающих рекомбинантной человеческой α-GAL Fabrazyme® (Fabrazyme), полученной в клетках млекопитающих рекомбинантной человеческой α-GAL Replagal® (Replagal), полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, прореагировавшей с метокси-замещенным NHS-PEG, имеющим молекулярный вес 2 кДа (α-Gal-I-PEG 2000), 5 кДа (α-Gal-I-PEG 5000) и 10 кДа (α-Gal-I-PEG 10000), в зависимости от времени инкубации при моделировании лизосомальных условий (цитрат-фосфатный буфер, рН 4,6, 37°C) (Фиг.36А) или в плазме крови человека при 37°C (Фиг.36В);

Фиг.37 представляет собой сканированное изображение SDS-PAGE геля, показывающего полученную в растениях рекомбинантную α-GAL-I, прореагировавшую с бис-NHS-PEG₂ (дорожки 1-3), бис-NHS-PEG₄ (дорожки 4-6), бис-NHS-PEG₆₈ (дорожки 7-9), бис-NHS-PEG₁₅₀ (дорожки 10-12) и бис-NHS-PEG₄₅ (CL45) при молярном соотношении бис-NHS-PEG:α-GAL 50:1 (дорожки 1, 4, 7 и 10), 100:1 (дорожки 2, 5, 8 и 11) и 200:1 (дорожки 3, 6, 9 и 12), а также маркеры молекулярной массы (MW);

Фиг.38 представляет собой сканированное изображение SDS-PAGE геля, показывающего полученную в растениях рекомбинантную α-GAL-I, прореагировавшую с бис-COOH-PEG₁₂ (дорожки 1-3), бис-COOH-PEG₂₈ (дорожки 4-6), бис-COOH-PEG₄₅ (дорожки 7-9) и бис-NHS-PEG₄₅ (CL45) при молярном соотношении бис-NHS-PEG:α-GAL 50:1 (дорожки 1, 4 и 7), 100:1 (дорожки 2, 5 и 8) и 200:1 (дорожки 3, 6 и 9), а также маркеры молекулярной массы (MW) и несшитую полученную в растениях рекомбинантную α-GAL-I в качестве контроля (con);

Фиг.39 представляет собой график, показывающий активность α-GAL Repla gal®, полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I (prh-α-GAL-I) и полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-I, сшитой бис-NHS-PEG₄₅ (prh-α-GAL-I-CL45), бис-NHS-PEG₄ (prh-α-GAL-I-CL4), бис-NHS-PEG₂ (prh-α-GAL-I-CL2), бис-COOH-PEG₄₅ (prh-α-GAL-I-CLA45), бис-COOH-PEG₂₈ (prh-α-GAL-I-CLA28) или бис-COOH-PEG₁₂ (prh-α-GAL-I-CLA12) как функцию времени инкубации при моделировании лизосомальных условий (цитрат-фосфатный буфер, рН 4,6, 37°C);

Фиг.40А и 40В представляют собой графики, показывающие активность полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-II, сшитой бис-NHS-PEG₄₅, в зависимости от времени инкубации при моделировании лизосомальных условий (цитрат-фосфатный буфер, рН 4,6, 37°C) (Фиг.40А) или в плазме крови человека при 37°C (Фиг.40B) (Фиг.40В показывает активность Replagal®, полученной в клетках млекопитающих рекомбинантной α-GAL и не сшитой полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-II для сравнения);

Фиг.41 представляет собой сканированное изображение SDS-PAGE геля, показывающего полученную в растениях рекомбинантную α-GAL-II из 3 различных партий (дорожки 1-3) и полученную в растениях рекомбинантную α-GAL-II, прореагировавшую с бис-NHS-PEG₄₅, из 5 различных партий (дорожки 4-8), а также маркеры молекулярной массы (MW);

Фиг.42 представляет собой сканированное изображение геля после изоэлектрофокусирования, показывающего полученную в растениях рекомбинантную α-GAL-II из 3 различных партий (дорожки 1-3) и полученную в растениях рекомбинантную α-GAL-II, прореагировавшую с бис-NHS-PEG₄₅, из 5 различных партий (дорожки 4-8), а также рН маркеры (М);

Фиг.43A-43F представляют собой MALDI-TOF масс-спектры полученной в растениях рекомбинантной человеческой α-GAL-II (Фиг.43А) и полученной в растениях человеческой α-GAL-II, сшитой бис-NHS-PEG₄₅, из 5 различных партий (Фиг.43B-43F, соответственно) (ось абсцисс указывает значения m/z, указаны значения m/z (в Да) пиков), и

Фиг.44 представляет собой график, показывающий скорость катализа (V) α-GAL, проявляемой полученной в растениях человеческой α-GAL-II, сшитой бис-NHS-PEG₄₅, из 5 различных партий, в зависимости от концентрации субстрата (п-нитрофенил-α-D-галактопиранозида).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, в некоторых его вариантах, относится к новым мультимерным белковым структурам, включая, но не ограничиваясь мультимерными белковым структурам α-галактозидазы, и их применению для лечения болезни Фабри. До подробного описания, по меньш

Стабилизированная альфа-галактозидаза и ее применение

Патент 2604795