Способ получения антител с улучшенными свойствами

Способ получения антител с улучшенными свойствами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для получения гликозилированных белков (гликопротеинов) и, в частности, Fc-содержащих полипептидов, которые пригодны в качестве терапевтических средств для человека или животного.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Моноклональные антитела часто осуществляют свою терапевтическую полезность за счет двух событий связывания. Сначала вариабельный домен антитела связывается со специфическим белком на клетке-мишени, например, с CD20 на поверхности злокачественных клеток. Затем следует рекрутинг эффекторных клеток, таких как клетки - естественные киллеры (NK), которые связываются с константной областью (Fc) антитела и разрушают клетки, с которыми связано антитело. Этот процесс, известный как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), зависит от специфического N-гликозилирования по Asn297 в Fc-домене тяжелой цепи IgG1, Rothman et al., Mol. Immunol. 26: 1113-1123 (1989). Антитела, у которых отсутствует эта N-гликозилированная структура, по-прежнему связывают антиген, но не способны содействовать ADCC, очевидно, в результате сниженной аффинности в Fc-домене антитела к Fc-рецептору FcγRIIIa на поверхности NK-клеток.

Наличие N-гликозилирования играет роль не только в эффекторной функции антитела, конкретный состав N-связанного олигосахарида также является важным для конечного действия антитела. Отсутствие фукозы или наличие рассекающего N-ацетилглюкозамина положительно коррелирует с мощностью ADCC, Rothman (1989), Umana et al., Nat-Biotech. 17: 176-180 (1999), Shields et al., J. Biol Chem. 277: 26733-26740 (2002), и Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003). Существуют также свидетельства, что сиалирование в Fc-области положительно коррелирует с противовоспалительными свойствами внутривенного иммуноглобулина (IVIG). См., например, Kaneko et al., Science, 313: 670-673, 2006; Nimmerjahn и Ravetch., J. Exp. Med., 204: 11-15, 2007.

Учитывая полезность специфического N-гликозилирования для функции и активности антител, был бы желателен способ для изменения композиции N-связанных олигосахаридов и изменения эффекторной функции антител.

Дрожжи и другие хозяева-грибы являются важными продуцирующими платформами для создания рекомбинантных белков. Дрожжи являются эукариотами и, таким образом, имеют общие эволюционные процессы с высшими эукариотами, включая множество посттрансляционных модификаций, которые происходят на секреторном пути. Современные достижения в гликоинженерии привели к созданию клеточных линий дрожжевого штамма Pichia pastoris с генетически модифицированными путями гликозилирования, которые позволяют им проводить последовательность ферментативных реакций, воспроизводящих процесс гликозилирования у людей. См., например, патенты США №№ 7029872, 7326681 и 7449308, которые описывают способы продуцирования рекомбинантного гликопротеина в клетке-хозяине низших эукариот, которые по существу идентичны их человеческим аналогам. Человекоподобные сиалированные биантенные N-связанные гликаны комплексного типа, аналогичные тем, что вырабатываются в Pichia pastoris вышеуказанными способами, продемонстрировали полезность для производства терапевтических гликопротеинов. Таким образом, был бы желателен способ для дальнейшей модификации или улучшения производства антител в дрожжах, таких как Pichia pastoris.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к Fc-содержащему полипептиду, который содержит мутации в аминокислотных положениях 243 и 264 Fc-области, где мутации в положении 243 выбраны из группы, состоящей из F243A, F243G, F243S, F243T, F243V, F243L, F243I, F243D, F243Y, F243E, F243R, F243W и F243K, и мутации в положении 264 выбраны из группы, состоящей из V264A, V264G, V264S, V264T, V264D, V264E, V264K, V264W, V264H, V264P, V264N, V264Q и V264L, где нумерация приведена согласно индексу EU по Kabat. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243A и V264A. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243Y и V264G. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243T и V264G. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243L и V264A. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243L и V264N. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243V и V264G. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению представляет собой антитело или фрагмент антитела. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:18. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:19. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению представляет собой фрагмент антитела, состоящий (или состоящий в основном) из SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:19.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой антитело, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи из SEQ ID NO:9 или ее вариант и аминокислотную последовательность легкой цепи из SEQ ID NO:2 или ее вариант. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой антитело, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи из SEQ ID NO:9 минус последний остаток лизина (K), записанный в SEQ ID NO:9.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой антитело, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи из SEQ ID NO:12 или ее вариант и аминокислотную последовательность легкой цепи из SEQ ID NO:11 или ее вариант.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой антитело, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи из SEQ ID NO:15 или ее вариант и аминокислотную последовательность легкой цепи из SEQ ID NO:14 или ее вариант.

