Снижение уровня лактата и увеличение продукции полипептида путем ингибирования экспрессии лактатдегидрогеназы и киназы пируватдегидрогеназы

Снижение уровня лактата и увеличение продукции полипептида путем ингибирования экспрессии лактатдегидрогеназы и киназы пируватдегидрогеназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет для предварительной патентной заявки № 61/349727, поданной 28 мая 2010, содержание которой приводится, таким образом, в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

Область техники настоящего изобретения относится в целом к способам и композициям для снижения продукции лактата и повышения продукции полипептида в культивируемых клетках.

Уровень техники

Биофармацевтический рынок быстро растет, и предполагается, что данная отрасль производства к 2010 году достигнет 70 биллионов долларов США. См. руководство Genetic Engineering in Livestock: New Applications and Interdisciplinary Perspectives (Engelhard et al., 2009) Springer Berlin Heidelberg. Принимая во внимание повышение спроса на терапевтические белки и повышение конкуренции при разделе рынка среди компаний, существует необходимость улучшения технологий для достижения лучшей выработки терапевтических белков. Для достижения этой цели были рассмотрены различные подходы, такие как создание клеток-хозяев. См. статьи Kuystermans et al., Cytotechnology 53(1-3):3-22 (2007) и O’Callaghan and James, Brief Funct. Genomic Proteomic 7(2):95-110 (2008). Культивируемые клетки, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), широко используются для продукции терапевтических белков. Например, для продукции рекомбинантных моноклональных антител широко использовали культивирование в рН-контролируемом биореакторе с подпиткой. Langheinrich and Nienow, Biotechnol. Bioeng. 66(3):171-9 (1999). Лактат представляет собой один из основных накапливаемых в процессе культивирования с подпиткой ненужных продуктов, и, как было показано, он ингибирует рост клеток и продукцию белка. См. статьи Glacken et al., Biotechnol. Bioeng. 32:491-506 (1988); и Lao and Toth, Biotechnol. Prog. 13:688-691 (1997). Это, в свою очередь, приводит к увеличению количества щелочи, которую необходимо добавить в культуральную среду для регуляции величины рН. Dietl et al., J. Immunol. 184(3):1200-9 (2010); Langheinrich and Nienow, Biotechnol. Bioeng, 66(3):171-9 (1999). Увеличенное добавление щелочи к среде культивирования клеток для поддержания величины рН может привести к повышению осмолярности, и это повышение может приводить к ингибированию роста клеток и снижению выработки антител. Cruz et al., Enzyme Microb. Technol. 27(1-2):43-52 (2000); Iran et al., Biotechnol. Bioeng, 66:238-246 (1999). Поэтому при разработке полипептида или способа продукции антитела в более высоком титре желательно снижение уровня лактата.

Существует большое число факторов, которые могут влиять на продукцию лактата в культуре клеток, таких как регуляция уровня пирувата. См. статьи Liu et al., J. Biol. Chem., 284(5):2811-22 (2009); и Samuvel et al., J. of Immunol. 182(4):2476-84 (2009). Пируват представляет собой субстрат для ферментов пируватдегидрогеназы (PDH) и лактатдегидрогеназы (LDH).

Комплекс PDH представляет собой мультиферментную единицу, состоящую из трех каталитических ферментов Е1, Е2 и Е3. Patel and Korotchkina, Exp. Mol. Med. 33(4):191-7 (2001). Этот комплекс катализирует реакцию лимитируемого скоростью превращения пирувата в ацетил-КоА, которое представляет собой начальную точку цикла трикарбоновых кислот (ТСА). Активность PDH регулируется ферментами-киназами пируватдегидрогеназы (PDHK) и фосфатазами пируватдегидрогеназы (PDHP). Киназы PDHK фосфорилируют PDH, супрессируя его ферментативную активность, тогда как PDHP дефосфорилируют и, таким образом, активируют PDH. См. статьи Patel and Korotchkina, Exp. Mol. Med. 33(4):191-7 (2001); Roche and Hiromasa, Cell Mol. Life Sci. 64(7-8):830-49 (2007); Holness and Sugden, Biochemical Society Transactions, 31:1143-1151 (2003). В клетках млекопитающих существует четыре изотипа PDHK (PDHK1, PDHK2, PDHK3 и PDHK4) с тканеспецифическим распределением. См. статьи Harris et al., Adv. Enzyme Regul. 42:249-59 (2002); и Bowker-Kinley et al., Biochem. J. 329(1):191-6 (1998).

