Модификации аллергенов группы 6 poaceae (мятликовых), имеющих пониженную аллергенность благодаря мутагенезу пролиновых остатков

Модификации аллергенов группы 6 poaceae (мятликовых), имеющих пониженную аллергенность благодаря мутагенезу пролиновых остатков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Представленное изобретение касается получения и использования рекомбинантных модификаций аллергенов труппы 6 Poaceae (мятликовых, истинные травы), которые характеризуются пониженной IgE реактивностью по сравнению с известными аллергенами немутантного типа и, в то же время, в значительной степени сохранили свою реактивность по отношению к T-лимфоцитам.

Данные модификации гипоаллергенных аллергенов могут быть использованы для специфической иммунотерапии (гипосенсибилизация) у пациентов, имеющих аллергию на пыльцу растений, или для профилактического лечения аллергии на пыльцу растений.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения касается модификаций аллергена Phl p 6 тимофеевки луговой (Phleum pratense), в которой пролины в положениях 29, 30, 57, 79 мутировали по отдельности или в комбинациях.

Уровень техники изобретения

Аллергии типа 1 имеют всемирное значение. До 20% населения в промышленно развитых странах страдают от недугов, таких как аллергический ринит, конъюнктивит или бронхиальная астма.

Данные аллергии вызывают источники различного происхождения, такие как деревья и травы (пыльца), грибы (споры), клещи (экскременты), коты или собаки. Источники аллергена распространяются напрямую по воздуху (пыльца, споры) или могут распространяться в воздухе, связанные с частицами дизельной сажи (пыльца) или домашней пылью (экскременты клещей, частицы кожи, волосы). В связи с тем, что вещества, запускающие аллергию, находятся в воздухе, также используют термин аэроаллергены.

Вещества, запускающие аллергию типа 1, являются протеинами, гликопротеинами или полипептидами. После проникновения через мембраны слизистой оболочки данные аллергены реагируют с IgE молекулами, связанными с поверхностью тучных клеток у чувствительных лиц. Если данные IgE молекулы являются сшитыми друг с другом посредством аллергена, это в результате приводит к секреции медиаторов (например, гистамина, простагландинов) и цитокинов клеткой-эффектором и, таким образом, к появлению соответствующих аллергических симптомов.

Вплоть до 40% страдающих от аллергии типа 1 демонстрируют специфическую IgE реактивность к экстрактам пыльцы мятликовых (Burney et al., 1997, J. Allergy Clin. Immunol. 99:314-322; D'Amato et al., 1998, Allergy 53:567-578; Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin. Immunology, 78, 1190-2002). Семейство мятликовых (Poaceae) включает более чем 10000 видов, из которых намного больше чем 20 до настоящего времени известны как инициирующие факторы аллергических симптомов (Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107; Esch, 2008, Allergens and Allergen Immunotherapy, Clinical Allergy and Immunology Series, 107-126).

Большинство из мятликовых, запускающих аллергию, относятся подсемейству Pooideae (мятликовидные). Кроме того, виды трав, встречающиеся как дикорастущие формы, такие как, например, Holcus lanatus (бухарник шерстистый), Phalaris aquatica (канареечник канарский), Anthoxanthum odoratum (душистый колосок), Dactylis glomerata (ежа сборная), Festuca pratensis (овсяница луговая), Poa pratensis (мятлик луговой) или Lolium perenne (райграс многолетний английский или пастбищный), культурные злаки, такие как Triticum aestivum (пшеница), Secale cereale (рожь) и Hordeum vulgare (ячмень), также являются известными представителями данного подсемейства.

Один из видов Pooideae, который был исследован лучше в отношении своих аллергенов, является тимофеевкой луговой (Phleum pratense), которая широко распространена во всем мире как дикое растение и также играют коммерческую роль как пастбищное растение и большая кормовая трава.

В зависимости от относительного процента встречаемости в популяции, с которой индивидуальные молекулы аллергена реагируют с IgE антителами страдающих от аллергии, различие делают между основными и второстепенными аллергенами.

Шесть аллергенов тимофеевки луговой могут рассматриваться как основные аллергены: Phl p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92:789-796), Phl p 5 (Matthiesen und Löwenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21:297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98:105-109), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54), Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335(3):299-304), Phl p 4 (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78:260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97:287-294; Nandy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 337(2):563-70) и Phl p 13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30:1395-1402).

Первое описание Phl p 6 было сделано еще в 1978. Протеиновая фракция, очищенная от пыльцы тимофеевки луговой, которую назвали "Ag19", содержавшая аллерген с размером около 15 кДа, которую позже классифицировали в официальной номенклатуре аллергенов и продолжают далее как Phl p 6 (Løwenstein, 1978, Allergy 33:30-41; WHO/IUIS Allergen Nomenclature Subcommittee, www.allergen.org). Phl p 6 классифицируют как основной аллерген в связи с тем, что Phl p 6 - реактивные IgE антитела могут быть обнаружены у около 70% страдающих от аллергии на пыльцу трав (Rossi et al., 2001, Allergy, 56:1180-85; Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9).