В некоторых вариантах осуществления Fc-содержащие полипептиды по изобретению включают в себя N-гликаны, содержащие сиаловую кислоту (включая NANA, NGNA и их аналоги и производные). В одном из вариантов осуществления Fc-содержащие полипептиды по изобретению содержат смесь α-2,3- и α-2,6-связанных сиаловых кислот. В другом варианте осуществления Fc-содержащие полипептиды по изобретению содержат только α-2,6-связанную сиаловую кислоту. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащие полипептиды по изобретению содержат α-2,6-связанную сиаловую кислоту и не содержат детектируемого количества α-2,3-связанной сиаловой кислоты. В одном из вариантов осуществления сиаловая кислота представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту (NANA) или N-гликолилнейраминовую кислоту (NGNA) или их смесь. В другом варианте осуществления сиаловая кислота представляет собой аналог или производное NANA или NGNA с ацетилированием в положении 9 на сиаловой кислоте. В одном из вариантов осуществления N-гликаны на Fc-содержащих полипептидах по изобретению содержат NANA и не содержат NGNA.

N-гликаны на Fc-содержащих полипептидах по изобретению могут необязательно содержать фукозу. В одном из вариантов осуществления N-гликаны на Fc-содержащих полипептидах содержат смесь фукозилированных и нефукозилированных N-гликанов. В другом варианте осуществления N-гликаны на Fc-содержащих полипептидах не содержат фукозу.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению обладает одним или несколькими следующими свойствами по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом: (i) сниженная эффекторная функция; (ii) повышенные противовоспалительные свойства; (iii) повышенное сиалирование; (iv) повышенная биодоступность (абсорбция или экспозиция), и (v) сниженное связывание с FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb и FcγRIIIa (FcγRIIIa-V158 или FcγRIIIa-F158), и FcγRIIIb. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению обладает, по меньшей мере, 7, 10, 15, 30, 50, 100, 500 или 1000-кратным снижением эффекторной функции по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления эффекторная функция представляет собой ADCC. В другом варианте осуществления эффекторная функция представляет собой CDC.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению обладает сниженной активностью ADCC по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид обладает, по меньшей мере, 7, 10, 15, 30, 50, 100, 500 или 1000-кратным снижением активности ADCC. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид обладает, по меньшей мере, 100-кратным снижением активности ADCC. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид обладает, по меньшей мере, 500-кратным снижением активности ADCC. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид обладает, по меньшей мере, 1000-кратным снижением активности ADCC.

В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению обладает сниженной активностью CDC по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном варианте осуществления Fc-содержащий полипептид обладает, по меньшей мере, 100-кратным снижением активности CDC.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению связывается с FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa (FcγRIIIa-V158 или FcγRIIIa-F158) и FcγRIIIb со сниженной аффинностью по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению связывается с FcγRIIa, по меньшей мере, с 50-кратным снижением аффинности по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению связывается с FcγRIIb, по меньшей мере, с 20-кратным снижением аффинности по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению связывается с FcγRIIIa LF, по меньшей мере, с 10-кратным снижением аффинности по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению связывается с FcγRIIIa LV, по меньшей мере, с 1, 2 или 10-кратным снижением аффинности по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению связывается с FcγRIIb, FcγRIIIa LF и FcγRIIIa LV со сниженной аффинностью по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению обладает повышенными противовоспалительными свойствами по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению обладает повышенной биодоступностью (абсорбцией или экспозицией) при введении парентерально по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению обладает повышенной биодоступностью (абсорбцией или экспозицией) при введении подкожно по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом.

В одном из вариантов осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит нативную Fc-область. В другом варианте осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит мутацию F243A. В другом варианте осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит мутацию V264A.

