Производство активной высокофосфорилированной n-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы человека и ее применение

Производство активной высокофосфорилированной n-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы человека и ее применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США № 61/366714, поданной 22 июля 2010 г. и включенной во всей своей полноте в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Данное изобретение описывает технические области клеточной и молекулярной биологии и медицины, в частности, производство активных высокофосфорилированных лизосомальных ферментов сульфатазы человека и их применение в ведении лизосомальных болезней накопления, связанных с дефицитом лизосомального фермента сульфатазы. В частности, данное изобретение описывает производство активной высокофосфорилированной рекомбинантной человеческой N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS) и ее применение в ведении мукополисахаридоза IVa типа (МПС IVa или синдром Моркио типа А) и других болезней лизосомального накопления, связанных с дефицитом GALNS.

ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Лизосомальные болезни накопления (ЛБН) возникают в результате дефицита специфических лизосомальных ферментов в клетке, играющих важную роль в расщеплении клеточных отходов в лизосоме. Дефицит таких лизосомальных ферментов приводит к накоплению в лизосоме неразложившегося «хранившегося материала», что приводит к опуханию и неправильной функции лизосом и, в конце концов, к повреждению клетки и ткани. Большое число лизосомальных ферментов было выявлено и скоррелировано с соответствующими заболеваниями. Как только будет определен недостающий фермент, лечение может быть сведено к единственной проблеме эффективной доставки требуемого фермента в пораженные ткани пациентов.

[0004] Одним из путей лечения лизосомальных болезней накопления является внутривенная фермент-заместительная терапия (ФЗТ) (Kakkis, Expert Opin. Investig. Drugs 11(5): 675-685, 2002). ФЗТ пользуется преимуществом сосудистой системы для доставки фермента из одного места введения в большинство тканей. Как только фермент распространится по организму, он должен быть захвачен клетками. Основание для захвата клетками состоит в уникальной природе лизосомальных ферментов. Лизосомальные ферменты составляют отдельный класс гликопротеинов, определенных по фосфату в положении 6 терминальных остатков маннозы. Маннозо-6-фосфат связывается с высокой аффинностью и специфичностью рецептором на поверхности большинства клеток (Munier-Lehmann et al., Biochem. Soc. Trans. 24(1): 133-136, 1996; Marnell et al., J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916, 1984). Рецептор маннозо-6-фосфата (MPR), имеющий два сайта связывания маннозо-6-фосфата в полипептидной цепи (Tong et al., J. Biol. Chem. 264:7962-7969, 1989), напрямую захватывает фермент из крови и поставляет в ткани, опосредуя затем внутриклеточную передачу в лизосому.

[0005] Широкомасштабное производство лизосомальных ферментов включает экспрессию в линиях клеток млекопитающих. Цель состоит в предоминирующей секреции рекомбинантного фермента в окружающую среду роста для сбора и дальнейшего процессинга. В идеальной системе для широкомасштабного производства лизосомальных ферментов, фермент будет эффективно фосфорилирован и затем направлен преимущественно к поверхности клетки (т.е. для секреции), а не преимущественно в лизосому. Как описано выше, такой способ выделения фосфорилированных лизосомальных ферментов является прямо противоположным ситуации, происходящей в обычных клетках. Производство линий клеток, используемых для производства лизосомальных ферментов, направлено на максимизацию уровня маннозо-6-фосфата на моль фермента, но для него характерна низкая специфическая продуктивность. In vitro попытки получения лизосомальных ферментов, содержащих высокие уровни молекул маннозо-6-фосфата, привели к переменному успеху (Canfield et al., патент США № 6537785). Фермент in vitro обладает высокими уровнями маннозо-6-фосфата, а также высокими уровнями немодифицированной терминальной маннозы. Конкуренция между маннозо-6-фосфатом и рецепторами маннозы за лизосомальный фермент приводит к необходимости получения высоких доз фермента для эффективности и может привести к большей иммуногенности в ущерб подвергнутому лечению субъекту.

