Биомаркеры на основе опухолевой ткани для комбинированной терапии бевацизумабом

Биомаркеры на основе опухолевой ткани для комбинированной терапии бевацизумабом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способам повышения выживаемости без прогрессирования заболевания пациента, страдающего от рака желудочно-кишечного тракта, в частности, метастатического колоректального рака (мКРР), с помощью бевацизумаба (Авастин, Avastin^®) в комбинации с химиотерапией и с помощью определения уровня экспрессии одного или более из VEGFA (Vascular endothelial growth factor А, фактор роста эндотелия сосудов A), HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, человеческий рецептор эпидермального фактора роста 2), и нейропилина относительно контрольного уровня экспрессии у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, метастатического колоректального рака (мКРР).

Соответственно, настоящее изобретение связано с идентификацией и селекцией биомаркеров рака желудочно-кишечного тракта, в частности, метастатического колоректального рака (мКРР), которые коррелируют с чувствительностью или наличием ответной реакции на ингибиторы ангиогенеза, например, бевацизумаб (Avastin®), в комбинации с химеотерапевтическим лечением, например, химиотерапии на основе оксалиплатина. В этом аспекте, изобретение связано с применением опухоль-специфичного профиля (профилей) одного или более из VEGFA, HER2 и нейропилина относительно контроля у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР, для выявления пациентов, чувствительных или реагирующих на добавление ингибиторов ангиогенеза, например, бевацизумаба (Avastin®), к стандартной химиотерапии. Кроме того, изобретение относится к способам повышения выживаемости без прогрессирования заболевания пациента, страдающего раком желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР, с помощью добавления ингибиторов ангиогенеза, например, бевацизумаба (Avastin®), к стандартной химиотерапии, например, к оксалиплатиновой химиотерапии, с помощью определения опухоль-специфичного уровня (уровней) экспрессии при опухоли одного или более из VEGFA, HER2 и нейропилина, по сравнению с контролем (контролями) у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, метастатического колоректального рака. В качестве альтернативы или дополнения к определению уровня экспрессии одного или более из VEGFA, HER2 и нейропилина в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, может быть определено число сосудов в опухолевом образце относительно контрольного уровня (уровней) у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР, как биомаркер, указывающий на пациента, чувствительного или реагирующего на добавление ингибиторов ангиогенеза например, бевацизумаба (Avastin®), к стандартной химиотерапии. Изобретение также предусматривает наборы и композиции для выявления пациентов, чувствительных или реагирующих на ингибиторы ангиогенеза, в частности, бевацизумаб (Avastin®), установленных и определенных в соответствии со способами настоящего изобретения.

Ангиогенез является необходимым для развития рака, при этом он регулирует не только размер первичной опухоли и рост, но также влияет на инвазивный и метастатический потенциал. Соответственно, механизмы, опосредующие процессы ангиогенеза были исследованы как потенциальные мишени для направленной антираковой терапии. Ранее при изучении модуляторов ангиогенеза было показано, что сигнальный путь фактора роста эндотелия сосудов (англ. vascular endothelial growth factor, VEGF) преимущественно регулирует активность ангиогенеза в различных типах рака, и были разработаны различные способы терапии для модулирования различных этапов этого пути. Среди прочего, такие способы терапии включают бевацизумаб, сунитиниб, сорафениб и ваталаниб. Хотя применение ингибиторов ангиогенеза в клинической практике оказалось успешным, не все пациенты реагируют или полностью реагируют на терапию с помощью ингибиторов ангиогенеза. Механизм (механизмы), лежащий в основе такого неполного ответа, не известен. Таким образом, существует растущая потребность выявления подгрупп пациентов, чувствительных или реагирующих на антиангиогенезную раковую терапию.

