Рекомбинантный микроорганизм, обладающий повышенной способностью продуцировать путресцин, и способ получения путресцина с применением этого микроорганизма

Рекомбинантный микроорганизм, обладающий повышенной способностью продуцировать путресцин, и способ получения путресцина с применением этого микроорганизма

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным микроорганизмам, обладающим повышенной способностью продуцировать путресцин, полученной за счет модификации этих микроорганизмов путем ослабления способности разлагать путресцин, и способу получения путресцина с применением этих микроорганизмов.

Предшествующий уровень техники

Путресцин (или 1,4-бутандиамин) представляет собой полиамин, такой как спермидин и спермин, и обнаружен у грамотрицательных бактерий и грибов. Поскольку путресцин находится в широком диапазоне концентраций у различных видов, ожидается, что он играет важную роль в метаболизме микроорганизмов. Путресцин производят, главным образом, посредством химического синтеза с помощью акрилонитрила и сукцинонитрила из пропилена. В химическом синтезе в качестве исходных веществ используют вещества, полученные из нефтехимических продуктов, а также используют токсические химикаты, что неблагоприятно сказывается на окружающей среде и связано с проблемой истощения запасов нефти.

Для решения этих проблем проводится множество исследований по разработке способа биосинтеза путресцина с использованием микроорганизмов, который будет более экологически безопасным и снизит энергозатраты. Согласно имеющимся данным путресцин может быть получен с помощью биосинтеза из микроорганизмов посредством двух путей. По одному пути из глутамата вырабатывается орнитин, а орнитин декарбоксилируется с получением путресцина. По другому пути из орнитина синтезируется аргинин, из аргинина вырабатывается агматин, а затем из агматина синтезируется путресцин. Кроме этого, существуют другие способы синтеза путресцина, при которых в целевом микроорганизме преобразуют известные ферменты, вовлеченные в пути синтеза путресцина. Например, в WO 09/125924 раскрыт способ получения путресцина с высоким выходом посредством инактивации пути, связанного с разложением и утилизацией путресцина, имеющегося у Е. coli, посредством инактивации пути, в котором орнитин, предшественник путресцина, превращается в аргинин, и посредством усиления пути биосинтеза орнитина. В статье, опубликованной в 2009 году, раскрыт способ получения путресцина в высокой концентрации посредством введения белка, который превращает орнитин в путресцин, в штаммы Corynebacterium, которые не способны продуцировать путресцин, и посредством усиления его активности (Qian et al., Biotechnol Bioeng, 104:4, 651-662, 2009).

Вырабатываемый путресцин может разлагаться микроорганизмами или использоваться в других путях метаболизма. Например, спермидинсинтаза (КФ (код фермента): 2.5.1.16, speE), которая экспрессируется в Е. coli и Corynebacterium glutamicum, катализирует синтез спермидина из путресцина, а ацетилтрансфераза (N-ацетилтрансфераза), которая экспрессируется в Candida boidinii, ацетилирует путресцин до N-ацетилпутресцина. Известно, что путресцин может вырабатываться в высокой концентрации штаммом Е. coli, модифицированным с целью ослабления активности спермидин-ацетилтрансферазы (КФ: 2.3.1.57, speG), которая проявляет высокую степень гомологии с вышеупомянутой ацетилтрансферазой (патент Кореи №1188432).

Хотя фермент, который ацетилирует путресцин до N-ацетилпутресцина в микроорганизме рода Corynebacterium, еще не идентифицирован, известно, что когда ген, известный как кодирующий белок NCgl1469, представляющий собой гистонацетилтрансферазу НРА2 и ассоциированную ацетилтрансферазу, удален, N-ацетилирование кадаверина, разновидности диамина, специфически снижено (Kind et al., Appl Environ Microbiol, 76:15, 5175-5180, 2010). Однако, сообщалось, что NCgl1469 не использует путресцин и 1,3-диаминопропан в качестве субстрата. Другими словами, NCgl1469, как предполагали, обладает специфической активностью только в отношении кадаверина среди всех других диаминов. С другой стороны, известно, что у Corynebacterium glutamicum NCgl1469 проявляет активность ацетилглутаматсинтазы и орнитинацетилтрансферазы, продуцируя орнитин и аргинин в высокой концентрации, и когда у Corynebacterium glutamicum сверхэкспрессирован NCgl1469, орнитин и аргинин могут быть получены с высоким выходом (патент Кореи №1174267). Также активность NCgl1469 является специфичной в отношении глутамата и кадаверина, и известно воздействие NCgl1469 на увеличение выработки орнитина, но пока еще не установлено, связан ли NCgl1469 с выработкой путресцина.