[0006] Сульфатазы составляют уникальный подкласс лизосомальных ферментов. Сульфатазы расщепляют сульфатные эфиры из целого ряда субстратов, включая, например, стероиды, углеводы, протеогликаны и гликолипиды. Все известные эукариотические сульфатазы содержат остаток цистеина в своем каталитическом сайте. Активность сульфатазы требует пост-трансляционной модификации такого остатка цистеина в C_α-формилглицин (FGly). Цистеин для активации FGly пост-трансляционного фермента находится в эндоплазматическом ретикулуме на нескрученных сульфатазах непосредственно после трансляции, перед связыванием сульфатаз с лизосомой (Dierks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11963-11968, 1997). Формилглицин-генерирующий фермент, катализирующий такую реакцию, представлен фактором модификации сульфатазы 1 (SUMF1). Важным в такой уникальной пост-трансляционной модификации является и тот факт, что мутации в SUMF1, приводящие к нарушенному образованию FGly в лизосомальных ферментах сульфатазы, вызывают у человека множественную сульфатазную недостаточность (МСН) (Diez-Ruiz et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 6:355-379, 2005).

[0007] В соответствии с этим, терапевтическая эффективность композиции лизосомального фермента сульфатазы зависит от уровня маннозо-6-фосфата и присутствия активного фермента в композиции.

[0008] Таким образом, в данной области техники существует необходимость в эффективной и продуктивной системе для широкомасштабного производства терапевтически эффективных, активных, высокофосфорилированных лизосомальных ферментов сульфатазы для ведения лизосомальных болезней накопления, вызванных или связанных с дефицитом таких лизосомальных ферментов сульфатазы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Данное изобретение описывает открытие о том, что когда производная линия клеток CHO-K1 (обозначенная как G71), которая является дефективной в эндосомальной ацидификации, разработана для экспрессии рекомбинантного фактора модификации сульфатазы человека 1 (SUMF1), модифицированные клетки G71 вырабатывают высокие уровни активных высокофосфорилированных рекомбинантных лизосомальных ферментов сульфатазы частично путем предотвращения потери материала в лизосомальном компартменте при производстве линии клеток. В одном варианте воплощения изобретение описывает комплементную линию группы клеток END3, которая со-экспрессирует рекомбинантный SUMF1 человека и рекомбинантную N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу (GALNS) человека, что приводит к высокому выходу активного высокофосфорилированного фермента. Типичные линии клеток представлены G71, G71S и их производными, с сохранением требуемого свойства G71, т.е. способности обеспечивать высокий выход активированных высокофосфорилированных рекомбинантных лизосомальных ферментов сульфатазы. Такое применение группы комплементации END3 модифицированной линии клеток CHO-K1, со-экспрессирующих рекомбинантный SUMF1 человека и рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы, будет особенно полезным для производства активных высокофосфорилированных лизосомальных ферментов сульфатазы для использования в ведении лизосомальных болезней накопления фермент-заместительной терапией (ФЗТ).

[0010] В первом аспекте изобретение описывает новейший способ получения активных высокофосфорилированных рекомбинантных лизосомальных ферментов сульфатазы человека или их биологически активных фрагментов, мутантов, вариантов или производных в клетки CHO группы комплементации END3 или ее производном в количествах, обеспечивающих их терапевтическое применение. В обширном варианте воплощения изобретения способ включает следующие этапы: (а) культивация клетки CHO-производной группы комплементации END3 или ее производной; (б) получение первого вектора экспрессии млекопитающих, способного экспрессировать активный высокофосфорилированный рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы человека или его биологически активный фрагмент, мутант, вариант или производное в клетке CHO-производной комплементарной группе END3 или ее производном; (в) получение второго вектора экспрессии млекопитающих, способного экспрессировать рекомбинантный фактор модификации сульфатазы человека 1 (SUMF1) или его биологически активный фрагмент, мутант, вариант или производное в клетке CHO-производной комплементарной группы END3 или ее производном; (г) трансфекция клетки CHO-производной комплементарной группы END3 или ее производного первыми и вторыми векторами экспрессии; (д) выбор и клонирование трансфектанта клетки CHO-производной комплементарной группы END3 или ее производного, который экспрессирует активный высокофосфорилированный рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы человека или ее биологически активный фрагмент, мутант, вариант или производное; и (е) оптимизация способа обработки клеточной культуры для производства высокофосфорилированного рекомбинантного лизосомального фермента сульфатазы человека или ее биологически активного фрагмента, мутанта, варианта или производного. Рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы человека выбирают из группы, состоящей из арилсульфатазы A (ARSA), арилсульфатазы B (ARSB), идуронат-2-сульфатазы (IDS), сульфамидазы/гепарин-N-сульфатазы (SGSH), N-ацетилглюкозамин-сульфатазы (G6S) и N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS).