Изобретение также относится к способу для получения Fc-содержащего полипептида в клетке-хозяине, включающему: (i) создание клетки-хозяина с помощью генетической инженерии для выработки Fc-содержащего полипептида, где клетка-хозяин содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую мутации в аминокислотных положениях 243 и 264 Fc-области, где мутации в положении 243 выбраны из группы, состоящей из: F243A, F243G, F243S, F243T, F243V, F243L, F243I, F243D, F243Y, F243E, F243R, F243W и F243K и мутации в положении 264 выбраны из группы, состоящей из: V264A, V264G, V264S, V264T, V264D, V264E, V264K, V264W, V264H, V264P, V264N, V264Q и V264L, где нумерация приведена согласно индексу EU по Kabat; (ii) культивирование клетки-хозяина в условиях, приводящих к экспрессии Fc-содержащего полипептида; и (iii) выделение Fc-содержащего полипептида из клетки-хозяина. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243A и V264A. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243Y и V264G. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации 243T и V264G. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243L и V264A. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243L и V264N. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243V и V264G. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению представляет собой антитело или фрагмент антитела. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:18. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:19. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, состоящий (или состоящий по существу) из SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:19.

В одном из вариантов осуществления способ получения Fc-содержащего полипептида осуществляют в клетке млекопитающего. В другом варианте осуществления способ получения Fc-содержащего полипептида осуществляют в растительной клетке. В другом варианте осуществления способ получения Fc-содержащего полипептида осуществляют в бактериях. В другом варианте осуществления способ получения Fc-содержащего полипептида осуществляют в клетке насекомого. В другом варианте осуществления способ получения Fc-содержащего полипептида осуществляют в клетке низших эукариот. В другом варианте осуществления способ получения Fc-содержащего полипептида осуществляют в дрожжевой клетке. В одном из вариантов осуществления способ получения Fc-содержащего полипептида осуществляют в Pichia pastoris.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид, полученный способом по изобретению, включает N-гликаны, содержащие сиаловую кислоту (включая NANA, NGNA, и их аналоги и производные). В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид, полученный способом по изобретению, содержит N-гликановую композицию, в которой, по меньшей мере, 40 моль%, 70 моль% или 90 моль% N-гликанов на Fc-содержащем полипептиде сиалированы (имеют структуру, выбранную из SA(_1-4)Gal(_1-4)GlcNAc(_2-4)Man₃GlcNAc₂ или SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂). В одном из вариантов осуществления, по меньшей мере, 47 моль% N-гликанов на антителах имеют структуру SA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂. В другом варианте осуществления, по меньшей мере, 47 моль% N-гликанов на антителах имеют структуру NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂. В другом варианте осуществления, по меньшей мере, 66 моль% N-гликанов на антителах имеют структуру SA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂. В другом варианте осуществления, по меньшей мере, 66 моль% N-гликанов на антителах имеют структуру NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащие полипептиды, полученные способом по изобретению, содержат смесь α-2,3- и α-2,6-связанных сиаловых кислот. В другом варианте осуществления Fc-содержащие полипептиды по изобретению содержат только α-2,6-связанную сиаловую кислоту. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащие полипептиды по изобретению содержат α-2,6-связанную сиаловую кислоту и не содержат детектируемого количества α-2,3-связанной сиаловой кислоты. В одном из вариантов осуществления сиаловая кислота представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту (NANA) или N-гликолилнейраминовую кислоту (NGNA) или их смесь. В другом варианте осуществления сиаловая кислота представляет собой аналог или производное NANA или NGNA с ацетилированием в положении 9 на сиаловой кислоте. В одном из вариантов осуществления N-гликаны на Fc-содержащих полипептидах, полученных способом по изобретению, содержат NANA и не содержат NGNA.

N-гликаны на Fc-содержащих полипептидах, полученных способом по изобретению, могут необязательно содержать фукозу. В одном из вариантов осуществления N-гликаны на Fc-содержащих полипептидах, полученных способом по изобретению, содержат смесь фукозилированных и нефукозилированных N-гликанов. В одном из вариантов осуществления N-гликаны на Fc-содержащих полипептидах, полученных способом по изобретению, не содержат фукозу.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид, полученный способом по изобретению, содержит N-гликановую композицию, в которой общее количество и процентное содержание сиалированных N-гликанов повышено относительно родительского Fc-содержащего полипептида.