LDH непосредственно катализирует взаимное превращение пирувата и лактата с одновременным взаимным превращением NADH и NAD+. В клетках млекопитающих LDH существуют в виде либо гомо-, либо гетеротетрамеров, состоящих главным образом из субъединиц А и В (или субъединиц Н и М, соответственно), кодируемых генами LDHa и LDHb, и иногда гомотетрамеров субъединицы С, кодируемой генами LDHc. См. статьи Baumgart et al., J. Biol. Chem. 271(7):3846-55 (1996); Li et al., J. Biol. Chem. 258(11):7029-32 (1983); Skory C.D., Appl. Environ. Microbiol. 66(6):2343-8 (2000); и Read et al., Proteins 43(2):175-185 (2001). Например, в клетках СНО было показано, что изотипы LDH представляют собой промежуточные продукты тетрамера А3В и А2В2. Jeong et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 289(5):1141-9 (2001). Ранее проведенные исследования показали, что снижение LDHa в клетках СНО путем разрушения гена посредством гомологичной рекомбинации (Chen et al., Biotechnol. Bioeng. 72(1):55-61 (2001)), антисмысловой технологии (Jeong et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 289(5):1141-9 (2001)), или малой, или короткой интерферирующей РНК (siRNA) (Kim and Lee, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74(1):152-9 (2007)) может снижать уровень лактата, но не достигли существенного улучшения в выработке белка. Например, в случае для siRNA, специфичной для LDHa, по имеющимся данным даже при 45-79% снижении уровня лактата не наблюдалось существенного улучшения специфической выработки (Qp) и титра продукта (антитела), это указывает на то, что в клетках СНО нокдаун одной LDHa недостаточен для улучшения Qp и эффективного выхода продукта. Таким образом, для достижения лучшей продукции терапевтического полипептида требуются более эффективные способы снижения продукции лактата.

Все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящем документе, приводятся, таким образом, в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме для всех целей в той же мере, как если бы конкретно и отдельно указывалось, что каждая отдельная публикация, патент и патентная заявка указанным способом приводятся в качестве ссылки.

Краткая сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для снижения в культивируемых клетках продукции лактата и повышения продукции полипептида. Авторы изобретения обнаружили, что в культивируемых клетках, экспрессирующих полипептиды (например, антитела), одновременное снижение LDH и PDHK посредством siRNA понизило уровень лактата, скорость продукции лактата и осмолярность и повысило специфическую выработку полипептида (например, специфическую выработку) и продукцию полипептида (например, выработку). Кроме того, у этих культивируемых клеток со сниженными LDH и PDHK не наблюдалось негативного влияния на рост клеток, жизнеспособность клеток и качество полученных полипептидов.

В одном из аспектов изобретение относится к способу снижения в культивируемых клетках продукции лактата, причем способ содержит культивирование клеток, экспрессирующих а) малую интерферирующую РНК (siRNA), специфичную для лактатдегидрогеназы (LDH), и b) siRNA, специфичную для киназы пируватдегидрогеназы (PDHK).

В другом аспекте изобретение относится к клеткам в культуре, содержащим а) siRNA, специфичную для LDH, и siRNA, специфичную для PDHK.

В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки дополнительно экспрессируют siRNA, специфичную для второй PDHK. В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки дополнительно экспрессируют siRNA, специфичную для третьей PDHK. В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки дополнительно экспрессируют siRNA, специфичную для четвертой PDHK.

В другом аспекте изобретение относится к способу снижения в культивируемых клетках продукции лактата, причем способ содержит культивирование клеток, содержащих последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую малую интерферирующую РНК (siRNA), специфичную для лактатдегидрогеназы (LDH), и последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую siRNA, специфичную для киназы пируватдегидрогеназы (PDHK), где последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана с первым промотором и где последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана со вторым промотором.