[0011] Способ включает этапы трансфекции кДНК, кодирующей весь или часть лизосомального фермента сульфатазы, и кДНК, кодирующей весь или часть SUMF1 человека в клетку CHO-производной комплементарной группы END3 или ее производную. В некоторых вариантах воплощения изобретения первый и второй векторы экспрессии, способные экспрессировать кодируемые активные высокофосфорилированные рекомбинантные человеческие лизосомальные ферменты сульфатазы и SUMF1 человека, соответственно, трансфицируются одновременно в клетку CHO-производной комплементарной группы END3 или ее производную. В некоторых вариантах воплощения изобретения первый и второй векторы экспрессии трансфицируются в клетку CHO-производной комплементарной группы END3 или ее производную последовательным образом. В некоторых вариантах воплощения изобретения используют кДНК, кодирующую человеческий лизосомальный фермент сульфатазы полной длины, в то время как в других вариантах воплощения изобретения используют кДНК, кодирующую его биологически активный фрагмент, мутант, вариант или производное. В некоторых вариантах воплощения изобретения используют кДНК, кодирующую SUMF1 человека полной длины, в то время как в других вариантах воплощения изобретения используют кДНК, кодирующую его биологически активный фрагмент, мутант, вариант или производное. В некоторых вариантах воплощения изобретения многочисленные векторы экспрессии используют для трансфера кДНК человеческого лизосомального фермента сульфатазы и SUMF1 человека одновременно или последовательно в клетку CHO-производной комплементарной группы END3 или ее производную. В некоторых вариантах воплощения изобретения используют один вектор экспрессии для трансфера кДНК человеческого лизосомального фермента сульфатазы и SUMF1 человека одновременно в клетку CHO-производной комплементарной группы END3 или ее производную. В предпочтительном варианте воплощения изобретения клетка CHO-производной комплементарной группы клеток END3 или ее производная представлены линией клеток G71, линией клеток G71S, или производным G71 или G71S.

[0012] В предпочтительном варианте воплощения изобретения способ включает получение активного высокофосфорилированного рекомбинантного человеческого лизосомального фермента сульфатазы, например арилсульфатазы A (ARSA), арилсульфатазы B (ARSB), идуронат-2-сульфатазы (IDS), сульфамидазы/гепарин-N-сульфатазы (SGSH), N-ацетилглюкозамин-сульфатазы (G6S) или N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS), из линии клеток CHO комплементарной группы END3 или ее производного. В особенно предпочтительном варианте воплощения изобретения способ включает получение активной высокофосфорилированной рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS) человека из линии клеток CHO комплементарной группы END3 или ее производного. Линия клеток комплементарной группы END3 представлена любой модифицированной линией клеток СНО, которая сохраняет свойства линии клеток комплементарной группы END3, например, дефективная эндосомальная ацидификация. В предпочтительном варианте воплощения изобретения клетка CHO-производной комплементарной группы END3 или ее производная представлены линией клеток G71, линией клеток G71S, или производным G71 или G71S.

[0013] Во втором аспекте данное изобретение описывает линию клеток млекопитающих с дефективной эндосомальной ацидификацией, характеризующуюся своей способностью вырабатывать активные высокофосфорилированные рекомбинантные лизосомальные ферменты сульфатазы человека в количествах, достаточных для терапевтического использования такого лизосомального фермента сульфатазы. В предпочтительных вариантах воплощения изобретение описывает CHO-K1-производные линии клеток комплементарной группы END3, обозначенные G71, G71S, или их производные, которые способны вырабатывать большие количества активных высокофосфорилированных рекомбинантных лизосомальных ферментов сульфатазы человека, что позволяет проводить широкомасштабное производство таких терапевтических лизосомальных ферментов сульфатазы. В более предпочтительных вариантах воплощения изобретения линия клеток экспрессирует и секретирует рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы человеку в количествах по меньшей мере примерно 0,5, предпочтительно по меньшей мере примерно 0,75, более предпочтительно по меньшей мере примерно 1,0, и еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 1,25 пг/клетка/сутки.