В некоторых вариантах осуществления Fc-содержащий полипептид, полученный способом по изобретению, обладает одним или несколькими следующими свойствами по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом: (i) сниженная эффекторная функция; (ii) повышенные противовоспалительные свойства; (iii) повышенное сиалирование; (iv) повышенная биодоступность (абсорбция или экспозиция), и (v) сниженное связывание с FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb и FcγRIIIa. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению обладает, по меньшей мере, 7, 10, 15, 30, 50, 100, 500 или 1000-кратным снижением эффекторной функции по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления эффекторная функция представляет собой ADCC. В другом варианте осуществления эффекторная функция представляет собой CDC.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид, полученный способом по изобретению, обладает сниженной активностью ADCC по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид обладает, по меньшей мере, 7, 10, 15, 30, 50, 100, 500 или 1000-кратным снижением активности ADCC. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид обладает, по меньшей мере, 100-кратным снижением активности ADCC. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид обладает, по меньшей мере, 500-кратным снижением активности ADCC. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид обладает, по меньшей мере, 1000-кратным снижением активности ADCC.

В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид, полученный способом по изобретению, обладает сниженной активностью CDC по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид обладает, по меньшей мере, 100-кратным снижением активности CDC.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид, полученный способом по изобретению, связывается с FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa (FcγRIIIa-V158 или FcγRIIIa-F158) и FcγRIIIb со сниженной аффинностью по сравнению родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению связывается с FcγRIIa, по меньшей мере, с 50-кратным снижением аффинности по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению связывается с FcγRIIb, по меньшей мере, с 20-кратным снижением аффинности по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению связывается с FcγRIIIa LF, по меньшей мере, с 10-кратным снижением аффинности по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению связывается с FcγRIIIa LV по меньшей мере, с 1, 2 или 10-кратным снижением аффинности по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению связывается с FcγRIIb, FcγRIIIa LF и FcγRIIIa LV, со сниженной аффинностью по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид, полученный способом по изобретению, обладает повышенными противовоспалительными свойствами по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом.

В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид, полученный способом по изобретению, обладает повышенной биодоступностью (абсорбцией или экспозицией) при введении парентерально по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид, полученный способом по изобретению, обладает повышенной биодоступностью (абсорбцией или экспозицией) при введении подкожно по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом.

В одном из вариантов осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит нативную Fc-область. В другом варианте осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит мутацию F243A. В другом варианте осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит мутацию V264A.

Изобретение также относится к способу снижения эффекторной функции Fc-содержащего полипептида, включающему введение мутаций в положениях 243 и 264 родительского Fc-содержащего полипептида, где указанный Fc-содержащий полипептид имеет сниженную эффекторную функцию по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом, где нумерация приведена согласно индексу EU по Kabat. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243A и V264A. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243Y и V264G. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации 243T и V264G. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243L и V264A. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243L и V264N. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243V и V264G. В одном из вариантов осуществления эффекторная функция представляет собой ADCC. В другом варианте осуществления эффекторная функция представляет собой CDC. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению представляет собой антитело или фрагмент антитела. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:18. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:19. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, состоящий (или состоящий по существу) из SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:19. В одном из вариантов осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит нативную Fc-область. В другом варианте осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит мутацию F243A. В другом варианте осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит мутацию V264A.

Изобретение также относится к способу усиления противовоспалительных свойств Fc-содержащего полипептида, включающему введение мутации в положении 243 и мутации в положении 264 родительского Fc-содержащего полипептида, где нумерация приведена согласно индексу EU по Kabat, где указанный Fc-содержащий полипептид обладает повышенной противовоспалительной активностью по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243A и V264A. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243Y и V264G. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации 243T и V264G. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243L и V264A. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243L и V264N. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243V и V264G. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению представляет собой антитело или фрагмент антитела. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23R, IL-25, IL-27, IL-33, CD2, CD4, CD11A, CD14, CD18, CD19, CD23, CD25, CD40, CD40L, CD20, CD52, CD64, CD80, CD147, CD200, CD200R, TSLP, TSLPR, PD-1, PDL1, CTLA4, VLA-4, VEGF, PCSK9, α4β7-интегрина, E-селектина, фактора II, ICAM-3, бета2-интегрина, IFNγ, C5, CBL, LCAT, CR3, MDL-1, GITR, ADDL, CGRP, TRKA, IGF1R, RANKL, GTC или рецептора для любой из вышеперечисленных молекул. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид связывается с TNF-α. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид связывается с Her2. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид связывается с PCSK9. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:18. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:19. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению представляет собой фрагмент антитела, состоящий (или состоящий по существу) из SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:19. В одном из вариантов осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит нативную Fc-область. В другом варианте осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит мутацию F243A. В другом варианте осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит мутацию V264A.