В другом аспекте изобретение относится к клеткам в культуре, содержащим последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую первую siRNA, специфичную для LDH, и последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую вторую siRNA, специфичную для PDHK, где последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана с первым промотором и где последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана со вторым промотором.

В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно содержат последовательность третьей гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую siRNA, специфичную для второй PDHK, причем последовательность третьей гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана с третьим промотором. В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно содержат последовательность четвертой гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую siRNA, специфичную для третьей PDHK, причем последовательность четвертой гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана с четвертым промотором. В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно содержат последовательность пятой гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую siRNA, специфичную для пятой PDHK, причем последовательность пятой гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана с пятым промотором.

В некоторых вариантах осуществления LDH представляет собой LDHa, LDHb или LDHc.

В некоторых вариантах осуществления PDHK выбирают из группы, состоящей из PDHK1, PDHK2, PDHK3 и PDHK4. В некоторых вариантах осуществления PDHK выбирают из группы, состоящей из PDHK1, PDHK2, PDHK3. В некоторых вариантах осуществления PDHK выбирают из группы, состоящей из PDHK1 и PDHK2. В некоторых вариантах осуществления PDHK выбирают из группы, состоящей из PDHK1 и PDHK3. В некоторых вариантах осуществления PDHK выбирают из группы, состоящей из PDHK2 и PDHK3.

В некоторых вариантах осуществления способ снижения продукции лактата в культивируемых клетках содержит культивирование клеток, содержащих последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую siRNA, специфичную для лактатдегидрогеназы (LDH), и последовательности второй, третьей и четвертой гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующие три различные siRNA, специфичны для первой, второй и третьей PDHK, где последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана с первым промотором и где последовательности второй, третьей и четвертой гетерологичных нуклеиновых кислот функционально связаны со вторым, третьим и четвертым промоторами, соответственно. В некоторых вариантах осуществления LDH представляет собой LDHa, в этих вариантах осуществления первая PDHK представляет собой PDHK1, вторая PDHK представляет собой PDHK2 и третья PDHK представляет собой PDHK3.

В некоторых вариантах осуществления клетки в культуре содержат последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую первую siRNA, специфичную для LDH, и последовательности второй, третьей и четвертой гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующие три различные siRNA, специфичные для первой, второй и третьей PDHK, где последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана с первым промотором, и где последовательности второй, третьей и четвертой гетерологичных нуклеиновых кислот функционально связаны со вторым, третьим и четвертым промоторами, соответственно. В некоторых вариантах осуществления LDH представляет собой LDHa, в этих вариантах осуществления первая PDHK представляет собой PDHK1, вторая PDHK представляет собой PDHK2 и третья PDHK представляет собой PDHK3.

В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки продуцируют гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полипептид представляет собой антитело.

В некоторых вариантах осуществления скорость синтеза лактата культивируемых клеток ниже, чем скорость потребления лактата. В некоторых вариантах осуществления средняя скорость продукции лактата меньше, чем около 0,02 мг/10⁶ клеток/день со знаком минус.

В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки, содержащие siRNA, специфичные для LDH и PDHK, обладают осмолярностью меньше, чем около 300 мОсм.

В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки обладают специфической выработкой (Qp) по меньшей мере на около 75% выше, чем культивируемые клетки в отсутствие последовательности гетерологичной нуклеиновой кислоты, содержащей PDHK и LDH.

В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки обладают специфической выработкой (Qp) по меньшей мере на около 75% выше, чем культивируемые клетки в отсутствие siRNA, специфичных для LDH и PDHK.

В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки обладают выработкой полипептида (например, выработкой антитела или титром в г/л) на от около 10% до около 800% выше, чем культивируемые клетки в отсутствие последовательности гетерологичной нуклеиновой кислоты, содержащей PDHK и LDH. В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки обладают выработкой полипептида на около 55% выше, чем культивируемые клетки в отсутствие последовательности гетерологичной нуклеиновой кислоты, содержащей PDHK и LDH. В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки обладают выработкой полипептида по меньшей мере на около 68% выше, чем культивируемые клетки в отсутствие последовательности гетерологичной нуклеиновой кислоты, содержащей PDHK и LDH.