[0014] Линия клеток группы комплементации END3 представлена любой модифицированной линией клеток СНО, которая сохраняет свойства линии клеток группы комплементации END3, например, дефективную эндосомальную ацидификацию. В одном варианте воплощения изобретения линию клеток СНО группы комплементации END3 получают из G71 или ее производного, и она включает (а) вектор экспрессии для рекомбинантного фактора модификации сульфатазы человека 1 (SUMF1) и (б) вектор экспрессии для рекомбинантного лизосомального фермента сульфатазы человека, при этом рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы человека выбирают из группы, состоящей из арилсульфатазы A (ARSA), арилсульфатазы B (ARSB), идуронат-2-сульфатазы (IDS), сульфамидазы/гепарин-N-сульфатазы (SGSH), N-ацетилглюкозамин-сульфатазы (G6S) и N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS). В предпочтительном варианте воплощения изобретения линия клеток СНО группы комплементации END3 включает вектор экспрессии для рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS) человека. В более предпочтительном варианте воплощения изобретения линия клеток СНО группы комплементации END3 экспрессирует и секретирует рекомбинантный GALNS человека. В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения линию клеток СНО группы комплементации END3 выбирают из группы, состоящей из клона 4, клона 5, клона C6, клона C2, клона C5, клона C7, клона C10, клона C11 и клона C30. В более предпочтительном варианте воплощения изобретения линия клеток СНО группы комплементации END3 представлена клоном С2. В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения линия клеток СНО группы комплементации END3 адаптирована к росту в суспензии.

[0015] В третьем аспекте изобретение описывает рекомбинантные лизосомальные ферменты сульфатазы человека, получаемые в соответствии со способами по данному изобретению, и, следовательно, они присутствуют в количествах, позволяющих использовать лизосомальные ферменты сульфатазы терапевтическим образом. Лизосомальные ферменты сульфатазы могут быть представлены белками полной длины, или их фрагментами, мутантами, вариантами или производными. В некоторых вариантах воплощения изобретения лизосомальный фермент сульфатазы или его фрагмент, мутант, вариант или производное по данному изобретению могут быть модифицированы, как это необходимо, для повышения его стабильности или фармакокинетических свойств (например, ПЭГилирование, мутагенез, слияние, конъюгация). В предпочтительных вариантах воплощения изобретения фермент представлен лизосомальным ферментом сульфатазы человека, фрагментом лизосомального фермента сульфатазы человека с биологической активностью нативного фермента сульфатазы, или полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, которая по существу гомологична таковой лизосомального фермента сульфатазы человека. В некоторых вариантах воплощения изобретения лизосомальный фермент сульфатазы представлен белком с последовательностью, полученной у человека или млекопитающего, или ее производным. В других вариантах воплощения изобретения дефицит лизосомального фермента сульфатазы приводит к заболеванию человека, такому как метахроматическая лейкодистрофия или МЛД (т.е. дефицит арилсульфатазы A (ARSA)), синдром Марото-Лами или МПС VI типа (т.е. дефицит арилсульфатазы B (ARSB)), синдром Хантера или МПС II типа (т.е. дефицит идуронат-2-сульфатазы (IDS)), синдром Санфилиппо А или МПС IIIa типа (т.е. дефицит сульфамидазы/гепарин-N-сульфатазы (SGSH)), синдром Санфилиппо D или МПС IIId типа (т.е. дефицит N-ацетилглюкозамин-сульфатазы (G6S)) и синдром Моркио A или МПС IVa типа (т.е. дефицит N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS)). В особенно предпочтительном варианте воплощения изобретения дефицит лизосомального фермента сульфатазы приводит к возникновению синдрома Моркио А или МПС IVa типа (т.е. дефицит N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS)). В другом особенно предпочтительном варианте воплощения изобретения дефицит лизосомального фермента сульфатазы связан с заболеванием человека, таким как множественная сульфатазная недостаточность или МСН (т.е. дефицит N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS)).