Физико-химические исследования аллергена из экстракта пыльцы травы обнаружили две разновидности протеина, которые отличаются первичной последовательностью (Blume et al., 2004, Proteomics 4:1366-71). Данные изоформы приписывают двум ДНК последовательностям, идентифицированным в библиотеках экспрессии пыльцы тимофеевки луговой и носят WHO/IUIS названия Phl p 6.0101 (GenBank: Z27082.1; UniProt: P43215; смотри Фиг.15 и 16 или SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, с пропептидом, смотри Фиг.19 или SEQ ID NO: 9; Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108:55-59) и Phl p 6.0102 (GenBank: Y16955; UniProt: O65868; смотри Фиг.3 и 4 или SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, с пропептидом, смотри Фиг.20 или SEQ ID NO: 10; Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9). За исключением сигнального пептида каждый из протеинов состоит из 110 аминокислот и отличаются только двумя положениями (Val 14 → Ile и Arg 95 → His, начиная со зрелых Phl p 6.0101), которые вызывают различия в молекулярной массе в 5 Да (11790 Да для Phl p 6.0101 по сравнению с 11785 Да для Phl p 6.0102; Фиг.1).

Пыльца других видов истинной травы семейства Poaceae и, в частности, подсемейства Pooideae может содержать основные аллергены, которые являются гомологичными к аллергенам тимофеевки луговой. Такие аллергены, которые встречаются во всех видах, обобщают как группу аллергенов. Высокая структурная гомология таких родственных аллергенов, которая, прежде всего, основана на подобии аминокислотной последовательности, вызывает соответственно высокую перекрестную реактивность молекул с IgE антителами (Lorenz et al., 2009, Int. Arch. Immunol. 148:1-17). Кроме того, известно, что атопические особы, которые аллергически реагируют на основные аллергены тимофеевки луговой, могут первично быть сенсибилизированными одним из других родственных видов истинных трав. В конечном счете, данная перекрестная реактивность может означать, что сенсибилизация одним видом трав является достаточной для запуска аллергической реакции на другие родственные травы.

Аллерген группы 6, который является перекрестно реактивным с Phl p 6, уже обнаружен на протеиновом уровне в пыльце мятлика лугового (Poa pratensis) (Vrtala et al., 1999, J. Immunol. 15; 163:5489-9; Niederberger et al., 1998, J. Allergy din. Immunol. 101(2):258-264).

Помимо перекрестной реактивности аллергенов группы 6 друг с другом также известна перекрестная реактивность с основными аллергенами из группы 5. Полипептидная цепь Phl p 6 демонстрирует значительную схожесть с N-терминальной областью Phl p 5, которая имеет размер около 26-28 кДа (Фиг.1, Фиг.2). Считается, что аллергены могут быть отнесены к общему исходному гену (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108:55-59). Оба протеина образуют α-спиральные вторичные структуры, а не β-складчатые листовые структуры. Рентгеноструктурный анализ показал, что четыре α-спирали Phl p 6 складываются, чтобы образовать характерный пучок спиралей (RCSB Protein Data Bank (Банк данных протеинов) запись: 1NLX; Fedorov et al., 2003; Фиг.1), структура которого также обнаружена в фрагментах Phl p 5 (Rajashankar et al., 2002, Acta Cryst. D58:1175-1181; Maglio et al., 2002, Protein Engineering 15:635-642; Wald et al., 2007, Clin. Exp. Allergy 37:441-450). Подобность между аллергенами имеет такое действие, что некоторые из Phl p 5 - реактивных IgE антител также связываются с Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108:49-54; Andersson & Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107).

Специфическую иммунотерапию (СИТ) или гипосенсибилизацию рассматривают как эффективный подход к терапевтическому лечению аллергий (Fiebig 1995 Allergo J. 4(6):336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4):558-562; Cox et al., 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 120:825-85; James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38:1074-1088).

Классическая форма лечения инъекционной терапии (СКИТ), в которой экстракты природных аллергенов вводят пациенту подкожно в возрастающих дозах, успешно использовалась в течение около 100 лет. В данном лечении иммунная система страдающего от аллергии неоднократно сталкиваются с аллергенами, вызывая перепрограммирование иммунной системы для того, чтобы наряду с этим была достигнута толерантность к аллергенам. После поглощения антигенов из препаратов аллергена антиген-представляющими клетками пептиды присутствуют с антигенами на поверхности клетки. Некоторые специфические пептиды, которые содержат так называемые эпитопы T-клеток признаны антиген-специфическими T-клетками. Данное связывание в результате приводит, среди прочего, к развитию различных типов T-клеток, которые имеют регуляторную функцию. В случае СИТ ответ регуляторной T-клетки в результате приводит к толерантности аллергена, понижающей регуляции T_H2 цитокинов, восстановлению T_H1/T_H2 равновесия, подавлению аллерген-специфического IgE, индукции IgG4, IgG1 и IgA антител, подавлению клеток-эффекторов (тучных клеток, базофилов и эозинофилов) и возобновлению воспаленной ткани (Akdis et al., 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 119(4):780-789; Larchè et al., 2008, Nature Reviews 6:761-771). Эпитопы T-клеток, таким образом, имеют решающее значение для терапевтического действия препаратов аллергенов в случае гипосенсибилизации.