Хотя известен целый ряд ингибиторов ангиогенеза, наиболее выдающимся ингибитором ангиогенеза является бевацизумаб (Авастин, Avastin^®). Бевацизумаб представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело lgG1, которое специфично связывается и блокирует биологическое действие VEGF (фактора роста эндотелия сосудов). VEGF является ключевым фактором опухолевого ангиогенеза - ключевого процесса, требующегося для роста опухоли и образования метастазов, т.е. распространения опухоли в другие части тела. Авастин^® был одобрен в Европе для лечения поздних стадий четырех наиболее распространенных типов рака: колоректального рака, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легких (НРЛ) и рака почки, которые в совокупности вызывают более 2,5 миллионов смертей в год. В США Авастин^® был первым антиангиогенезным терапевтическим средством, утвержденным FDA, и в настоящее время одобрен для лечения пяти типов опухолей: колоректального рака, немелкоклеточного рака легких, рака молочной железы, рака головного мозга (глиобластомы) и рака почки (почечно-клеточный рак). К настоящему времени более полумиллиона пациентов прошли лечение Авастином, и существует крупномасштабная исследовательская программа, включающая более 450 клинических исследований, направленная на изучение дальнейшего применения Авастина для лечения различных типов рака (в том числе колоректального рака, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легких, рака головного мозга, рака желудка, рака яичников и простаты) в различных условиях (например, на поздней или ранней стадии заболевания). Важно отметить, что Авастин^® продемонстрировал перспективность применения в качестве сотерапевтического средства, демонстрируя эффективность в сочетании с широким спектром химиотерапевтических препаратов и других противораковых способов лечения. Из литературы известны исследования фазы III, демонстрирующие положительный эффект сочетания бевацизумаба со стандартными схемами химиотерапии (см, например, Saltz et al., 2008, J. Clin. Oncol., 26:2013-2019; Yang et al., 2008, Clin. Cancer Res., 14:5893-5899; Hurwitz et al., 2004, N. Engl. J. Med., 350:2335-2342). Однако, как и в предыдущих исследованиях ингибиторов ангиогенеза, некоторые из этих исследований фазы III показали, что часть пациентов не полностью реагируют на добавление бевацизумаба (Авастин^®) к химиотерапевтическому режиму лечения.

Соответственно, существует потребность в способах определения тех пациентов, которые реагируют или могут реагировать на комбинированную терапию, содержащую ингибиторы ангиогенеза, в частности, бевацизумаб (Avastin^®). Таким образом, техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, представляет собой создание способов и средств идентификации пациентов, страдающих или предрасположенных к развитию рака желудочно-кишечного тракта, в частности мКРР, которые могут извлечь пользу от добавления ингибиторов ангиогенеза, в частности бевацизумаба (Avastin®), к химиотерапевтическим схемам лечения, например, лечению с помощью ингибиторов на основе оксалиплатина.

Техническая проблема решена с помощью вариантов воплощения настоящего изобретения, охарактеризованных в пунктах формулы изобретения.

Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает способ улучшения лечебного эффекта химиотерапии у пациента, страдающего раком желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР, с помощью добавления бевацизумаба к вышеупомянутой схеме химиотерапии, при этом указанный способ включает:

(а) определение уровня экспрессии одного или более из VEGFA, HER2 и нейропилина; и

(б) введение бевацизумаба в комбинации с химиотерапевтическим режимом лечения пациенту, имеющему повышенный уровень VEGFA, и/или пониженный уровень HER2 и/или нейропилина, относительно контрольных уровней, определенных у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР.

Настоящее изобретение относится к способу улучшения лечебного эффекта химиотерапии у пациента, страдающего раком желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР, с помощью добавления бевацизумаба к химиотерапевтическому режиму лечения, при этом указанный способ включает:

(а) получение образцов тканей от указанного пациента;

(б) определение уровня экспрессии одного или более из VEGFA, HER2, и нейропилина;и

(в) введение бевацизумаба в комбинации с химиотерапевтическим режимом лечения пациенту, имеющему повышенный уровень VEGFA, и/или пониженный уровень HER2 и/или нейропилина относительно контрольных уровней, определенных у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР.

Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает способ повышения выживаемости без прогрессирования заболевания у пациента, страдающего раком желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР, с помощью добавления бевацизумаба к схеме химиотерапии, при этом указанный способ включает:

(а) определение уровня экспрессии одного или более из VEGFA, HER2 и нейропилина; и

(б) введение бевацизумаба в комбинации с химиотерапевтическим режимом лечения пациентам, имеющим повышенный уровень VEGFA, и/или пониженный уровень HER2 и/или нейропилина относительно контрольных уровней, определенных у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР.