[0016] Лизосомальный фермент сульфатазы также может иметь последовательность, полученную у человека или млекопитающего, или ее производное. В других вариантах воплощения изобретения в каждом из его аспектов лизосомальный фермент сульфатазы идентичен в своей аминокислотной последовательности соответствующему участку аминокислотной последовательности лизосомального фермента сульфатазы человека или млекопитающего. В других вариантах воплощения изобретения молекула полипептида представлена нативным лизосомальным ферментом сульфатазы из человека или млекопитающего. В других вариантах воплощения изобретения полипептид лизосомального фермента сульфатазы по существу гомологичен (т.е. идентичен по меньшей мере примерно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности) по длине по меньшей мере примерно 25, 50, 100, 150 или 200 аминокислот, или всей длине полипептида, нативной аминокислотной последовательности лизосомального фермента сульфатазы фермента человека или млекопитающего. В некоторых вариантах воплощения изобретения лизосомальный фермент сульфатазы представлен N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазой (GALNS) человека. Аминокислотная последовательность GALNS человека представлена SEQ ID NO:4, из которых аминокислоты 27-522 соответствуют секретируемому белку-предшественнику. В некоторых вариантах воплощения изобретения этот фермент GALNS включает или состоит из аминокислотной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотам 27-522 последовательности SEQ ID NO: 4, или последовательности, идентичной аминокислотам 27-522 последовательности SEQ ID NO: 4. Фермент GALNS преимущественно сохраняет аминокислоты каталитического сайта, соответствующие Цис в положении 53 секретируемого белка-предшественника (аминокислота 79 последовательности SEQ ID NO: 4), способного конвертироваться в C_α-формилглицин. Фермент GALNS также может сохранять другие аминокислоты в области активного сайта, включая по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или все заряженные аминокислоты: Асп288, Асн289, Асп39, Асп54, Гис236, Лиз140, Гис142, Лиз310 и α-спираль: Арг83. Источник Sukegawa, Human Molecular Genetics, 2000, Vol. 9, No. 9 1283-1290, включенный сюда во всей своей полноте посредством ссылки, описывает дополнительные мутации, которые снижают активность GALNS у пациентов и коррелирует со степенью тяжести различных мутаций относительно их соответствующего 3-мерного расположения в ферменте. В других вариантах воплощения изобретения субъект, которому вводят лизосомальный фермент сульфатазы, представлен человеком.

[0017] В предпочтительных вариантах воплощения изобретения лизосомальный фермент сульфатазы является высокофосфорилированным рекомбинантным лизосомальным ферментом сульфатазы человека, выработанным линией клеток с дефицитом эндосомальной ацидификации, например, линией клеток, полученной из СНО-производной группы комплементации END3. Линия клеток группы комплементации END3 представлена любой модифицированной линией клеток СНО, которая сохраняет свойства линии клеток группы комплементации END3, например, дефективную эндосомальную ацидификацию. В предпочтительном варианте воплощения изобретения клетка CHO-производной комплементарной группы клеток END3 или ее производное представлены линией клеток G71, линией клеток G71S, или производным G71 или G71S. С другой стороны, лизосомальный фермент сульфатазы может быть получен в любой клетке-хозяине, например любой линии клеток СНО или линии клеток, полученной из СНО, культивированной в условиях, обеспечивающих экспрессию и секрецию высокофосфорилированного рекомбинантного лизосомального фермента сульфатазы при относительно высоком выходе, например, в количествах, составляющих по меньшей мере примерно 0,5, по меньшей мере примерно 0,75, по меньшей мере примерно 1,0, или по меньшей мере примерно 1,25 пг/клетка/сутки.

[0018] В более предпочтительных вариантах воплощения изобретения рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы человека обладает высоким уровнем фосфорилированных олигосахаридов (т.е. выше чем примерно 0,25, предпочтительно выше 0,5, и более предпочтительно выше примерно 0,75 бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на цепь белка).

[0019] В некоторых вариантах воплощения изобретение описывает рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы человека, например GALNS, с указанным высоким уровнем фосфорилированных олигосахаридов. Например, лизосомальный фермент сульфатазы имеет от 0,5 до 1,0 бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на мономерную белковую цепь, или от 0,5 до 0,9 бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на мономерную белковую цепь, или от 0,5 до 0,8 бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на мономерную белковую цепь, или от 0,5 до 0,75 бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на мономерную белковую цепь, или от 0,54 до 0,75 бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на мономерную белковую цепь. Предусмотрены и другие подобные диапазоны, например, по меньшей мере 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6 или 0,65 бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на мономерную белковую цепь до 0,7; 0,75; 0,8; 0,85; 0,9; 0,95; 0,98 или 1,0 бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на мономерную белковую цепь, или любая комбинация этих чисел. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения фермент представлен рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазой (GALNS) человека, например, с последовательностью SEQ ID NO: 4.