Благодаря перекрестной реактивности основных аллергенов истинных трав, которые присутствуют на IgE, а также на T-клеточном уровне, успешное лечение экстрактом аллергена из представителя одного вида травы обычно является достаточным (Mailing et al., 1993, EAACI Position Paper: Immunotherapy, Allergy 48:9-35; Cox et al., 2007, J Allergy Clin Immunol 120:25-85).

Кроме подкожной иммунотерапии, сублингвальная форма лечения, в которой аллергены или производные аллергенов доставляются через мембрану слизистой оболочки ротовой полости, подвергается клиническим испытаниям и используется как альтернатива инъекционной терапии (James & Durham, 2008, Clin. Exp. Allergy 38:1074-1088).

Следующая возможность - это лечение подвергающейся экспрессии ДНК, которая кодирует соответствующие аллергены (иммунотерапевтическая вакцинация). Экспериментальное доказательство аллерген-специфического влияния иммунного ответа обеспечивается у грызунов путем инъекции аллерген-кодирующей ДНК (Hsu et al. 1996, Nature Medicine 2(5):540-544, Weiss et al., 2006, Int. Arch. Allergy Immunol. 139:332-345).

Во всех данных формах терапии существует принципиальный риск аллергических реакций или даже анафилактического шока (Kleine-Tebbe, 2006, Allergologie, 4:135-156). С целью минимизировать данные риски, применяют инновационные препараты в форме аллергоидов. Существуют химически модифицированные экстракты аллергенов, которые имеют значительно сниженную реактивность IgE, но идентичную реактивность T-клеток по сравнению с необработанным экстрактом (Fiebig 1995 Allergo J. 4(6):336-339, Kahlert et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol, 120:146-157).

Оптимизация лечения является возможной за счет аллергенов, полученных рекомбинантными способами. Определенные коктейли высоко очищенных аллергенов, полученных рекомбинантными способами, которые необязательно приводят в соответствие к индивидуальным характерам сенсибилизации пациентов, могли заменять экстракты из природных источников аллергенов, так как, помимо различных аллергенов, последние содержат относительно большое количество иммуногенных, но не вызывающих аллергию, сопутствующих протеинов. Уже с успехом провели начальные клинические исследования с рекомбинантными аллергенами (Jutel et al., 2005, J. Allergy Clin. Immunol., 116:608-613; Valenta & Niederberger, 2007, J. Allergy Clin. Immunol. 119:826-830).

Реальные перспективы, которые могут в результате привести к безопасной гипосенсибилизации с рекомбинантными продуктами экспрессии, представляются определенно посредством мутированных рекомбинантных аллергенов, в которых IgE эпитопы модифицированы без ослабления эпитопов T-клетки, которые являются неотъемлемой частью лечения (Schramm et al. 1999, J. Immunol. 162:2406-2414). Данные гипоаллергенные протеины могли бы быть использованы в относительно высоких дозах в течение СИТ без возрастания вероятности нежелательных IgE-стимулированных побочных действий.

Ранее такие "гипоаллергенные" модификации с пониженным IgE связыванием были опубликованы для многих аэроаллергенов (в том числе пыльцы и аллергенов домашнего пылевого клеща) и пищевых аллергенов. На основе ДНК немодифицированных аллергенов является возможным получить и экспрессировать рекомбинантную ДНК, в том числе путем фрагментации, олигомеризации, делеций, точечных мутаций или рекомбинации индивидуальных сечений аллергена (перестановка в ДНК) (Ferreira et al., 2006, Inflamm. & Allergy - Drug Targets 5:5-14; Bhalla & Singh, 2008, Trends in Biotechnology 26:153-161; Westritschnig et al., 2007, J. Immunol. 179: 7624-7634).

Рассматривая аллергены группы 6 трав, только одна мутационная стратегия является опубликованной на сегодняшний день, в которой первые девяносто нуклеотидов, кодирующих аминокислоты 1-30 зрелых Phl p 6, были удалены. Молекулу экспрессировали, как гистидин слитую молекулу, очищали и исследовали с учетом ее иммунологических свойств. N-терминальная делеция в результате привела к понижению IgE связывания и снижению способности быть стимулированными базофильными гранулоцитами (Vrtala et al., 2007, J. Immunol. 179:1730-1739). В более поздней статье такая же молекула была присоединена к рекомбинантной модификации Phl p 2, для того чтобы получить гибридную молекулу (Linhart et al., 2008, Biol. Chem. 389:925-933). Мутационная стратегия, основанная на точечных мутациях, как описано для других аллергенов, до настоящего времени еще не была опубликована для аллергенов группы 6 пыльцы травы.