Настоящее изобретение, таким образом, представляет способ повышения выживаемости без прогрессирования заболевания пациента, страдающего раком желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР, с помощью добавления бевацизумаба к схеме химиотерапии, при этом указанный способ включает:

(а) получение образцов тканей от вышеупомянутых пациентов;

(б) определение уровня экспрессии одного или более из VEGFA, HER2, и нейропилина; и

(в) введение бевацизумаба в комбинации с химиотерапевтическим режимом лечения пациентам, имеющим повышенный уровень VEGFA, и/или пониженный уровень HER2 и/или нейропилина относительно контрольных уровней, определенных у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР.

В другом варианте воплощения, настоящее изобретение относится к способу in vitro определения у пациента чувствительности или способности реагировать на добавление бевацизумаба к химиотерапевтической схеме, при этом указанный способ включает:

(а) получение образцов ткани пациентов, страдающих или предрасположенных к раку желудочно-кишечного тракта, в частности, к мКРР; и

(б) определение уровня экспрессии одного или более из VEGFA, HER2 и нейропилина;

при этом увеличение уровня VEGFA и/или понижение уровня HER2 и/или нейропилина относительно контрольного уровня, определенного у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР, свидетельствует о чувствительности пациента к добавлению бевацизумаба к вышеупомянутой схеме лечения.

В качестве альтернативы или дополнения к определению уровня экспрессии одного или более из VEGFA, HER2 и нейропилина согласно способам, описанным в настоящей заявке, число сосудов в образце опухоли, относительно контрольного уровня (уровней), определенного у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР, может быть определено как биомаркер, указывающий на пациента, чувствительного или реагирующего на добавление ингибиторов ангиогенеза, например, бевацизумаба (Авастин^®), к стандартной химиотерапии. Таким образом, способы реализации настоящего изобретения включают определение числа сосудов в указанном образце, при этом определение количества сосудов известно или может быть известным специалисту, например, из образцов твердых тканей, таких как биоптаты тканей и/или образцов, взятых при резекции тканей. Определение числа сосудов может быть выполнено любым способом, описанным в настоящей заявке или известным в данной области техники для подобных измерений. Примером способа определения числа сосудов является детекция маркеров эндотелиальных клеток с помощью одного или более антител, специфичных к одному или более маркерам эндотелиальных клеток. В предпочтительных вариантах реализации биомаркер эндотелиальных клеток не экспрессируется в опухолевых клетках. Так как структура сосуда формируется из эндотелиальных клеток, один или более маркеров эндотелиальных клеток характеризует структуру сосуда из опухоли, что позволяет быстро определить число сосудов. Специалист, например, патологоанатом, сможет быстро определить оба антитела, применимых для детекции/распознавания эндотелиальных клеток (в частности, относящихся к опухолевым клеткам), а также способы выявления подобных антител и последующий анализ образца. Анализ образца в соответствии со способами настоящего изобретения может быть ручным, например, выполненным специалистом, например, патологоанатомом, как известно в данной области техники, или может быть автоматизирован с применением коммерчески доступного программного обеспечения для обработки и анализа картин патологий, например, для определения числа сосудов или для другого анализа тканей биопсии или резекций (например, MIRAX SCAN, Carl Zeiss AG, Jena, Germany).