Изобретение также относится к способу усиления противовоспалительных свойств Fc-содержащего полипептида, включающему выбор родительского Fc-содержащего полипептида, который подходит для лечения воспаления (например, антитела или иммуноадгезина, которые связываются с антигеном, вовлеченным в воспаление) и введение мутаций в положениях 243 или 264 в Fc-области, где нумерация приведена согласно индексу EU по Kabat, где Fc-содержащий полипептид обладает повышенной противовоспалительной активностью по сравнению с родительским Fc-содержащим полипептидом. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243A и V264A. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243Y и V264G. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации 243T и V264G. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243L и V264A. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243L и V264N. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243V и V264G. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид по изобретению представляет собой антитело или фрагмент антитела. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23R, IL-25, IL-27, IL-33, CD2, CD4, CD11A, CD14, CD18, CD19, CD23, CD25, CD40, CD40L, CD20, CD52, CD64, CD80, CD147, CD200, CD200R, TSLP, TSLPR, PD-1, PDL1, CTLA4, VLA-4, VEGF, PCSK9, α4β7-интегрина, E-селектина, фактора II, ICAM-3, бета2-интегрина, IFNγ, C5, CBL, LCAT, CR3, MDL-1, GITR, ADDL, CGRP, TRKA, IGF1R, RANKL, GTC или рецептора для любой из вышеперечисленных молекул. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид связывается с TNF-α. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид связывается с Her2. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид связывается с PCSK9. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:18. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:19. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, состоящий (или состоящий по существу) из SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:19. В одном из вариантов осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит нативную Fc-область. В другом варианте осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит мутацию F243A. В другом варианте осуществления родительский Fc-содержащий полипептид содержит мутацию V264A.

Изобретение также относится к способу лечения воспалительного состояния у нуждающегося в этом индивидуума, включающему введение индивидууму терапевтически эффективного количества Fc-содержащего полипептида, включающего мутации в положениях 243 и 264, где нумерация приведена согласно индексу EU по Kabat. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид снижает экспрессию гена, выбранного из группы, состоящей из IL-Ιβ, IL-6, RANKL, TRAP, ATP6v0d2, MDL-1, DAP12, CD11b, TIMP-1, MMP9, CTSK, PU-1, MCP1, MIP1α, Cxcl1-Groa, Cxcl2-Grob, CD18, TNF, FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII и FcγRIV. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид содержит мутации F243A и V264A. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243Y и V264G. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации 243 и V264G. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243L и V264A. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243L и V264N. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации F243V и V264G. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид вводят парентерально. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид вводят подкожно. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые подходят для лечения воспалительного состояния. В одном из вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с антигеном, выбранным из группы, состоящей из TNF-α, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-23R, IL-25, IL-27, IL-33, CD2, CD4, CD11A, CD14, CD18, CD19, CD23, CD25, CD40, CD40L, CD20, CD52, CD64, CD80, CD147, CD200, CD200R, TSLP, TSLPR, PD-1, PDL1, CTLA4, VLA-4, VEGF, PCSK9, α4β7-интегрина, E-селектина, фактора II, ICAM-3, бета2-интегрина, IFNγ, C5, CBL, LCAT, CR3, MDL-1, GITR, ADDL, CGRP, TRKA, IGF1R, RANKL, GTC или рецептора для любой из вышеперечисленных молекул. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид связывается с TNF-α. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид связывается с Her2. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид связывается с PCSK9. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:18. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:19. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, состоящий (или состоящий по существу) из SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:19.