Объект, на котором основано представленное изобретение, заключался в получении новых модификаций аллергенов группы 6 Poaceae на уровне протеина и ДНК, которые характеризуются пониженной IgE реактивностью, в то же время при значительном сохранении реактивности T-клетки и, поэтому, приемлемы для лечебной и профилактической специфической иммунотерапии и иммунотерапевтической ДНК вакцинации.

Краткое описание фигур

Фиг.1. Первичная структура зрелой формы Phl p 6 изоформы, использованной в данном документе. Phl p 6.0102 (IUIS последовательность, UniprotKB 065868, длина 110 аминокислот) со второй известной Phl p 6 изоформой, Phl p 6.0101 (IUIS последовательность, UniprotKB P43215, длина 110 аминокислот) и N-терминальные части - области четырех Phl p 5 изоформ: Phl p 5.0101 (IUIS последовательность, UniprotKB Q40960), Phl p 5.0104 (IUIS последовательность, UniprotKB P93467), Phl p 5.0109 (IUIS последовательность, UniprotKB Q84UI2, 284 аминокислоты) и Phl p 5.0201 (IUIS последовательность, UniprotKB Q40963, общая длина 265 аминокислоты и). Информация о положении аминокислоты слева указывает положение аминокислоты в преобразованном протеине. Положение семи пролиновых остатков, представленных в Phl p 6, по отдельности указывает последовательности выше. Блоки показывают положение α-спиралей Phl p 6 на основе данных рентгено-структурного анализа рекомбинантного Phl p 6 (PDB запись 1NLX; Fedorov et al., 2003). Области, имеющие последовательность идентичную выделены серым.

Фиг.2. Упрощенная модель Phl p 6. Четыре α-спирали (H1-H4) образуют 4-спиральный пучок. Пролиновые остатки 29, 30, 57 и 79 расположены в петлях, связывающих спирали. Пролин 101 расположен позади завершающей спирали. а) Поверхностная модель. Пролиновые остатки 29, 30, 57, 79 и 101 выставлены на поверхности. Пролиновые остатки в каждом случае окрашены черным цветом и обеспечивается обозначением положения. Обе модели сделаны на основе данных рентгеноструктурного анализа рекомбинантного Phl p 6 (PDB запись: 1NLX; Fedorov et al., 2003).

Фиг.7. 12% SDS-PAGE после окрашивания Кумасси. Наполнение: ~1 мкг протеина на след, невосстановленный.

Образцы: 1 = rPhl p 6 wt + 6His; 2 = d[P29, 30] + 6His; 3 = d[P57] + 6His; 4 = d[P79] + 6His; 5 = d[P101] + 6His. M: размер маркера.

Фиг.8. Хроматограмма аналитического SEC определения молекулярной массы, происходящего в реальном времени.

На фигуре изображен относительный УФ сигнал на 280 нм (правая часть оси Y) и молекулярная масса (левая часть оси Y; измерение указано линией в области пика), график от времени элюирования (ось X). Происходящее в реальном времени определение концентрации протеина выполняли, используя OptilabrEX (Wyatt, Santa Barbara, USA) рефрактометрический детектор. Рассеяние света частицами определяли, используя MiniDAWN Treos многоугловой детектор (Wyatt). Массу частиц рассчитывали, используя ASTRA 5.3.2.17 программное обеспечение (Wyatt) посредством совокупности формул Дебая с предположительно увеличенным показателем преломления 0,180 мл/г. Колонка: Superdex 200 GL 10/300 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Размер выделения на 20,45 мин (стрелочка). Элюент: 20 mM Tris, pH 8,0 с 150 mM NaCl.

Образцы: 1 = rPhl p 6 wt + 6His; 2 = d[P29, 30] + 6His; 3 = d[P57] + 6His; 4 = d[P79] + 6His; 5 = d[P101] + 6His.

Фиг.9. Иммуноблот исследуемых веществ после инкубации с сыворотками клинически определенных страдающих от аллергии на пыльцу травы (3-150) rPhl p 6 wt: рекомбинантный Phl p 6 с (+6His) и без гистидинового слитого компонента.

HSA: альбумин сыворотки человека (отрицательный контроль).

Общий: контроль за равномерным наполнением протеина в тест-полосках. Общее протеиновое окрашивание с реагентом "DB71" (Sigma-Aldrich, Taufkirchen).