Типичным антигеном, узнаваемым в качестве маркера эндотелиальных клеток, применяемым для определения числа сосудов в соответствии со способами настоящего изобретения, является CD31. Антиген CD31 узнается, например, с помощью антител клона JC70A из Dako A/S (Glostrup, Denmark) под номером М0823, применение которых входит в способы по настоящему изобретению. Таким образом, изобретение включает определение опухоль-специфичного уровня экспрессии или паттерна экспрессии CD31 в образцах тканей пациентов (1) в качестве показателя чувствительности или реагирования вышеупомянутых пациентов на добавление бевацизумаба к схеме химиотерапии, или (2) как часть способа повышения выживаемости без прогрессирования заболевания вышеупомянутого пациента, при этом такой пациент страдает или предположительно страдает от рака желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР. Поскольку CD31 маркирует эндотелиальные клетки, и большее число сосудов коррелирует с большим числом эндотелиальных клеток, число сосудов в образце также напрямую связано с опухоль-специфичным уровнем экспрессии CD31. Таким образом, изобретение включает способы повышения выживаемости без прогрессирования болезни пациента, страдающего раком желудочно-кишечного тракта, включающие определение опухоль-специфичного числа сосудов и/или опухоль-специфичного уровня экспрессии CD31 у вышеупомянутых пациентов и применение бевацизумаба в комбинации со схемой химиотерапии пациента, имеющего увеличенное число сосудов (и/или повышенную экспрессию CD31) относительно контрольного уровня, определенного у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР. Кроме того, изобретение включает способ in vitro выявления пациента, реагирующего или чувствительного к добавлению бевацизумаба к схеме химиотерапии, включающий определение опухоль-специфичного числа сосудов и/или опухоль-специфичного уровня экспрессии CD31 у вышеупомянутого пациента, в соответствии с которым повышенное число сосудов (и/или повышенный уровень экспрессии CD31) в опухолевых образцах вышеупомянутого пациента относительно контрольного уровня, определенного у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР, является ииндикатором чувствительности пациента к добавлению бевацизумаба к вышеупомянутой схеме.

Соответственно, настоящее изобретение решает определенные технические проблемы, неожиданно показавшие, что опухоль-специфичный уровень экспрессии одного или более из VEGFA, HER2 и нейропилина у конкретного пациента относительно контрольного уровня, определенного у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР, коррелирует с лечебным эффектом у пациентов, которым вводили ингибитор ангиогенеза в комбинации со схемой химиотерапии. В частности, неожиданно было выявлено, что изменение опухоль-специфичного уровня экспрессии VEGFA, HER2 и/или нейропилина является маркером/предвестником повышения выживаемости без прогрессирования болезни у пациентов с раком желудочно-кишечного тракта в ответ на добавление бевацизумаба (Авастин^®) к оксалиплатиновой схеме химиотерапии. Было обнаружено, что у пациентов, проявляющих ответ или чувствительность к добавлению бевацизумаба (Авастин^®) к схеме химиотерапии, наблюдается повышенная экспрессия VEGFA и/или пониженная экспрессия нейропилина и пониженная экспрессия HER2 относительно контрольных уровней, определенных в образцах, полученных от пациентов с диагнозом метастатический рак желудочно-кишечного тракта. Более того, в дополнение к измененной экспрессии одного или более из VEGFA, HER2 и/или нейропилина, как описано в настоящей заявке, было неожиданно установлено, что увеличение опухоль-специфичного числа сосудов у конкретного пациента (которое коррелирует с опухоль-специфичным уровнем экспрессии одного или более маркеров эндотелиальных клеток, например, CD31) относительно контрольного уровня, определенного у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности мКРР, коррелирует с уровнем (1) одного из маркеров/предвестников для повышения выживаемости без прогрессирования заболевания, и/или (2) одного из маркеров/ предвестников, который коррелирует с лечебным эффектом у пациентов с раком желудочно-кишечного тракта, получавшим ингибиторы ангиогенеза в комбинации со схемой химиотерапии. Термины "маркер" и "предвестник" могут быть использованы как взаимозаменяемые и относятся к уровням экспрессии одного или более из VEGFA, HER2 и/или нейропилина, как описано в настоящей заявке. В дополнение к уровню экспрессии одного или более из VEGFA, HER2 и/или нейропилина, в настоящем изобретении также используются термины "маркер" и "предвестник", относящиеся к опухоль-специфичному числу сосудов и/или опухоль-специфичному уровню экспрессии маркеров эндотелиальных клеток, например, CD31, в соответствии с описанными в настоящей заявке способами. Изобретение также включает использование терминов "маркер" и "предвестник" в отношении комбинирования любых двух или более опухоль-специфичных уровней экспрессии VEGFA, HER2 и/или нейропилина и опухоль-специфичного числа сосудов.