Раскрытие сущности изобретения

Техническая проблема

Авторы настоящего изобретения установили, что путресцин может быть получен с высоким выходом посредством ослабления активности NCgl1469 в микроорганизме рода Corynebacterium, модифицированном для получения путресцина, осуществляя, таким образом, настоящее изобретение.

Техническое решение

Одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить модифицированный микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий повышенной способностью продуцировать путресцин посредством ослабления активности NCgl1469 по сравнению с его эндогенной активностью.

Другая задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ получения путресцина с высоким выходом с применением микроорганизм рода Corynebacterium.

Полезный эффект

В настоящем изобретении штамм Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать путресцин получают посредством ослабления активности NCgl1469 по сравнению с его эндогенной активностью и, применяя его, получают путресцин, который широко применяют в промышленности, и может продуцироваться в высокой концентрации.

Описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение, демонстрирующее путь биосинтеза путресцина у Corynebacterium glutamicum и родственных видов.

Лучший способ осуществления изобретения

Для выполнения вышеуказанных задач согласно настоящему изобретению предложен модифицированный микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий повышенной способностью продуцировать путресцин, где активность белка NCgl1469, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, ослаблена или исключена по сравнению с его эндогенной активностью.

Используемый здесь термин "белок NCgl1469" относится к белку, определяемому как гистонацетилтрансфераза НРА2 или ассоциированная ацетилтрансфераза у Corynebacterium glutamicum, который, как сообщается, без идентификации специфической функции, ацетилирует глутамат и кадаверин (патент Кореи №10-1174267, Hwang et al., J Ind Microbiol Biotechnol, 37:11, 1131-1136, 2010, Kind et al., Appl Environ Microbiol, 76:15, 5175-5180, 2010).

Белок NCgl1469 по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20. Однако, не ограничивается ими, поскольку может иметь место различие в аминокислотной последовательности белка, проявляющему вышеуказанную активность, в зависимости от видов или штаммов микроорганизмов. Другими словами, это может быть мутеин или искусственный вариант с аминокислотной последовательностью, содержащей замену, делецию, инсерцию или добавление одной или нескольких аминокислот в одном или более чем одном местоположении в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, поскольку это может помочь в повышении продуцирования путресцина посредством ослабления активности белка, как предложено в настоящем изобретении. В настоящем изобретении термин "несколько" может иметь различное значение в зависимости от локализации или типа аминокислотных остатков в трехмерной структуре белка, но конкретно означает от 2 до 20, предпочтительно от 2 до 10 и более предпочтительно от 2 до 5. Кроме того, замена, делеция, инсерция, добавление или инверсия аминокислоты также включает те, которые вызваны спонтанной мутацией или являются искусственным вариантом, если они основаны на различии в отдельном микроорганизме или в видах микроорганизма.

Белок NCgl1469, получаемый из Corynebacterium glutamicum АТСС13032, по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 18, а белок NCgl1469, получаемый из Corynebacterium glutamicum АТСС13869, обладающий 99%-ной гомологией с вышеуказанной аминокислотной последовательностью, имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 20.

Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность по настоящему изобретению, может содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок, при условии, что он обладает активностью, сходной с активностью белка NCgl1469 по настоящему изобретению, с 80%-ной или более, предпочтительно 90% или более, более предпочтительно 95%-ной или более и особенно предпочтительно 97%-ной или более гомологией с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, и наиболее предпочтительно полинуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 19, соответственно.

Термин "гомология" относится к идентичности между двумя аминокислотными последовательностями, и она может быть определена посредством способа, хорошо известного специалистам в данной области техники, при использовании компьютерной программы BLAST 2.0 для вычисления параметров, таких как вес выравнивания, идентичность и сходство.