Фиг.10. В каждом случае данные от одного конкретного эксперимента с сывороткой клинически определенных страдающих от аллергии на пыльцу травы (P). Обозначения представляют собой среднее значение от двух измерений 10 концентраций каждого ингибитора. Горизонтальные линии погрешности показывают соответствующие конкретные значения двух определений. Твердая фаза: rPhl p 6 wt + 6His.

Фиг.11. Доказательство пониженной функциональной аллергенности посредством анализа активирования базофилов с цельной крови клинически определенного страдающего от аллергии на пыльцу травы (P21). Горизонтальная линия: уровень стимулирования путем отрицательного контроля.

Фиг.12. 12% SDS-PAGE после окрашивания Кумасси. Наполнение: ~1 мкг протеина на след, невосстановленный.

Образцы: 1 = d[29, 30, 57] + 6His; 2 = d[P29, 30, 79] + 6His; 3 = d[P29, 30] P57L + 6His; 4 = d[P29, 30] P79L + 6His; 5=d[P29, 30] P57L, P79L] + 6His.

М: размер маркера.

Фиг.13. Хроматограмма аналитического SEC с определением молекулярной массы, происходящим в реальном времени.

На фигуре изображен относительный УФ сигнал на 280 нм (правая часть оси Y) и молекулярная масса (левая часть оси Y; измерение указано линией в области пика), график от времени элюирования (ось X). Происходящее в реальном времени определение концентрации протеина выполняли, используя OptilabrEX (Wyatt, Santa Barbara, USA) рефрактометрический детектор. Рассеяние света частицами определяли, используя MiniDAWN Treos многоугловой детектор (Wyatt). Массу частиц рассчитывали, используя ASTRA 5.3.2.17 программное обеспечение (Wyatt) посредством совокупности формул Дебая с предположительно увеличенным показателем преломления 0,180 мл/г.

Колонка: Superdex 200 GL 10/300 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Размер выделения на 20,45 мин (стрелочка). Элюент: 20 мМ Tris, pH 8,0 з 150 мМ NaCl.

Образцы: 1 = d[29, 30, 57] + 6His; 2 = d[P29, 30, 79] + 6His; 3 = d[P29, 30] P57L + 6His; 4 = d[P29, 30] P79L + 6His; 5 = d[P29, 30] P57L, P79L] + 6His.

Фиг.14. Иммуноблот исследуемых веществ после инкубации с сыворотками клинически определенных страдающих от аллергии на пыльцу травы (3-150)

Общий: контроль за равномерным наполнением протеина в тест-полосках. Общее протеиновое окрашивание с реагентом "DB71" (Sigma-Aldrich, Taufkirchen).

Описание изобретения

Неожиданно было обнаружено, что модификации аллергенов группы 6 семейства мятликовых (Poaceae), в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6, мутировали по отдельности или в комбинации, понизили IgE реактивность по сравнению с аллергенами немутантного типа и, в то же время, существенно сохранили реактивность в отношении T-лимфоцитов и, таким образом, является гипоаллергенным.

Изобретение, соответственно, касается гипоаллергенных модификаций аллергенов группы 6 семейства мятликовых (Poaceae), в которых пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6, мутировали по отдельности или в комбинации.

Особое предпочтение отдается модификациям аллергенов в соответствии с изобретением, которые отличаются тем, что пролины удалены или замещены.

Предпочтение отдают гипоалергенным модификациям, в соответствии с изобретением, аллергенов группы 6 подсемейства Pooideae, предпочтительно из группы Poodae и Triticodae, предпочтительно представленными Phleum pratense, Holcus lanatus, Phalaris aquatica, Anthoxanthum odoratum, Dactyl is glomerata, Lolium perenne, Poa pratensis, Festuca pratensis, Hordeum vulgare, Secale cereale и Triticum aestivum. Они являются предпочтительно гипоаллергенными модификациями в соответствии с изобретением Tri a 6, Sec c 6 и Hor v 6 с Triticum aestivum, Secale cereale и Hordeum vulgare. Особенное предпочтение отдают гипоаллергенным модификациям в соответствии с изобретением аллергенов группы 6 Poodae. Данные аллергены группы 6 являются, предпочтительно Phl p 6, Poa p 6, Hol p 6, Lol p 6 и Pha a 6 из Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Holcus lanatus и Phalaris aquatica и, особенно предпочтительно, Poa p 6 и Phl p 6, а именно Phl p 6. Все встречающиеся в природе изомеры, полиморфы и модификации аллергенов, упомянутых выше, и их белки-предшественники также находятся в соответствии с изобретением.

В гипоаллергенных модификациях в соответствии с изобретением мутированные пролины являются предпочтительнее чем те, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности зрелого Phl p 6.0101 или его модификаций (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8) или зрелый Phl p 6.0102 (SEQ ID NO: 2), особенно предпочтительно зрелый Phl p 6.0102.