В контексте настоящего изобретения "VEGFA" относится к белковому фактору роста эндотелия сосудов А, примером которого является SEQ ID NO:1, показанная на Фигуре 6. Термин "VEGFA" включает белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, а также его гомологи и изоформы. Термин "VEGFA" также включает известные изоформы, например, VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅, VEGF₁₆₅, VEGF₁₈₉ и VEGF₂₀₆, а также варианты, гомологи и их изоформы. В контексте настоящего изобретения термин "VEGFA" также включает белки, имеющие не менее 85%, не менее 90% или не менее 95% гомологии аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, или аминокислотным последовательностям вариантов и/или их гомологов, также фрагменты последовательностей, при условии, что различные белки (включая изоформы), гомологичные белки и/или фрагменты узнаются одним или несколькими VEGFA-специфичными антителами, такими как антитела клона SP28, доступные от Abeam, Inc (Cambridge, Massachusetts, U.S.A.).

В контексте настоящего изобретения "HER2" относится к трансмембранному белку первого типа, известному также как c-erbB2, ErbB2 или Neu, принадлежащему к семейству рецепторов эпидермального фактора роста, примером которого является аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2, показанная на Фигуре 7. В контексте настоящего изобретения термин "HER2" также включает гомологов, варианты и изоформы, в том числе сплайсированные изоформы HER2. Термин "HER2" также включает белки, имеющие не менее 85%, не менее 90% или не менее 95% гомологии аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или последовательности одного или нескольких HER2 гомологов, вариантов и изоформ, а также фрагменты последовательностей, при условии, что варианты белков (включая изоформы), гомологичные белки и/или фрагменты узнаются одним или несколькими НЕР2-специфичными антителами, например, поставляемыми в виде препарата Herceptest™, доступного от Dako A/S (Glostrup, Denmark). НЕР2-специфичные антитела, например, в указанном препарате Herceptest™, являются аффинно очищенными антителами кролика к синтетическому C-концевому внутрицитоплазматическому фрагменту человеческого белка HER2 (иммуноген объединен с гемоцианином моллюска). Другие примеры антител к HER2, которые являются коммерчески доступными и удобными для применения согласно способам настоящего изобретения, включают, но не ограничены перечисленными: клон 4 В5, доступный от Ventana Medical Systems S.A. (Illkirch, France); один или несколько клонов СВ11, 5А2, 10А7, и СВЕ, доступных от Novocastra/Leica GmbH (Wetzler, Germany); клон SP3, доступный от Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA, USA) и клон ТАВ250, доступный от Invitrogen™ (Carslbad, CA, USA).

В контексте настоящего изобретения "нейропилин" относится к белку нейропилину-1, мембранному белку типа I, известному также как NRP-1, примером которого является аминокислотная последовательность SEQ ID NO:3, показанная на Фигуре 8. При использовании в настоящей заявке, "нейропилин" может также относиться к нейропилину-2/МРР-2, который имеет 44% гомологии с NRP-1, как известно в данной области техники. В контексте настоящего изобретения термин "нейропилин" также включает гомологов, варианты и изоформы NRP-1 и/или NRP-2. Кроме того, термин "нейропилин" включает белки, имеющие не менее 85%, не менее 90% или не менее 95% гомологии аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или последовательности одного или нескольких NRP-1 и/или NRP-2 гомологов, вариантов и изоформ, включая сплайсированные изоформы, а также фрагменты последовательностей при условии, что различные белки (включая изоформы), гомологичные белки и/или фрагменты узнаются с помощью одного или более специфичных к NRP-1 и/или NRP-2 антитела, например, клон 446915, доступный из R&D Systems, Inc. (Minneapolis, Minnesota, U.S.A.).

В качестве альтернативы или дополнения к определению опухоль-специфичного уровня экспрессии одного или более из VEGFA, HER2 и нейропилина, изобретение также включает определение числа сосудов как один из биомаркеров для применения в способах, описанных в настоящей заявке. Как известно в данной области и как описано здесь, число сосудов в образце ткани пациента, например, в образце, содержащем опухолевые ткани, может быть, например, изучено с помощью иммуно-гистохимических методов детекции одного или нескольких маркеров эндотелиальных клеток, например, CD31. CD31 известен как маркер эндотелиальных клеток, который можно применять для определения числа сосудов в опухолевых образцах тканей и, обычно, его выявляют с применением специфичных антител, таких как например антитело к CD31, доступное от Dako A/S (Glostrup, Denmark) клона JC70A под номером М0823. В качестве альтернативы или в дополнение к определению опухоль-специфичного уровня экспрессии одного или более из VEGFA, HER2 и нейропилина, настоящее изобретение, помимо того, включает применение Dako A/S антител клона JC70A (product number M0823) для определения числа сосудов, идентификации эндотелиальных клеток и/или определения уровня экспрессии маркеров эндотелиальных клеток в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке.