Кроме того, полинуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может быть гибридизована с полинуклеотидом SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 19 или зондом, полученным из него в "жестких условиях", и может представлять собой вариант, кодирующий белок, который функционирует нормально. Использованный здесь термин "жесткие условия" относится к условиям, которые делают возможной специфическую гибридизацию между полинуклеотидами, и конкретно описаны, например в Molecular Cloning (А Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) или Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley и Sons, Inc., New York), в которых описана, например, гибридизация в гибридизационном буфере при температуре 65°C (3,5×SSC (раствор хлорида и цитрата натрия); 0,02% фиколл; 0,02% поливинилпирролидон; 0,02% бычий сывороточный альбумин; 2,5 мМ NaH₂PO₄ (pH 7); 0,5% SDS (додецилсульфат натрия); 2 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота)). SSC представляет собой смесь 0,15 M хлорид натрия/0,15 M цитрат натрия с pH 7. После гибридизации, мембрану, на которую нанесена ДНК, отмывают с помощью 2×SSC при комнатной температуре и затем отмывают 0,1-0,5×SSC/0,1×SDS при температуре 68°C.

В настоящем изобретении ослабление активности NCgl1469 означает, что активность NCgl1469 снижена или исключена по сравнению с его эндогенной активностью. Активность белка NCgl1469 может быть ослаблена путем: (1) частичной или полной делеции полинуклеотида, кодирующего белок, (2) снижения уровня экспрессии полинуклеотида посредством модификации регуляторной последовательности, (3) модификации полинуклеотидной последовательности на хромосоме для ослабления активности белка или 4) их комбинации.

В вышеуказанном способе частичная или полная делеция полинуклеотида, кодирующего белок, может быть проведена посредством замены полинуклеотида, кодирующего эндогенный целевой белок, в хромосоме на полинуклеотид с частичной делецией нуклеотидной последовательности или на маркерный ген с вектором для инсерции хромосомных генов. Длина "частичной" делеции варьируется в зависимости от типа полинуклеотида, но конкретно составляет от 2 п. о. (пар оснований) до 300 п. о., предпочтительно от 2 п. о. до 100 п. о. и более предпочтительно от 2 п. о. до 5 п. о.

Также, может быть проведено снижение уровня экспрессии полинуклеотида с помощью модификации последовательности, регулирующей экспрессию, посредством индукции мутаций в ней путем делеции, инсерции, консервативной или неконсервативной замены нуклеотидной последовательности или их комбинации с целью дополнительного ослабления активности последовательности, регулирующей экспрессию, или посредством ее замены на последовательность, обладающую более слабой активностью. Последовательность, регулирующая экспрессию, включает кодирующий последовательность промотор, операторную последовательность, сайт связывания рибосомы и последовательность, контролирующую терминацию транскрипции и трансляции.

Кроме того, может быть проведена модификация полинуклеотидной последовательности на хромосоме для ослабления активности белка посредством индукции мутаций в последовательности путем делеции, инсерции, консервативной или неконсервативной замены нуклеотидной последовательности или путем их комбинации с целью дополнительного ослабления активности последовательности или посредством замены полинуклеотидной последовательности на модифицированную последовательность для большего снижения активности белка.

В то же время микроорганизм рода Corynebacterium с повышенной способностью продуцировать путресцин по настоящему изобретению может быть дополнительно модифицирован для ослабления активности орнитинкарбамоилтрансферазы (ArgF), участвующей в синтезе аргинина из орнитина, и активности белка (NCgl1221), участвующего в секреции глутамата, по сравнению с его эндогенной активностью для накопления орнитина, предшественника путресцина, внутри клетки. Кроме того, микроорганизм рода Corynebacterium может быть модифицирован посредством дополнительного увеличения активности орнитиндекарбоксилазы (ODC). Также, микроорганизм рода Corynebacterium может быть дополнительно модифицирован для усиления активности ацетилглутаматсинтазы с целью превращения глутамата в ацетилглутамат, активности орнитинацетилтрансферазы (ArgJ) с целью превращения ацетилорнитина в орнитин, активности ацетилглутаматкиназы (ArgB) с целью превращения ацетилглутамата в ацетилглутамилфосфат, активности ацетил-гамма-глутамилфосфатредуктазы (ArgC) с целью превращения ацетилглутамилфосфата в ацетилглутамат-полуальдегид и активности ацетилорнитинаминотрансферазы (ArgD) с целью превращения ацетилглутамат-полуальдегида в ацетилорнитин, по сравнению с его эндогенными видами активности, что, таким образом, усиливает биосинтез орнитина, предшественника путресцина.