[0020] В некоторых вариантах воплощения изобретения рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы человека имеет высокий процент (т.е. по меньшей мере примерно 50%, 55%, 60% или 65%, предпочтительно по меньшей мере примерно 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%) конверсии остатка цистеина в активном сайте в C_α-формилглицин (FGly). В предпочтительных вариантах воплощения изобретения фермент представлен активной рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазой (GALNS) человека, и остаток цистеина в активном сайте представлен Цис в положении 53 (положение 79 последовательности SEQ ID NO: 4).

[0021] В отдельных вариантах воплощения изобретения рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы человека имеет высокий уровень фосфорилированных олигосахаридов, например, любой диапазон или уровень бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на мономерную белковую цепь, описанные в тексте данной заявки, вместе с высоким процентом конверсии остатка цистеина активного сайта в C_α-формилглицин (FGly), например, любой описанный здесь процентный показатель. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения фермент представлен активной высокофосфорилированной рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазой (GALNS) человека, например, с последовательностью SEQ ID NO: 4.

[0022] В любом из предшествующих вариантов воплощения изобретения по меньшей мере 99,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 65% рекомбинантного лизосомального фермента сульфатазы человека, например, GALNS (SEQ ID NO: 4), находится в форме предшественника, как это определено окрашиванием Кумасси синим при проведении SDS-PAGE в восстанавливающих условиях или SDS-электрофореза в капиллярном геле (SDS-CGE).

[0023] Кроме того, лизосомальный фермент сульфатазы, например GALNS (SEQ ID NO: 4), необязательно обладает специфической активностью, составляющей по меньшей мере примерно 30% (например, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, в 2 раза, в 2,5 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 15 раз, в 20 раз, в 30 раз, в 40 раз или в 50 раз) больше, чем специфическая активность контрольного лизосомального фермента сульфатазы с одинаковой аминокислотной последовательностью, который был получен в клетках-хозяевах (например, клетках СНО или клетках, полученных из СНО), которые не экспрессируют рекомбинантный SUMF1 человека.

[0024] В любом из предшествующих вариантов воплощения изобретения описанный лизосомальный фермент сульфатазы, например, GALNS (SEQ ID NO: 4), характеризуется специфическим захватом (захватом К) фибробластами, и такой показатель составляет от примерно 0,1 до 10 нМ, или от примерно 0,1 до 7 нМ, или от примерно 0,5 до 5 нМ, или от примерно 1 до 5 нМ, или от примерно 1 до 3,5 нМ, примерно 1 нМ, примерно 1,5 нМ, примерно 2 нМ, примерно 2,5 нМ, примерно 3 нМ или примерно 3,5 нМ, или любую комбинацию этих чисел.

[0025] В любом из предшествующих вариантов воплощения изобретения по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 55%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 65%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, или по меньшей мере примерно 80% рекомбинантного лизосомального фермента сульфатазы человека, например GALNS (SEQ ID NO: 4), связывается в колонке с рецептором маннозо-6-фосфата.

[0026] Согласно данному аспекту, описаны очищенные композиции любого из таких вариантов воплощения изобретения с лизосомальным ферментом сульфатазы, в которых компонент лизосомального фермента сульфатазы, например GALNS (SEQ ID NO: 4), имеет чистоту по меньшей мере примерно 90%, 95%, 97%, 98% или 99%, как это определено окрашиванием Кумасси синим при проведении SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях или другим способом определения чистоты (например, SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с последующим окрашиванием Кумасси синим или серебром, или хроматографическим разделением путем ВЭЖХ, включая С4 обращенные фазы (ОФ) или С3 ОФ), или эксклюзионной хроматографией (ЭХ)) В некоторых вариантах воплощения изобретения значительное количество компонента лизосомального фермента сульфатазы очищенной композиции представлено в секретируемой форме предшественника (например, по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98,5%, 99% или 99,5% предшественника), как это определено окрашиванием Кумасси синим при проведении SDS-PAGE в восстанавливающих условиях или другим способом определения предшественника (например, SDS-PAGE в восстанавливающих условиях с последующим окрашиванием Кумасси синим или серебром, или хроматографическим разделением путем ВЭЖХ (например, С4 обращенные фазы (ОФ), С3 ОФ), или эксклюзионной хроматографией (ЭХ), или комбинацией электрофоретического разделения и хроматографического разделения, например, SDS-PAGE с последующим капиллярным гель-электрофорезом (SDS-CGE)).