Соответственно, настоящее изобретение включает определение уровней экспрессии белков, включающих аминокислотные последовательности, описанные в настоящей заявке, но не ограничивается ими. В этом контексте настоящее изобретение включает определение гомологов, вариантов и изоформ одного или более из VEGFA, HER2 и нейропилина; вышеупомянутые изоформы или варианты могут в числе других включать аллельные варианты или сплайсированные варианты. Предусмотрено также определение белков, которые являются гомологичными одному или более из VEGFA, HER2 и нейропилина, описанных в настоящей заявке, или их фрагментам, например, имеющих по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотным последовательностям SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 или их фрагментам. В качестве альтернативы или дополнения, настоящее изобретение включает определение уровней экспрессии белков, кодируемых нуклеотидными последовательностями или их фрагментами, которые по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичны нуклеотидным последовательностям, кодирующим SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 или их фрагментам, вариантам или изоформам. В контексте настоящего изобретения термин "вариант" означает, что аминокислотная последовательность VEGFA, HER2 и/или нейропилина или нуклеотидная последовательность, кодирующая указанную аминокислотную последовательность, отличается от определенной последовательности, идентифицированной как SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 и/или доступной под вышеуказанными номерами доступа в базе GenBank, и образуется в результате мутаций, например, делеций, добавлений, замен, инверсий и т.д. Кроме того, термин "гомолог" относится к молекулам, имеющим по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% идентичности последовательности одного или нескольких полипептидов, как показано в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 или их фрагменту (фрагментам).

Кроме того, изобретение включает определение числа сосудов в образцах ткани пациентов, которое коррелирует с опухоль-специфичной экспрессией маркеров эндотелиальных клеток, известных в данной области техники, например, опухоль-специфичным уровнем экспрессии CD31. В этом контексте настоящее изобретение включает выявление гомологов, вариантов и изоформ одного или нескольких маркеров эндотелиальных клеток или их вариантов, и может, в частности, включать аллельные варианты или сплайсированные варианты маркеров эндотелиальных клеток. Предусмотрено также выявление белков, которые являются гомологичными одному или нескольким маркерам эндотелиальных клеток, известных в данной области, например, имеющим по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичности с аминокислотной последовательностью, известной в качестве маркера эндотелиальных клеток, или ее фрагменту, например, CD31 или его фрагменту. В качестве альтернативы или дополнения настоящее изобретение также включает определение уровней экспрессии белков, кодируемых нуклеотидными последовательностями или их фрагментами, которые являются по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны нуклеотидной последовательности, кодирующей маркер эндотелиальных клеток, например, CD31 или его фрагмент, вариант или изоформу.

Для определения степени идентичности аминокислотной или нуклеотидной последовательности к аминокислотной или нуклеотидной последовательности, описанной в настоящей заявке, профессионал может использовать средства и методы, известные для этих целей в данной области техники, например, выравнивание, либо вручную, либо с помощью компьютерных программ, широко известных или описанных в настоящей заявке.