В этом случае, ArgF, NCgl1221, ODC, ArgC, ArgJ, ArgB и ArgD могут иметь аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, соответственно, или аминокислотные последовательности с 80%-ной или более, предпочтительно 90%-ной или более, более предпочтительно 95%-ной или более и наиболее предпочтительно 97%-ной или более гомологией с этими последовательностями, но не ограничиваются конкретно ими.

Используемый здесь термин "орнитиндекарбоксилаза (ODC)" относится к ферменту, который продуцирует путресцин при использовании орнитина, и для ODC в качестве кофермента требуется пиридоксальфосфат (пиридоксаль-5′-фосфат, PLP). ODC присутствует в большинстве грамотрицательных бактерий и может присутствовать в некоторых кишечных бактериях, таких как Lactobacillus, относящихся к грамположительным бактериям. Е. coli имеет два типа генов, кодирующих ODC, один из которых, speC, непрерывно экспрессируется в определенной концентрации, и другой, speF, экспрессия которого индуцируется в специфических условиях (присутствие орнитина в количестве выше определенных концентраций и низкий pH). В зависимости от вида, некоторые виды бактерий, такие как Е. coli, имеют два типа ODC, а другие имеют только один тип. Виды, такие как Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp. и Enterobacter sp., имеют два типа ODC (speC, speF), а штаммы Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp. имеют один тип ODC (speC). В случае молочнокислых бактерий, ODC экспрессируется в одном типе гена (speF), и, как известно, экспрессия индуцируется в условиях низкого pH или избытка орнитина и гистидина.

Активность ODC может быть введена в рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium по настоящему изобретению при использовании генов, кодирующих ODC, получаемых из различных видов.

Полинуклеотид, кодирующий ODC, может включать полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23 или аминокислотной последовательности с 70%-ной или более, предпочтительно 80%-ной или более, или более предпочтительно 90%-ной или более гомологией с этой последовательностью, но не ограничивается ими.

Также, увеличение активности орнитиндекарбоксилазы (ODC) в микроорганизмы может быть проведено посредством различных способов, хорошо известных в данной области техники, и, например, может быть использован способ инсерции полинуклеотида, состоящего из нуклеотидной последовательности, кодирующей ODC, в хромосому; способ введения полинуклеотида в микроорганизмы путем введения векторной системы; способ инсерции полинуклеотида, состоящего из нуклеотидной последовательности, кодирующей ODC, и промотора с повышенной активностью, или модификацией, в «вышележащем» участке нуклеотидной последовательности, кодирующей ODC; и способ инсерции полинуклеотида, в который внесена мутация нуклеотидной последовательности, кодирующей ODC, и более предпочтительно, если вводится нуклеотидная последовательность, кодирующая ODC, то в качестве промотора, контролирующего ее экспрессию, может быть использован известный промотор CJ7.

Кроме того, увеличение активности ArgC, ArgJ, ArgB и ArgD может быть достигнуто посредством: (1) увеличения числа копий полинуклеотида, кодирующего фермент, (2) модификации последовательности, регулирующей экспрессию, для повышения экспрессии полинуклеотида, (3) модификации полинуклеотидной последовательности на хромосоме для усиления активности фермента или 4) их комбинации.

В способе (1) увеличение числа копий полинуклеотида, кодирующего фермент, может быт достигнуто посредством функционального связывания полинуклеотида с вектором или посредством его инсерции в хромосому клетки-хозяина. Более конкретно, число копий полинуклеотида в клетке-хозяине может быть увеличено посредством введения вектора, способного независимо реплицироваться и функционировать, с которым функционально связан полинуклеотид, кодирующий фермент по настоящему изобретению, или посредством введения вектора, способного встраивать полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, с которым функционально связан полинуклеотид.

Используемый здесь термин "вектор" относится к конструкции ДНК, состоящей из нуклеотидной последовательности полинуклеотида, кодирующего целевой белок, функционально связанной с соответствующей регуляторной последовательностью, для экспрессии целевого белка в соответствующем организме-хозяине. Регуляторная последовательность включает промотор, который может инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность для кодирования соответствующего сайта связывания рибосомы на мРНК и последовательность для контроля терминации транскрипции и трансляции. Вектор может быть трансфицирован в подходящий организм-хозяин и затем может быть реплицирован или может функционировать независимо от генома организма-хозяина и может быть интегрирован в сам геном.