Несмотря на то, что известно, что пролины могут оказывать влияние на структуру протеина, специфические точечные мутации остатков пролинов, как начальная точка для генерации гипоаллергенных мутантов аллергенов, были исследованы всего лишь для основного аллергена группы 2 клеща домашней пыли Dermatophaogides farinae (Der f2, замещение пролиновых остатков на аланин) (Takai et al., 2000, Eur. J. Biochem. 267: 6650-6656). Однако способность IgE связывания и способность стимулировать базофильные клетки была только незначительно снижена в случае трех точковых мутаций, в то время как другие три вели себя как немодифицированный аллерген. Мутации пролина в случае Der f 2, таким образом, показали только очень слабое снижение аллергенности или отсутствовало вовсе. Дальнейшие стратегии для получения гипоаллергенных мутантов путем обменных мутаций пролина еще не опубликованы. Таким образом, квалифицированному специалисту в данной области было бы неожиданным, что мутации пролина являются успешными в качестве исходной точки для создания гипоаллергенных мутаций аллергенов.

Кроме того, до сих пор не исследовано для какого-либо аллергена, как специфическая делеция пролиновых остатков влияет на всеобъемлющую способность IgE связывания продукта экспрессии и какие последствия возникают при активации клеток-эффекторов, относящихся к аллергии.

Аминокислотные последовательности Phl p 6 или двух изоформов (Phl p 6.0101, GenBank: Z27082.1, UniProt: P43215; Phl p 6.0102, GenBank: Y16955, UniProt: 065868) содержат 7 пролиновых остатков (Фиг.1). Пролины в положениях 29, 30, 57, 79 и 101 в аминокислотах расположены непосредственно в начале и в конце α-спиралей или вовлечены в образование протеиновой поверхности (Фиг.2). Пролиновый остаток в положении 61 является частью третей спирали, в то время как пролин 108 расположен вблизи C-терминальной области.

Исходя из аминокислотных последовательностей Phl p 6 изоформ Phl p 6.0101 (SEQ ID NO: 4) и Phl p 6.0102 (SEQ ID NO 2) получены рекомбинантный немодифицированный аллерген немутантного типа (rPhl p 6 wt; Фиг.4) и модификации в соответствии с изобретением, модифицированные путем генной инженерии. Аналогично способу получения, описанному ниже, кроме того, могут быть получены протеины немутантного типа и, в соответствии с изобретением, гипоаллергенные модификации аллергенов группы 6 в соответствии с изобретением мятликовых, например Poa p 6. В связи с этим, пролины, которые соответствуют в первичной структуре пролинам в положениях 29, 30, 57, 79 в аминокислотной последовательности немутантного типа Phl p 6 мутировали по отдельности или в комбинации, преимущественно путем замещения или делеции.

Модификации аллергена в соответствии с изобретением могли бы быть получены исходя из клонированной последовательности ДНК с помощью методов генной инженерии. Процессы получения в соответствии с изобретением известны квалифицированному специалисту в данной области из соответствующих лабораторных методик и публикаций, таких как, например: E.F. Fritsch, J. Sambrook, T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

В дополнение к описанным модификациям аллергенов группы 6 дальнейшее модифицирование в других положениях - например, с целью повышения гипоаллергенности - естественно, также является возможным. Данные модифицирования могут быть, например, введениями, удалениями, замещениями аминокислоты и расщеплениями протеина на фрагменты, а также слияниями протеина или его фрагментов с другими протеинами или пептидами, а также мультимерами посредством слияния одинаковых протеинов или фрагментов.

Фрагменты, в соответствии с изобретением, преимущественно содержат 20-109 аминокислот, преимущественно 30-100 аминокислот, особенно преимущественно 40-90 аминокислот. Модификации, в соответствии с изобретением, дополнительно включают протеины-предшественники, такие как, например, ProPhl p 6, с вышестоящей природной или искусственной сигнальной последовательностью, как изображено, например, на фигурах 18, 19 и 20 (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10). Кроме того, в соответствии с изобретением находятся слитые протеины, содержащие N- или C-терминальные слитые метки (например, His метка, как на Фиг.5 и 6, МВР метка, последовательности, контролирующие экспрессии и др.), гибридные молекулы, такие как, например, слитые с другими аллергенами или их гипоаллергенными модификациями, или слияние фрагментов в какой-либо желаемой последовательности. Кроме того, модификации, в соответствии с изобретением, также включают гомологические последовательности (полиморфы (SNPs), изоморфы), содержащие идентичную аминокислотную последовательность из, по меньшей мере, 80% с соответствующей аллергену немутантного типа группы 6, предпочтительно из, по меньшей мере, 90% с соответствующей аллергену немутантного типа группы 6, особенно предпочтительно из, по меньшей мере, 95% с соответствующей аллергену немутантного типа группы 6. В данных модификациях одна или несколько аминокислот предпочтительно традиционно замещены, например полярная аминокислота замещена другой полярной аминокислотой или нейтральной аминокислотой, однако модификации вследствие нетрадиционного замещения также находятся в соответствии с изобретением. Мультимеры преимущественно включают димеры и тримеры гипоаллергенных модификаций в соответствии с изобретением, связанных линкерной последовательностью или полученных непосредственным слиянием.