В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки обладают выработкой полипептида на от около 10% до около 800% выше, чем культивируемые клетки в отсутствие siRNA, специфичных для PDHK и LDH. В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки обладают выработкой полипептида на около 55% выше, чем культивируемые клетки в отсутствие siRNA, специфичных для PDHK и LDH. В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки обладают выработкой полипептида по меньшей мере на около 68% выше, чем культивируемые клетки в отсутствие siRNA, специфичных для PDHK и LDH.

В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки представляют собой клетки млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки представляют собой клетки, отличные от клеток млекопитающих.

В другом аспекте изобретение относится к способу сайленсинга или снижения транскрипции LDH и PDHK в культивируемых клетках, содержащему: введение в клетку вектора, содержащего последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую siRNA, специфичную для LDH, и последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую siRNA, специфичную для PDHK, где последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана с первым промотором и где последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана со вторым промотором, причем siRNA экспрессируются, что приводит к сайленсингу или снижению транскрипции генов LDH и PDHK.

В другом аспекте изобретение относится к способу создания клетки, у которой в культуре наблюдается сниженная продукция лактата, содержащему введение в клетку вектора, содержащего последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую siRNA, специфичную для LDH, и последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую siRNA, специфичную для PDHK, где последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана с первым промотором и где последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана со вторым промотором.

В другом аспекте изобретение относится к вектору, содержащему последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую малую интерферирующую РНК (siRNA), специфичную для лактатдегидрогеназы (LDH), и последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую siRNA, специфичную для киназы пируватдегидрогеназы (PDHK), где последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана с первым промотором и где последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана со вторым промотором.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена конструкция siRNA, нацеливающая LDHa/PDHK1, 2, 3. siRNA, нацеливающие LDHa, PDHK1, PDHK2 и PDHK3, клонировали в один вектор pSilencer 3.1, содержащий последовательность гигромицина. Последовательность, нацеленная на LDHa, находилась под контролем промотора U6, тогда как siRNA для PDHK1, 2 и 3 находились под контролем промотора Н1.

На фиг.2 представлены относительные уровни экспрессии мРНК LDHa, PDHK1, 2 и 3 в выбранных 12 клонах siRNA (показано светло-серым цветом). Уровни экспрессии LDHa и PDHK нормализовали к гену домашнего хозяйства b-микроглобулина. Средние уровни экспрессии мРНК 12 модельных клонов показаны темно-серым цветом.

На фиг.3 представлены профили лактата, средние скорости продукции лактата и величины рН на 14 день при оценке во встряхиваемом сосуде с подпиткой. Концентрации лактата измеряли, используя анализатор Nova, в дни 3, 7, 10 и 14 в течение 14-дневной оценки встряхиваемого сосуда. 3А). Профиль лактата модельного клона (темно-серый) и клонов siRNA (светло-серый); 3В). Средняя скорость продукции лактата между 3 и 14 днями (мг/10⁶ клеток/день); и 3С). Величины рН на 14 день. Эксперименты во встряхиваемом сосуде с подпиткой осуществляли 3 раза, и представлены данные эксперимента 1.

На фиг.4 представлены титр, специфическая выработка (Qp) и профили клеточного роста при оценке во встряхиваемой колбе с подпиткой. 4А). титр (выработка) в г/л на 14 день; 4В). Специфическая выработка в пг/клетка/день; и 4С). Измерение клеточного роста путем общего подсчета жизнеспособных клеток (IVCC) в 100 миллионах клеток на день на литр. Модельные клоны темно-серого цвета, а клоны siRNA светло-серые.

На фиг.5 представлены профиль лактата, средние скорости продукции лактата и профиль осмолярности при оценках в биореакторе объемом 2 л. 5А). Профиль лактата; 5В). Средние скорости продукции лактата; и 5С). Профиль осмолярности.