В настоящем изобретении любой вектор, который может быть реплицирован в организме-хозяине, может быть использован без какого-либо особого ограничения, при условии, что он известен в данной области техники. Примерами обычно используемых векторов являются плазмида, космида, вирус и бактериофаг в природном виде или рекомбинантном виде. Например, pWE15, М13, λMBL3, λMBL4, λΙΧΙΙ, λASHII, λΑΡΙΙ, λt10, λt11, Charon4A и Charon21A могут быть использованы в качестве фагового вектора или космидного вектора, а pBR система, pUC система, pBluescriptll система, pGEM система, pTZ система, pCL система и рЕТ система могут быть использованы в качестве плазмидного вектора. Вектор, который может быть использован в настоящем изобретении, ничем конкретно не ограничен, и поэтому могут быть использованы известные экспрессионные векторы. Предпочтительно могут быть использованы векторы pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCCIBAC. Наиболее предпочтительно могут быть использованы векторы pACYC177, pCL, pCCIBAC.

Также, вектор который может встраивать полинуклеотид, кодирующий целевой белок, путем его трансформирования в клетку-хозяина, может предпочтительно представлять собой, например шаттл-вектор, pECCG112 (публикация патента Кореи №1992-0000933), который способен реплицироваться самостоятельно как в Е. coli, так и в коринеформных бактериях, но не ограничивается этим.

Кроме того, полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в хромосоме может быть заменен новым полинуклеотидом при использовании вектора для хромосомной инсерции генов. Инсерция полинуклеотида в хромосому может быть достигнута посредством любого способа, известного в данной области техники, например посредством гомологичной рекомбинации. Так как вектор по настоящему изобретению может быть встроен в хромосому посредством индуцирования гомологичной рекомбинации, могут быть дополнительно включены маркеры отбора для подтверждения успешной инсерции гена в хромосому. Маркер отбора используется для скрининга клеток, трансформированных вектором, другими словами, для определения был ли встроен целевой нуклеотид. Могут быть использованы маркеры, которые могут придавать селектируемые фенотипы, такие как лекарственная устойчивость, ауксотрофия, устойчивость к токсическим агентам или экспрессия поверхностных белков. В среде, обрабатываемой селективным агентом, могут выживать только клетки, экспрессирующие маркер отбора, или будут появляться клетки с другим фенотипом, и, таким образом, с помощью этого способа могут быть отобраны удачно трансформированные клетки.

Используемый здесь термин "трансфекция" относится к введению вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина, так что белок, кодируемый полинуклеотидом, может быть экспрессирован. Трансфицируемый полинуклеотид включает все полинуклеотиды, которые кодируют целевые белки, которые могут быть экспрессированы в клетке-хозяине вне зависимости от локализации, встраивается ли он в хромосому клетки-хозяина или локализован вне ее. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующие целевой белок. Полинуклеотид может быть введен в любой форме при условии, что он сможет быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в виде экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, содержащую все необходимые элементы для самоэкспрессии. Экспрессионная кассета обычно включает промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может находиться в виде вектора экспрессии, способного к саморепликации. Кроме того, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в своем собственном виде и функционально связан с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине.

Используемый здесь термин "функционально связанный" относится к функциональному соединению между промоторной последовательностью, инициирующей или опосредующей транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок, и полинуклеотидом.

Также, в способе (2) модификация последовательности, регулирующей экспрессию, для повышения экспрессии полинуклеотида в настоящем изобретении может быть проведена посредством индукции мутации последовательности путем делеции, инсерции, консервативной или неконсервативной замены нуклеотидной последовательности или путем их комбинации, или посредством замены на нуклеотидную последовательность с повышенной активностью. Последовательность, регулирующая экспрессию, включает промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайты связывания рибосом, и последовательность, контролирующую терминацию транскрипции и трансляции.