В соответствии с настоящим изобретением термин "идентичность" или "процент идентичности" в контексте двух или нескольких аминокислотных или нуклеотидных последовательностей относится к двум или нескольким последовательностям или подпоследовательностям, которые являются схожими (например, 60% или 65% идентичности, предпочтительно 70-95% идентичности, предпочтительно по меньшей мере 95% идентичности аминокислотным последовательностям, например, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, или последовательностям, которые известны как маркеры эндотелиальных клеток, например, CD31) при сравнении и выравнивании с максимальным соответствием в окне сравнения или в обозначенной области, измеренной с помощью используемого последовательного алгоритма сравнения, общеизвестного в данной области, или с помощью ручного выравнивания или с помощью визуальной проверки. Последовательности, имеющие, например, от 60% до 95% или более идентичности, считаются в значительной степени идентичными. Такое определение распространяется также на последовательность, которая комплементарна анализируемой. Предпочтительно описанная идентичность существует в пределах участка, длина которого составляет по меньшей мере от 15 до 25 аминокислот или нуклеотидов, более предпочтительно, от 50 до 100 аминокислот или нуклеотидов. Специалистам в данной области техники известно, каким образом можно определить процент идентичности между/среди последовательностями, с помощью, например, алгоритмов, основанных к примеру на алгоритме CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) или FASTDB (Brutlag Сотр. Арр. Biosci. 6 (1990), 237-245) компьютерных программ, как известно в данной области техники.

Хотя алгоритм FASTDB обычно не учитывает внутренние несовпадающие делеции или добавления в последовательностях, то есть пробелы в расчетах, это можно исправить вручную во избежание завышенного % идентичности. ClustalW, наоборот, учитывает пробелы в последовательностях при расчете идентичности. Также специалистам в данной области доступны алгоритмы BLAST (от англ. Basic Local Alignment Search Tool, средство поиска основного локального выравнивания) и BLAST 2,0 (Altschul, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul, 1993 J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410). Программа BLASTN для нуклеотидных последовательностей использует по умолчанию значение длины слова (W, word length), равное 11, ожидание (Е, expectation), равное 10, М=5, N=4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует по умолчанию значение длины слова (W), равное 3, и ожидание (Е), равное 10. В расчетной матрице BLOSUM62 (Henikoff (1989) PNAS 89:10915) используется выравнивание (В), равное 50, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=4 и сравнение обоих цепей.

Алгоритмы BLAST, рассмотренные выше, проводят выравнивание как аминокислотных, так и нуклеотидных последовательностей для определения сходства последовательностей. Благодаря локальному характеру выравниваний, BLAST является особенно полезным в определении точных совпадений или выявлении сходных последовательностей. Основной единицей алгоритма BLAST является пара сегментов с максимальным сходством (англ. High-scoring Segment Pair, HSP). HSP состоит из двух фрагментов последовательности произвольной, но одинаковой длины, выравнивание которых является максимальным и для которых расчет выравнивания соответствует или превышает пороговое значение, или минимально допустимый уровень, заданный пользователем. Подход BLAST предназначен для поиска HSP между анализируемой последовательностью и последовательностью из базы данных, для оценки статистической значимости найденных совпадений и сообщения только тех совпадений, которые удовлетворяют пороговым значениям, выбранным пользователем. Параметр Е устанавливает статистически значимый порог для сообщения совпадающих последовательностей из базы данных. Е определяют как верхнюю границу ожидаемой частоты вероятности возникновения HSP (или серий HSP) в контексте поиска по всей базе данных. Любая база данных последовательностей, сопоставление которой удовлетворяет Е, отмечается на выходных данных программы.

Аналогичные техники вычислений, использующие BLAST, можно применять для поиска идентичных или родственных молекул в белковых или нуклеотидных базах данных, таких как GenBank или EMBL. Этот анализ является более быстрым, чем множественные мембранные гибридизации. Кроме того, чувствительность компьютерного поиска можно модифицировать, чтобы определить относится ли конкретное совпадение к категории точных или схожих. В основе поиска лежит счет (балловый показатель), который определяется как:

% идентичности последовательности х % максимального счета BLAST 100

и учитывает как степень сходства между двумя последовательностями, так и длину совпадающей последовательности. Например, при определенном счете, равном 40, совпадение будет точным в пределах 1-2% ошибки, а при счете, равном 70, совпадение будет точным. Схожие молекулы обычно определяют, выбирая те последовательности, которые характеризуются счетом (балловым показателем) от 15 и 40, хотя и более низкий счет также может определить родственные молекулы. Другой пример программы, способной осуществлять выравнивание последовательностей, является компьютерная программа на основе CLUSTALW (Thompson, 1994, Nucl. Acids Res. 2:4673-4680) или FASTDB (Brutlag, 1990, Сотр. App.Biosci. 6:237-245), общеизвестная в данной области техники.