Примерами таких модификаций являются модификации Phl p 6.0101, как показано на фигурах 17 и 18 (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8), в которых индивидуальные аминокислоты, которые не имеют отношения к действию в соответствии с изобретением, были заменены, или не хватает трех аминокислот на N-конце, или их последовательности-предшественники, содержащие сигнальные пептиды на N-конце, и т.п. Следующими примерами модификаций в соответствии с изобретением являются полиморфные модификации, такие как, например, два изомера Phl p 6.0101 и их Phl p 6.0102, и дополнительные модификации с замещением одной или более аминокислот, исключением одной или более аминокислоты на N- и/или C-конце или с соответствующей делецией гэпов с аминокислотной последовательности. Более того, в соответствии с изобретением находятся модификации с введением одной или нескольких аминокислот в отдельности в различные положения аминокислотной последовательности или на N- и/или C-конце.

Таким образом, изобретение также касается гипоаллергенных модификаций аллергенов группы 6 мятликовых (Poaceae), отличающийся тем, что он является фрагментом или модификацией гипоаллергенной модификации в соответствии с изобретением, или мультимером одной или более гипоаллергенных модификаций в соответствии с изобретением, или отличающийся тем, что одна или более гипоаллергенных модификаций в соответствии с изобретением или их фрагменты, модификации или мультимеры являются составной частью рекомбинантного слитого протеина.

К тому же, изобретение касается молекулы ДНК, которая кодирует гипоаллергенную модификацию в соответствии с изобретением.

Более того, изобретение касается рекомбинантного вектора экспрессии, который в соответствии с изобретением содержит молекулу ДНК данного типа, функционально связанную с последовательностью, контролирующей экспрессию. Под последовательностью, контролирующей экспрессию, подразумевают, например, промотор или часть последовательности, с помощью которой оказывают влияние на экспрессию протеина-мишени, и который функционально связанный с геном-мишенью, но необязательно должен быть расположен в непосредственной близости от гена-мишени.

Кроме того, изобретение касается организма-хозяина, который не является человеком, трансформированного с помощью молекулы ДНК в соответствии с изобретением или вектора экспрессии в соответствии с изобретением.

Изобретение касается процесса получения гипоаллергенной модификации в соответствии с изобретением путем культивирования организма-хозяина, который не является человеком, в соответствии с изобретением и выделением соответствующей модификации аллергена из культуры.

Приемлемыми организмами-хозяинами, которые не являются человеком, могут быть про- или эукариотические, одно- или многоклеточные организмы, такие как бактерии или дрожжи. Организм-хозяин, которому отдается предпочтение в соответствии с изобретением, является Е. coli.

Влияние делеции одного или двух близко расположенных пролинов на способность IgE связывания Phl p 6 может быть исследовано путем делеции пролинов 29+30 из пролина 57, из пролина 79 и из пролина 101. В протеине немутантного типа Phl p 6, данные пролины расположены в областях петли в начале или конце α-спиралей (Фиг.1; Фиг.2). Пролин 61 и пролин 108 преимущественно являются не модифицированными, так как соответствующие модификации демонстрируют незначительную эффективность. Влияние мутаций пролина в соответствующих гомологичных положениях других аллергенов группы 6 мятликовых в соответствии с изобретением, например Poa p 6, на способность IgE связывания может быть исследовано аналогичным образом.

Для более быстрой очистки с высоким выходом кодирующая ДНК данных исследований обеспечивается последовательностью, кодирующей N-терминальный слитый компонент гексагистидина (+6His) (Фиг.5, SEQ ID NO: 5; Фиг.6, SEQ ID NO: 6). Модификации, свободные от меток, в соответствии с изобретением и протеины немутантного типа, которые могут быть использованы для фармацевтических целей, также очищают стандартными способами и подтверждает результаты протеинов His-метки.

Соответствующим образом получают последовательности, кодирующие протеины, например rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His, rPhl p 6 d[P79] + 6His и rPhl p 6 d[P101] + 6His. Последовательности могут быть экспрессированными во всех известных эукариотических и прокариотических экспрессионных системах, преимущественно в Е. coli. В дальнейшем протеины очищают как растворимые мономеры стандартными способами. Окончательно, чистоту могут контролировать путем анализа в денатурирующем полиакриламидном геле (SDS-PAGE) (Фиг.7).

Аналитическая гель-фильтрация (SEC) в сочетании с рефрактометром (RI детектор) и детектором многоуглового рассеяния света (MALS детектор) позволяет в реальном времени проводить определение молекулярной массы элюированных протеинов (SEC/MALS/RI метод).