С вышележащим участком единицы экспрессии полинуклеотида вместо исходных промоторов может быть связан сильный гетерологичный промотор, и примером сильного промотора служит промотор pcj7, промотор lysCPI, промотор EF-Tu, промотор groEL, промотор асеА или aceВ и так далее, и более предпочтительно промотор lysCPI или промотор pcj7, получаемый из Corynebacterium, функционально связанный для усиления экспрессии полинуклеотида, кодирующего фермент. Здесь, промотор lysCPI, который представляет собой промотор, усиленный за счет замены нуклеотидной последовательности промоторного участка полинуклеотида, кодирующего аспартаткиназу и аспартат-полуальдегид-дегидрогеназу, достаточно сильный, чтобы повысить активность соответствующего фермента в 5 раз по сравнению с диким типом посредством усиления экспрессии гена аспартаткиназы (публикация Международной заявки на патент №2009-096689). Кроме того, при поиске участка с сильной промоторной последовательностью у Corynebacterium ammoniagenes был идентифицирован промотор pcj7, который экспрессируется в Corynebacterium ammoniagenes и Escherichia и обладает сильной промоторной активностью, и может быть экспрессирован в Corynebacterium glutamicum также с высокой интенсивностью (патент Кореи №0620092).

Также, в способе (3) модификация полинуклеотидной последовательности на хромосоме, кодирующей фермент по настоящему изобретению, может быть проведена посредством индукции мутации последовательности путем делеции, инсерции, консервативной или неконсервативной замены нуклеотидной последовательности или путем их комбинации для повышения активности последовательности, или посредством замены на нуклеотидную последовательность с повышенной активностью.

Микроорганизм по настоящему изобретению, представляющий собой микроорганизм с повышенной способностью продуцировать путресцин, включает прокариотический микроорганизм, в котором экспрессируется белок с аминокислотной последовательностью, описанной в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, и может представлять собой, например микроорганизм Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp., Enterobacter sp., Yersinia sp., Klebsiella sp., Erwinia sp., Corynebacterium sp., Brevibacterium sp., Lactobacillus sp., Selenomonas sp.и Vibrio sp.

Микроорганизм по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой микроорганизм рода Corynebacterium и более предпочтительно может представлять собой Corynebacterium glutamicum.

В одном примере настоящего изобретения микроорганизм рода Corynebacterium с регистрационным номером KCCM11138Р (публикация патента Кореи №2012-0064046), обладающий способностью продуцировать путресцин в высокой концентрации по усиленному пути образования путресцина, был подвергнут мутации. Конкретно, продуцирующий путресцин штамм KCCM11138Р является сверхпродуцирующим путресцин штаммом, в котором ген, кодирующий орнитинкарбамоилтрансферазу (ArgF) для накопления орнитина, и ген, кодирующий экспортер глутамата (NCgl1221) для повышения уровня внутриклеточного глутамата, удалены из штаммов АТСС13032, и введен ген, кодирующий орнитиндекарбоксилазу (speC), и уровень экспрессии генов биосинтеза орнитина (argCJBD) повышен.

В другом примере настоящего изобретения полученный на основе Corynebacterium glutamicum АТСС13869 продуцирующий путресцин штамм DAB12-a на основе такого же генотипа как и KCCM11138Р был подвергнут мутации. Конкретно, продуцирующий путресцин штамм DAB12-a, содержащий штамм АТСС13869, полученный из Американской коллекции типовых культур (АТСС), представляет собой штамм, в котором ген, кодирующий орнитинкарбамоилтрансферазу (ArgF), и ген, кодирующий белок NCgl1221 для секреции глутамата, удалены, и введен ген (speC), кодирующий орнитиндекарбоксилазу (ODC), полученный из Е. coli, а промотор оперона гена биосинтеза орнитина, (argCJBD) заменен усиленным промотором.

В примере настоящего изобретения штамм Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать путресцин получают путем ослабления или полного подавления активности белка NCgl1469, описанного в SEQ ID NO: 18, в микроорганизме Corynebacterium glutamicum KCCM1138Р (публикация патента Кореи №2012-0064046) со способностью продуцировать путресцин в высокой концентрации посредством делеции argF и NCgl1221, введения speC и усиления argCJBD (см. фиг. 1).