На фиг.6 представлен профиль выработки культивируемых клеток, содержащих siRNA, модельные или родительские клоны, при оценке в биореакторе объемом 2 л.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для снижения продукции лактата и повышения продукции полипептида в культивируемых клетках. Авторы изобретения обнаружили, что совместное снижение LDH и PDHK посредством siRNA способом, известным как РНК-интерференция (RNAi), в культивируемых клетках, экспрессирующих полипептиды (например, антитела), уменьшило уровень лактата, скорость продукции лактата и осмолярность клеток и повысило специфическую выработку полипептида (например, специфическую выработку) и продукцию полипептида (например, выработку). Кроме того, у этих культивируемых клеток со сниженными LDH и PDHK не наблюдалось негативного влияния на рост клеток, жизнеспособность клеток и качество полученных полипептидов. Таким образом, не касаясь теории, уменьшение превращения пируват-лактат путем нокдауна экспрессии LDH и усиление вхождения пирувата в цикл трикарбоновых кислот (ТСА или цикл Кребса) путем нокдауна экспрессии одной или нескольких PDHK может создать синергический эффект в снижении лактата и обеспечении клеток большей энергией и промежуточными продуктами метаболизма. Эти эффекты, в свою очередь, могут привести к повышенной продукции полипептида (например, антитела) в культивируемых клетках.

Соответственно, в одном из аспектов изобретения предлагается способ снижения продукции лактата в культивируемых клетках, содержащий культивирование клеток, экспрессирующих а) siRNA, специфичную для LDH, и b) siRNA, специфичную для PDHK.

В другом аспекте предлагаются клетки в культуре, содержащие а) siRNA, специфичную для LDH, и siRNA, специфичную для PDHK.

В другом аспекте изобретение относится к способу снижения продукции лактата в культивируемых клетках, содержащему культивирование клеток, содержащих последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую siRNA, специфичную для LDH, и последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую siRNA, специфичную для PDHK, где последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана с первым промотором и последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана со вторым промотором.

В еще одном аспекте изобретение относится к клеткам в культуре, содержащим последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую первую siRNA, специфичную для LDH, и последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую вторую siRNA, специфичную для PDHK, где последовательность первой гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана с первым промотором и последовательность второй гетерологичной нуклеиновой кислоты функционально связана со вторым промотором.

При осуществлении настоящего изобретения будут использованы, если не указано другое, принятые техники молекулярной биологии (включая рекомбинантные техники), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Такие техники полностью объясняются в литературе, такой как руководства (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Определения

Используемый в настоящем документе термин «клетки в культуре» или «культивируемые клетки» относится к двум или больше клеткам в растворе (например, среде для клеток), который дает возможность осуществления одного или нескольких клеточных делений.

Термин «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота», используемый в настоящем документе взаимозаменяемо, относится к полимерам нуклеотидов любой длины, и к нему относятся ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания и/или их аналоги или любой субстрат, который может быть встроен в полимер с помощью ДНК- или РНК-полимеразы. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. При наличии модификацию в нуклеотидной структуре можно осуществить до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана компонентами, отличными от нуклеотидов. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с меченым компонентом. К другим типам модификаций относятся, например, «кэпы», замена одного или нескольких природных нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, межнуклеотидные модификации незаряженными связями (например, метилфосфонатами, фосфотриэфирами, фосфоамидаты, карбаматы и т.д.) и заряженными связями (например, фосфоротиоатами, фосфородитиоатами и т.д.), модификации, содержащие подвешенные фрагменты, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), модификации интеркаляторами (например, акридином, псораленом и т.д.), модификации, содержащие хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, металлы-окислители и т.д.), модификации, содержащие алкиляторы, модификации модифицированными связями (например, альфа-аномерными нуклеиновыми кислотами и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующая в сахарах, может быть заменена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищенными стандартными защитными группами или активированными для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или может быть конъюгирована с твердыми подложками. 5’ и 3’-концевой ОН может быть фосфорилирован или замещен аминами или фрагментами органической кэппирующей группы из 1-20 атомов углерода. Можно также получить производные других гидроксилов со стандартными защитными группами. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы сахаров рибоз или дезоксирибоз, которые в основном известны в данной области, к ним относятся, например, 2’-О-метил-, 2’-O-аллил, 2’-фтор- или 2’-азидорибоза, карбоциклические аналоги сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные формы сахаров, фуранозные формы сахаров, седогептулозы, ациклические аналоги и основные аналоги нуклеозидов, такие как метилрибозид. Одна или несколько фосфодиэфирных связей могут быть замещены альтернативными связующими группами. К этим альтернативным связующим группам относятся, но ими не ограничиваясь, варианты осуществления, в которых фосфат замещают на P(O)S(«тиоат»), P(S)S («дитиоат»), (O)NR₂ («амидат»), P(O)R, P(O)OR’, CO или CH₂ («формацеталь»), в которых каждый R или R’ независимо представляет собой Н или замещенный, или незамещенный алкил (1-20 С), необязательно содержащий эфирную (-О-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Предшествующее описание применимо ко всем полинуклеотидам, относящимся к настоящему документу, к которым относятся РНК и ДНК.