Другое изобретение, описываемое в настоящем документе, относится к фармацевтической композиции, которая включает Fc-содержащий полипептид, где, по меньшей мере, 70% N-гликанов на Fc-содержащем полипептиде включают олигосахаридную структуру, выбранную из группы, состоящей из SA(_1-4)Gal(_1-4)GlcNAc(_2-4)Man₃GlcNAc₂ и SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂, где Fc-содержащий полипептид содержит мутации в аминокислотных положениях 243 и 264 в Fc-области, где нумерация приведена согласно индексу EU по Kabat. В одном из вариантов осуществления мутации представляют собой F243A и V264A. В другом варианте осуществления мутации представляют собой F243Y и V264G. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации 243T и V264G. В другом варианте осуществления мутации представляют собой F243L и V264A. В другом варианте осуществления мутации представляют собой F243L и V264N. В другом варианте осуществления мутации представляют собой F243V и V264G. В одном из вариантов осуществления, по меньшей мере, 47 моль% N-гликанов имеют структуру SA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂. В другом варианте осуществления, по меньшей мере, 47 моль% N-гликанов имеют структуру NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂. В одном из вариантов осуществления сиалированные N-гликаны содержат смесь α-2,3- и α-2,6-связанных сиаловых кислот. В другом варианте осуществления сиалированные N-гликаны содержат только α-2,6-связанную сиаловую кислоту. В одном из вариантов осуществления сиалированные N-гликаны содержат α-2,6-связанную сиаловую кислоту и не содержат детектируемого количества α-2,3-связанной сиаловой кислоты. В одном из вариантов осуществления сиаловая кислота представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту (NANA) или N-гликолилнейраминовую кислоту (NGNA) или их смесь. В другом варианте осуществления сиаловая кислота представляет собой аналог или производное NANA или NGNA с ацетилированием в положении 9 на сиаловой кислоте. В одном из вариантов осуществления N-гликаны на Fc-содержащих полипептидах содержат NANA и не содержат NGNA. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:18. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:19. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, состоящий (или состоящий по существу) из SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:19.

Другое изобретение, описываемое в настоящем документе, относится к фармацевтической композиции, которая включает Fc-содержащий полипептид, где, по меньшей мере, 70% N-гликанов на Fc-содержащем полипептиде включают олигосахаридную структуру, выбранную из группы, состоящей из SA(_1-4)Gal(_1-4)GlcNAc(_2-4)Man₃GlcNAc₂ и SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂, где остатки сиаловой кислоты присоединены посредством α-2,6-связи, где у N-гликанов отсутствует фукоза, и где Fc-содержащий полипептид содержит мутации в аминокислотных положениях 243 и 264 в Fc-области, где нумерация приведена согласно индексу EU по Kabat. В одном из вариантов осуществления мутации представляют собой F243A и V264A. В другом варианте осуществления мутации представляют собой F243Y и V264G. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует мутации 243T и V264G. В другом варианте осуществления мутации представляют собой F243L и V264A. В другом варианте осуществления мутации представляют собой F243L и V264N. В другом варианте осуществления мутации представляют собой F243V и V264G. В одном из вариантов осуществления, по меньшей мере, 47 моль% N-гликанов имеют структуру SA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂. В другом варианте осуществления, по меньшей мере, 47 моль% N-гликанов имеют структуру NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂. В одном из вариантов осуществления сиалированные N-гликаны содержат смесь α-2,3- и α-2,6-связанных сиаловых кислот. В другом варианте осуществления сиалированные N-гликаны содержат только α-2,6-связанную сиаловую кислоту. В одном из вариантов осуществления сиалированные N-гликаны содержат α-2,6-связанную сиаловую кислоту и не содержат детектируемого количества α-2,3-связанной сиаловой кислоты. В одном из вариантов осуществления сиаловая кислота представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту (NANA) или N-гликолилнейраминовую кислоту (NGNA) или их смесь. В другом варианте осуществления сиаловая кислота представляет собой аналог или производное NANA или NGNA с ацетилированием в положении 9 на сиаловой кислоте. В одном из вариантов осуществления N-гликаны на Fc-содержащих полипептидах содержат NANA и не содержат NGNA. В одном из вариантов осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:18. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, включающий SEQ ID NO:19. В другом варианте осуществления Fc-содержащий полипептид представляет собой фрагмент антитела, состоящий (или состоящий по существу) из SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:19.

Изобретение также относится к Fc-содержащему полипептиду, включающему тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:9 или ее вариант, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2 или ее вариант, где вариант включает одно или несколько следующих свойств по сравнению с антителом, содержащим аминокислотную последовательность тяжелой цепи из SEQ ID NO:1 и аминокислотную последовательность легкой цепи из SEQ ID NO:2: сниженная эффекторная функция, повышенные противовоспалительные свойства; повышенное сиалирование; повышенная биодоступность (абсорбция или экспозиция) при парентеральном введении, и сниженное связывание с FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa и FcγRIIIb. Изобретение также относится к Fc-содержащему полипептиду, включающему тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:12 или ее вариант, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:11 или ее вариант, где вариант включает одно или несколько следующих свойств по сравнению с антителом, содержащим аминокислотную последовательность тяжелой цепи из SEQ ID NO:10 и ами