[0027] В отдельных вариантах воплощения изобретения компонент лизосомального фермента сульфатазы очищенной композиции имеет высокий уровень фосфорилированных олигосахаридов, например, любой диапазон или уровень бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на мономерную белковую цепь, описанные в тексте данной заявки, вместе с высоким процентом конверсии остатка цистеина активного сайта в C_α-формилглицин (FGly), например, любой описанный здесь процентный показатель. В отдельных вариантах воплощения изобретения очищенная композиция характеризуется захватом К, как это описано в тексте данной заявки.

[0028] В родственных аспектах изобретение описывает стерильные композиции, содержащие любой описанный здесь лизосомальный фермент сульфатазы или его очищенную композицию, вместе со стерильным фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем и/или вспомогательным веществом. Такие стерильные композиции могут иметь форму растворов или лиофилизированного порошка, необязательно в пробирках, который может быть восстановлен путем добавления стерильного разбавителя.

[0029] В четвертом аспекте изобретение описывает способ очистки рекомбинантных лизосомальных ферментов сульфатазы человека, полученных способами по данному изобретению. В предпочтительном варианте воплощения изобретения лизосомальные ферменты сульфатазы очищают с использованием двухколоночного процесса (краситель-лигандная хроматография, например Кумасси-сефароза, и катионообменная хроматография, например SE Hi-Cap), включая по меньшей мере пять этапов очистки: (1) фильтрация сбора, т.е. питательной среды из линии клеток CHO группы комплементации END3 или ее производного, экспрессирующей фактор модификации сульфатазы человека 1 (SUMF1) и рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы человека; (2) корректировка pH профильтрованного сбора до pH 4,5 (для индуцирования преципитации контаминантных белков); (3) загрузка pH-скорректированной профильтрованной смеси в колонку с красителем-лигандом, например колонку с Кумасси-сефарозой, промывание колонки и элюирование лизосомального фермента сульфатазы из колонки; (4) загрузка элюата из колонки краситель-лиганд в катионообменную колонку, например колонку SE Hi-Cap, промывание колонки и элюирование лизосомального фермента сульфатазы из колонки; и (5) ультрафильтрация и диафильтрация элюата из катионообменной колонки. Необязательно, профильтрованная смесь из этапа (1) концентрируется в 10-20 раз путем ультрафильтрации перед корректировкой рН. Необязательно, лизосомальный фермент сульфатазы после ультрафильтрации и диафильтрации на этапе (5) соединяется с буфером композиции. В особенно предпочтительном варианте воплощения изобретения лизосомальный фермент представлен рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазой (GALNS) человека.

[0030] В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения лизосомальные ферменты сульфатазы очищаются с использованием трехколоночного процесса (улавливающая хроматография, например, катионообменная SE Hi-Cap; промежуточная хроматография, например, краситель-лиганд Capto Blue, Цинк-хелатная сефароза FF или Capto Adhere; и полирующая хроматография, например, ToyoPearl Butyl 650M, Phenyl Sepharose Hi-Sub или Phenyl Sepharose Low-Sub), включая по меньшей мере пять этапов очистки: (1) ультрафильтрация сбора, т.е. питательной среды из линии клеток CHO группы комплементации END3 или ее производного, экспрессирующей фактор модификации сульфатазы человека 1 (SUMF1) и рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы человека, путем, например, Sartocon Cassettes, (30 кДа, Hydrosart); (2) корректировка pH профильтрованного сбора до pH 4,5 (для индуцирования преципитации контаминантных белков); (3) загрузка pH-скорректированной профильтрованной смеси в улавливающую колонку, например, Fractogel EMD SE Hi-CAP (M) катионообменную колонку, промывание колонки и элюирование лизосомального фермента сульфатазы из колонки; (4) загрузка элюата из улавливающей колонки в промежуточную колонку, например, колонку с красителем-лигандом Capto Blue, цинк-хелатной сефарозой FF или Capto Adhere, промывание колонки и элюирование лизосомального фермента сульфатазы из колонки; и (5) загрузка элюата в полирующую колонку, например, ToyoPearl Butyl 650M, Phenyl Sepharose Hi-Sub или Phenyl Sepharose Low-Sub, промывание колонки и элюирование лизосомального фермента сульфатазы из колонки. Элюированный лизосомальный фермент сульфатазы из этапа (5) соединяется с буфером композиции. Необязательно, элюированный лизосомальный фермент сульфатазы из этапа (5) подвергается ультрафильтрации, и затем соединяется с буфером композиции. Необязательно, рН лизосомального фермента сульфатазы из колонки на этапе (4) устанавливается на уровне 3,5 для вирусной инактивации при низком рН перед загрузкой в полирующую колонку на этапе (5). В особо предпочтительном варианте воплощения изобретения лизосомальный фермент сульфатазы представлен рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазой (GALNS) человека.