Термин «РНК-интерференция (RNAi)» относится к способу специфичного для последовательности сайленсинга на уровне транскрипции генов (например, посттранскрипционного сайленсинга генов), опосредованного или инициированного с помощью siRNA. Не касаясь теории, в процессе RNAi при осуществлении способов по изобретению siRNA может индуцировать деградацию мРНК-мишени с последующим специфичным для последовательности ингибированием экспрессии генов LDH и одной или нескольких PDHK.

Термин «гетерологичная нуклеиновая кислота» или «гетерологичный полипептид» относится к нуклеиновой кислоте или полипептиду, последовательность которых не идентична последовательности другой нуклеиновой кислоты или полипептида, обнаруживаемых в той же клетке-хозяине в природе.

Термин «малая интерферирующая РНК», «короткая интерферирующая РНК» или «siRNA» относится к РНК-дуплексу нуклеотидов или в некоторых альтернативных аспектах единичной молекуле РНК, которая нацеливается на интересующую нуклеиновую кислоту, например, LDH или PDHK. siRNA содержит смысловую цепь РНК и комплементарную антисмысловую цепь РНК, отжигаемые вместе за счет взаимодействий стандартного спаривания оснований Уотсона-Крика. siRNA может быть либо непосредственно трансфицирована в культивируемые клетки, либо получена в них иным образом.

В одной из вариаций смысловая цепь РНК и комплементарная антисмысловая цепь РНК связываются спайсером, что приводит к экспрессии структуры типа стебель-петля или шпилька, обозначаемой короткой шпилькой РНК (shRNA). Шпилька затем расщепляется эндонуклеазой (например, Dicer) с образованием siRNA. В другой вариации shRNA представляет собой бифункциональную shRNA, состоящую из двух структур типа стебель-петля, причем одна из структур стебель-петля состоит из полностью совместимой последовательности, направляющей РНК-дуплекс на деградацию мРНК через загрузку в RISC (РНК-индуцированный комплекс сайленсинга), зависящую от расщепления, и вторая структура стебель-петля составлена из ошибочно спаренной цепи, ингибирующей трансляцию мРНК путем секвестрации мРНК через загрузку в RISC независимо от расщепления.

Используемая в настоящем документе siRNA, «специфичная» для LDH или PDHK, относится к siRNA, которая нацеливается на интересующую нуклеиновую кислоту (например, LDH или PDHK) и нуклеотидная последовательность участка дуплекса siRNA которой комплементарна нуклеотидной последовательности нацеленного гена (например, LDH или PDHK).

Используемый в настоящем документе термин «функционально связанный» относится к функциональному взаимодействию между двумя или больше сегментами нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Обычно он относится к функциональному взаимодействию последовательности, регулирующей транскрипцию, с транскрибируемой последовательностью. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, такой как нуклеиновая кислота по изобретению, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине или другой экспрессирующей системе. Как правило, промоторные последовательности, регулирующие транскрипцию, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, физически прилегают к транскрибируемой последовательности, т.е. они действуют в цис-положении. Тем не менее, некоторые последовательности, регулирующие транскрипцию, такие как энхансеры, необязательно физически прилегают или расположены в непосредственной близости от кодирующих последовательностей, транскрипцию которых они усиливают.