Штамм, лишенный активности белка NCgl1469, был назван Corynebacterium glutamicum СС01-0163 и депонирован в Корейский центр культур микроорганизмов (Korean Culture Center of Microorganisms) (далее именуемый "KCCM") под номером KCCM11240Р 26 декабря 2011 года. В результате культивирования штамма было показано, что N-ацетилпутресцин не продуцируется, а продукция путресцина возрастает до уровня, сходного с уровнем непродуцируемого N-ацетилпутресцина, и, поэтому, NCgl1469 обладает активностью в отношении ацетилирования путресцина.

Кроме того, штамм Corynebacterium glutamicum DABI2-aΔNCgl1469, с повышенной способностью продуцировать путресцин получали путем полного подавления активности белка NCgl1469, описанного в SEQ ID NO: 20, в продуцирующем путресцин штамме DAB12-a, и в результате культивирования штамма было показано, что N-ацетилпутресцин не продуцируется, а продукция путресцина возрастает.

В то же время настоящее изобретение относится к способу получения путресцина, включающему культивирование микроорганизма рода Corynebacterium с повышенной способностью продуцировать путресцин, где активность белка NCgl1469, состоящего из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, ослаблена; и выделение путресцина из полученной культуры.

Способ культивирования по настоящему изобретению может включать соответствующую среду и условия культивирования, известные в данной области техники. Специалисты в данной области техники могут легко адаптировать и использовать способ культивирования в соответствии с отобранными штаммами. Пример способа культивирования включает применение периодической, непрерывной и полунепрерывной культур, но не ограничен ими. Используемая культуральная среда должна соответствующим образом удовлетворять потребности конкретного штамма.

Используемая культуральная среда должна соответствующим образом удовлетворять потребности конкретных штаммов. Известны культуральные среды для различных микроорганизмов (например, "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). В качестве источника углерода в среде могут быть использованы сахар и углеводы (например, глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, меласса, крахмал и целлюлоза), молочный жир и жир (например, соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло), жирные кислоты (например, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота), спирт (например, глицерин и этанол) и органическая кислота (например, уксусная кислота) и так далее. Эти вещества могут быть использованы отдельно или в виде смеси. В качестве источника азота могут быть использованы азотсодержащее органическое соединение (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, раствор кукурузного экстракта, мука из соевого шрота и мочевина) или неорганическое соединение (например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония), и эти вещества также могут быть использованы отдельно или в виде смеси. В качестве источника фосфора могут быть использованы дигидрофосфат калия, или двузамещенный фосфорнокислый калий, или соответствующая натрийсодержащая соль. Кроме того, культуральная среда может содержать соль металла (например, сульфат магния или сульфат железа), которая незаменима для роста, и, наконец, помимо вышеупомянутых веществ могут быть использованы незаменимые вещества, усиливающие рост, такие как аминокислоты и витамины. Также в культуральную среду может быть добавлен соответствующий предшественник. Питательное вещество может быть внесено в культуру единовременно или по мере исчерпания в течение культивирования.

pH культуры может быть скорректирован с помощью надлежащего применения основного соединения (например, гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислого соединения (например, фосфорной кислоты или серной кислоты). Пенообразование можно регулировать при использовании пеногасителя, такого как полигликолевый эфир жирной кислоты. Аэробные условия можно поддерживать с помощью пропускания кислорода или кислородсодержащих газовых смесей, например воздуха, через культуру. Температура культивирования обычно составляет от 20 до 45°C, предпочтительно от 25 до 40°C. Культивирование продолжается до тех пор, пока образование путресцина не достигает требуемого максимума. Этот уровень обычно достигается через 10-160 часов. Путресцин может выделяться в культуральную среду или содержаться в клетке.

Для сбора и накопления путресцина, синтезируемого в процессе культивирования по настоящему изобретению, целевое вещество может быть извлечено из культуральной среды с помощью соответствующего способа, известного в данной области техники, в зависимости от способа культивирования, например периодического, непрерывного или полунепрерывного способа культивирования.

Способ осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с учетом следующих примеров. Однако эти примеры приведены только с целью иллюстрации, и эти примеры не предназначены для ограничения изобретения.