[0031] В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения лизосомальные ферменты сульфатазы очищаются с использованием другого трехколоночного процесса (улавливающая или иммобилизационная металл-аффинная хроматография (ИМАХ), например, краситель-лиганд Capto Blue, цинк-хелатная сефароза FF или Capto Adhere; промежуточная хроматография, например, Fractogel EMD SE Hi-Cap катионообменная; и полирующая хроматография, например, ToyoPearl Butyl 650M, Phenyl Sepharose Hi-Sub или Phenyl Sepharose Low-Sub), разработанного для снижения протеолитического расщепления (т.е. усечения) лизосомального фермента сульфатазы, включая по меньшей мере шесть этапов очистки: (1) фильтрация сбора, т.е. питательной среды из линии клеток млекопитающих, например линии клеток CHO группы комплементации END3 или ее производного, экспрессирующей фактор модификации сульфатазы человека 1 (SUMF1) и рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазы человека, ультрафильтрация/диафильтрация профильтрованной среды, например, путем использования кассет Sartocon Cassettes (30 кДа, Hydrosart), с получением концентрированной профильтрованной среды, например, сконцентрированной в 20 раз, и фильтрация активированным углем концентрированной профильтрованной среды; (2) загрузка профильтрованной активированным углем и сконцентрированной среды в улавливающую колонку или колонку ИМАХ, например, краситель-лиганд Capto Blue, цинк-хелатная сефароза FF или Capto Adhere, промывание улавливающей колонки в условиях, при которых лизосомальный фермент сульфатазы остается в улавливающей колонке, и элюирование лизосомального фермента сульфатазы из улавливающей колонки; (3) необязательно, фильтрация элюата из улавливающей колонки через фильтр, например, фильтр Mustang Q, для удаления вирусов; (4) корректировка pH элюата или профильтрованного элюата из улавливающей колонки к кислому pH, например, pH 4,5±0,1, затем фильтрация элюата с кислым подкорректированным pH или профильтрованного элюата из улавливающей колонки; (5) загрузка профильтрованного элюата с корректированным кислым pH или профильтрованного элюата из улавливающей колонки в промежуточную колонку, например, Fractogel EMD SE Hi-CAP катионообменную колонку, промывание промежуточной колонки в условиях, при которых лизосомальный фермент сульфатазы остается в промежуточной колонке, и элюирование лизосомального фермента сульфатазы из промежуточной колонки; (6) корректировка pH элюата из промежуточной колонки до низкого pH, например, pH 3,5±0,1, для инактивации вирусов; и (7) загрузка прошедшего инактивацию вирусов элюата с низким pH из промежуточной катионообменной колонки в полирующую колонку, например, колонку для хроматографии с гидрофобным взаимодействием (ХГВ), например, ToyoPearl Butyl 650M, Phenyl Sepharose Hi-Sub или Phenyl Sepharose Low-Sub, промывание полирующей колонки в условиях, при которых лизосомальный фермент сульфатазы остается в полирующей колонке, и элюирование лизосомального фермента сульфатазы из полирующей колонки. В предпочтительном варианте воплощения изобретения этап (3) включен в процесс очистки. В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения этап (3) исключен из процесса очистки. Необязательно, (8) элюированный лизосомальный фермент сульфатазы из этапа (7) подвергается буфер-обмену с композицией, например, включая, но не ограничиваясь, композиции, описанные в текст