Таким образом, анализ rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His, rPhl p 6 d[P79] + 6His и rPhl p 6 d[P101] + 6His с помощью SEC/MALS/RI показывает, что эти модификации в соответствии с изобретением находятся в форме чистых мономеров в растворе (Фиг.8, Таблица 1).

Способность IgE связывания рекомбинантных модификаций в соответствии с изобретением может быть определена способом, в котором протеины иммобилизируют на нитроцеллюлозной мембране и контактируют с IgE антителами отдельных сывороток клинически определенных страдающих от аллергии на пыльцу трав (тест-полоски). Модификации аллергена/комплексы антитела впоследствии окрашивают путем ферментативной реакции (Фиг.9).

В данном способе мутантный rPhl p 6 d[P101] + 6His демонстрирует такое же хорошее IgE связывание, как и немодифицированный аллерген со всеми тестированными сыворотками (Фиг.9). Из этого следует, что делеция пролина 101 имеет незначительное влияние на способность IgE связывания Phl p 6. Данное IgE связывание мутантных rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His является разным в сыворотках страдающих от аллергии на различную пыльцу травы. Это связано с изменениями в составе IgE популяции конкретных страдающих от аллергии по отношению к аффинности и специфической антигенной детерминации IgE антител. Мутантные rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His демонстрируют значительно пониженную IgE реактивность с большинством сывороток по сравнению с немодифицированным rPhl p 6 wt + 6His. Однако наименьшее IgE связывание наблюдается во всех отношениях в случае мутантных rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His (Фиг.9).

Рекомбинантные модификации в соответствии с изобретением могут, кроме того, быть исследованы относительно их способности к связыванию с IgE антителами человека путем исследований IgE ингибирования (EAST). В данном способе взаимодействие аллерген/IgE может быть исследовано в растворе, что позволяет маскировать вмешательство эпитопов исследуемой субстанции, например, благодаря иммобилизации на мембране, чтобы ее исключить.

В представленном примере выбирают две сыворотки страдающих от аллергии на пыльцу травы, которые значительно отличались в способе тест-полоски посредством их IgE связывания с мутантными rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His. Сыворотка Р32 представляет собой группу сывороток, которые демонстрируют постоянно обнаруживаемое IgE связывание с rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His по тест-полоскам (группа "A"), в то время как сыворотку Р82 выбирают как представитель группы сывороток (группа "B"), которая имеет не большую обнаруживаемую реактивность (Фиг.9, Фиг.14).

Используя данный способ исследования, может быть подтверждена пониженная способность IgE связывания мутантных rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His по сравнению с немодифицированным rPhl p 6 wt + 6His, в соответствии с результатами по тест-полоскам (Фиг.10).

Результаты способа тест-полоски, таким образом, не являются обусловленными частичным маскированием IgE эпитопов, а, наоборот, точно отражают пониженную способность IgE связывания растворенных протеинов.

Мутантный rPhl p 6 d[P101] + 6His демонстрирует способность IgE связывания, которая соответствует той, что у аллергена немутантного типа при использовании сыворотки P32 во всем диапазоне концентраций (Фиг.10). При использовании сыворотки P82 наблюдается меньшее IgE связывание только при низких концентрациях протеина, в то время как при высоких концентрациях IgE связывание, в свою очередь, соответствует тому, что у аллергена немутантного типа (Фиг.10).

Таким образом, пониженная способность IgE связывания Phl p 6, в принципе, также является возможной за счет делеции пролинового остатка 101, но данный эффект, по всей видимости, настолько мал, что не может быть обнаружен способом тест-полоски при всех концентрациях, а при низких концентрациях - только путем исследования IgE ингибирования (Фиг.9, Фиг.10).

Пониженная способность IgE связывания мутантных rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His, rPhl p 6 d[P57] + 6His и rPhl p 6 d[P79] + 6His, напротив, легко обнаруживается способом тест-полоски с большинством сывороток страдающих от аллергии и обеспечивается во всем изучаемом диапазоне концентраций в исследованиях IgE ингибирования (Фиг.9, Фиг.10).

В основном это доказывает, что делеция пролиновых остатков из аллергенов группы 6 может понижать способность IgE связывания. С другой стороны, только делеция определенных пролинов в результате приводит к существенно пониженному IgE связыванию.

С помощью исследования с базофильными гранулоцитами клинически страдающего от аллергии на пыльцу определенных трав влияние пониженной способности IgE связывания модификаций в соответствии с изобретением на активацию клеток-эффекторов человека может быть исследовано in vitro.

Гранулоциты, используемые в исследовании, выделяют из цельной крови страдающего от аллергии, в представленном примере страдающий от аллергии P21. Данный страдающий от аллергии представляет тех страдающих от аллергии, чьи IgE антитела демонстрируют обнаруживаемое связывание с rPhl p 6 d[P29, 30] + 6His в способе тест-полоск