Пример 1: штамм, с устраненной активностью NCgl1469

Пример 1-1: получение NCgl1469-делетированного штамма на основе продуцирующего путресцин штамма АТСС13032

Чтобы блокировать путь синтеза N-ацетилпутресцина из путресцина в клетке, мутантный штамм, в котором удален ген, кодирующий NCgl1469, получали на основе микроорганизма рода Corynebacterium, обладающего способностью продуцировать путресцин (KССМ11138Р(АТСС13032ΔargFΔNCgl1221P(CJ7)-argCJBDbioAD::P(CJ7)-speC(Ec)), раскрытого в заявке на патент авторов настоящего изобретения (публикация патента №2012-0064046), который получен посредством делеции эндогенного гена, кодирующего орнитинкарбамоилтрансферазу (ArgF), и эндогенного гена, кодирующего экспортер глутамата (NCgl1221), участвующего в секреции глутамата, посредством введения гена, кодирующего орнитиндекарбоксилазу (SpeC), полученного из дикого типа Е. coli W3110, в хромосому, и посредством замены промотора группы генов argCJBD, кодирующих фермент, участвующий в синтезе орнитина из глутамата, в штамме дикого типа Corynebacterium glutamicum АТСС13032.

Конкретно, NCgl1469-del-F1_BamHI и NCgl1469-del-R1_Sall получали в виде праймеров для получения гомологичного рекомбинантного фрагмента N-терминального домена NCgl1469, a NCgl1469-del-F2_Sall и NCgl1469-del-R2_Xbal получали в виде праймеров для получения гомологичного рекомбинантного фрагмента С-терминального домена NCgl1469, на основе нуклеотидной последовательности гена NCgl1469 штамма АТСС13032 (SEQ ID NO: 17) (таблица 1).

Для получения N-терминального фрагмента и С-терминального фрагмента гена NCgl1469, проводили ПЦР (полимеразную цепную реакцию) при использовании набора праймеров (NCgl1469-del-F1_BamHI и NCgl1469-del-R1_Sall, и NCgl1469-del-F2_Sall и NCgl1469-del-R2_Xbal) и хромосомы штамма АТСС13032 в качестве матрицы. Проводили 30 циклов реакции ПЦР в режиме: денатурация при 95°C в течение 30 секунд, отжиг при 53°C в течение 30 секунд и элонгация при 72°C в течение 30 секунд.

После разделения продуктов ПЦР путем электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле полосу ДНК требуемого размера выделяли и очищали. Затем ПЦР-продукт N-терминального домена и ПЦР-продукт С-терминального домена обрабатывали BamHI и Sall, и Sall и Xbal, соответственно, и затем клонировали в вектор pDZ, обработанный BamHI и Xbal. Полученная плазмида, которую использовали для делеции NCgl1469, была названа pDZ-NCgl1469(K/O).

Для создания штамма KCCM11138PΔNCgl1469 полученный ранее вектор pDZ-NCgl1469 (K/O) вводили в штамм KССМ11138Р посредством электропорации и высевали на чашку со средой BHIS (37 г/л сердечно-мозговой вытяжки, 91 г/л сорбита и 2% агара на 1 л), содержащей канамицин (25 мкг/мл).

Успешную вставку вектора в хромосому подтверждали, наблюдая голубой цвет на твердой среде, содержащей 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозид (X-gal). Штаммы с единичным кроссинговером культивировали при встряхивании в питательной среде (30°C, 8 часов), и каждый из них серийно разводили от 10^-4 до 10^-10 и высевали на чашки с твердой средой, содержащей X-gal. Несмотря на то, что большинство колоний проявлялось в виде голубых колоний, небольшая часть колоний проявлялась в виде белых колоний, и путем отбора белых колоний в итоге отбирали штаммы с делегированным геном NCgl1469 с помощью двойного кроссинговера. Успешный нокаут гена у штамма подтверждали с помощью ПЦР при использовании праймеров NCgl1469-del-F1_BamHI и NCgl1469-del-R2_Xbal. Штамм, установленный с помощью ПЦР, был назван KCCM11138PΔNCgl1469.

Пример 1-2: получение NCgl1469-делетированного штамма на основе продуцирующего путресцин штамма АТСС13869

При использовании того же способа, который применяли для получения продуцирующего путресцин штамма KССМ11138Р на основе Corynebacterium glutamicum АТСС13032, в данном примере получали другой продуцирующий путресцин штамм на основе Corynebacterium glutamicum АТСС13869 посредством делеции эндогенного гена, кодирующего орнитинкарбамоилтрансферазу (ArgF), и эндогенного гена, кодирующего экспорт