Опухоль-специфичные уровни экспрессии VEGFA, HER2 и/или нейропилина можно рассматривать отдельно как индивидуальные маркеры, или в группах из двух или более маркеров как экспрессионный профиль, для предсказания чувствительности пациента на добавление бевацизумаба к схеме химиотерапии. Таким образом, способы настоящего изобретения включают определение экспрессионного профиля, основанного на уровне экспрессии одного или нескольких маркеров. В качестве альтернативы или в дополнение к определению уровня экспрессии одного или нескольких VEGFA, HER2 и нейропилина в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, число сосудов в опухолевом образце ткани, относительно контрольного уровня (уровней), определенного у пациентов с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР, можно также применять как один или более биомаркер, указывающий на пациента, чувствительного или реагирующего на добавление ингибиторов ангиогенеза, например, бевацизумаба (Авастина^®), к стандартной химиотерапии.

В соответствии с настоящим изобретением было неожиданно обнаружено в популяции N01966, что более высокий эффект лечения бевацизумабом связан с более высоким уровнем экспрессии CD31 (большим числом сосудов), более высоким уровнем экспрессии VEGFA, более низким уровнем экспрессии нейропилина и более низким уровнем экспрессии HER2 в опухолевых клетках

Уровень экспрессии одного или нескольких маркеров из VEGFA, HER2 и нейропилина может быть оценен любым способом, известным в данной области техники, подходящим для определения специфичного уровня белка в образце ткани пациента, и предпочтительно их определяют с помощью иммуно-гистохимических (ИГХ) методов, использующих антитела, специфичные для одного или более из VEGFA, HER2, нейропилина и/или CD31. Такие способы хорошо известны и являются стандартными в данной области, и соответствующие коммерческие антитела и/или наборы легкодоступны. Например, коммерчески доступные антитела/тестовые наборы для VEGFA, HER2, нейропилина и CD31 можно приобрести у Abeam, Inc (Cambridge, Massachusetts, U.S.A.) как клон SP28, у Dako A/S (Glostrup, Denmark) как Herceptest™, из R&D Systems, Inc. (Minneapolis, Minnesota, U.S.A.) как клон 446915, и у Dako A/S (Glostrup, Denmark) как клон JC70A, соответственно. Предпочтительно уровни экспрессии маркера/ индикаторных белков настоящего изобретения оценивают с использованием реагентов и/или протоколов, рекомендованных изготовителем антител или коммерческих наборов. Специалисту также известны другие способы определения уровня экспрессии одного или более из VEGFA, HER2, нейропилина с помощью ИГХ методов. Таким образом, уровень экспрессии одного или нескольких маркеров/индикаторов настоящего изобретения может быть рутинно и воспроизводимо определен специалистами в данной области без особых трудностей. Тем не менее, для обеспечения точных и воспроизводимых результатов изобретение также включает тестирование образцов тканей пациентов в специализированной лаборатории, в которой могут обеспечить проверку процедур тестирования.

Предпочтительно уровень экспрессии одного или более из VEGFA, HER2, нейропилина оценивают в биологическом образце, который содержит или, как предполагается, содержит раковые клетки. Образец может представлять собой образец, полученный при резекции желудочно-кишечных тканей, биоптат желудочно-кишечных тканей или метастатического поражения, полученный от пациента, страдающего или предположительно страдающего, или с диагнозом рак желудочно-кишечного тракта, в частности, мКРР. Предпочтительно образец представляет собой образец ткани прямой кишки, полученный при резекции образец или биоптат опухолевой ткани прямой кишки, установленного или предполагаемого метастатического раком желудочно-кишечного тракта поражение или срез, или пробу крови, например, пробу периферической крови, точно или предположительно содержащей циркулирующие раковые клетки, например, желудочно-кишечные раковые клетки. Образец может включать как раковые клетки, т.е. клетки опухоли, так и нераковые клетки, и, в предпочтительном варианте, включающий раковые и нераковые клетки. В аспектах изобретения, включающих определение числа сосудов в образце, образец содержит раковые/опухолевые клетки и нераковые клетки, представляющие собой эндотелиальные клетки. Специалис