К используемому в настоящем документе термину «промотор» относятся все последовательности, способные запускать транскрипцию кодирующей последовательности в культивируемой клетке, например, клетке млекопитающего. Таким образом, промоторы, использованные в конструкциях по изобретению, включают контролирующие транскрипцию элементы, действующие в цис-положении, и регуляторные последовательности, которые вовлечены в регуляцию или модуляцию тайминга и/или скорости транскрипции гена (например, LDH или PDHK). Например, промотор может представлять собой контролирующий транскрипцию элемент, действующий в цис-положении, включающий энхансер, промотор, терминатор транскрипции, точку начала репликации, последовательность интеграции в хромосому, 5’ и 3’ нетранслируемые регионы или интронную последовательность, которые вовлечены в регуляцию транскрипции. Эти последовательности, действующие в цис-положении, обычно взаимодействуют с белками или другими биомолекулами для осуществления (запуска/ остановки, регуляции, модуляции и т.д.) транскрипции. «Конститутивные» промоторы представляют собой промоторы, которые запускают экспрессию постоянно в большинстве условий среды и определяют развитие или дифференциацию клеток. «Индуцибельные» или «регулируемые» промоторы направляют экспрессию нуклеиновой кислоты по изобретению под влиянием условий окружающей среды или условий развития. К примерам условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию посредством индуцибельных промоторов, относятся анаэробные условия, повышенная температура, засуха или наличие света.

Используемый в настоящем документе «вектор» означает конструкцию, которая способна доставить и предпочтительно экспрессировать в клетке-хозяине один или несколько интересующих генов или последовательностей (например, LDH или PDHK). К примерам векторов относятся, но ими не ограничиваясь, вирусные векторы, экспрессирующие векторы на основе голой ДНК или РНК, плазмида, космида или фаговые векторы, экспрессирующие векторы на основе ДНК или РНК, ассоциированные с катионными конденсирующими агентами, экспрессирующие векторы на основе ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомы, и некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты. Подходящие векторы представляют собой такие векторы, которые совместимы с используемой клеткой-хозяином. Подходящие векторы могут происходить, например, из бактерии, вируса (такого как бактериофаг Т7 или фаг М-13), космиды, дрожжевого гриба или растения. Протоколы получения и применения таких векторов известны в данной области (см., например, руководство Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor, 1989).

Используемую в настоящем документе среднюю скорость продукции лактата рассчитывают как скорость синтеза лактата минус скорость потребления лактата в мг/клетки/день.

Используемая в настоящем документе «специфическая выработка» или «Qp» относится к скорости продукции специфического белка, например, антитела, выраженной в пг/клетка/день. Специфическую выработку рассчитывают как титр белка (пг/клетка/день)/IVCC (рассчитанное общее число жизнеспособных клеток; клетка/день).

Термины «полипептид» и «белок» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и он может быть прерван соединениями, отличными от аминокислот. Термины также охватывают полимер аминокислот, который был модифицирован в природе или путем вмешательства; например, образованием дисульфидной связи, гликозилированием, липидированием, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией или модификацией, такой как конъюгация с меченым компонентом. Также определение охватывает, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (к которым относятся, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области.

Термин «антитело» используется в самом широком смысле и конкретно охватывает моноклональные антитела (к которым относятся полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител.

«Фрагменты антитела» содержат участок полноразмерного антитела, как правило, его антиген-связывающий или вариабельный регион. К примерам фрагментов антител относятся фрагменты Fab, Fab’, F(ab’)₂ и Fv; одноцепочечные молекулы антител; диатела; линейные антитела; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Термин «моноклональное антитело», используемый в настоящем документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высоко специфичны, являясь направленными против одного антигенного сайта. Более того, в противоположность препаратам традиционных (поликлональных) антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на антигене. Определение «моноклональное» указывает на природу антитела как полученного по существу из гомогенной популяции антител и не должно быть истолковано как требующее продукции антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, используемые по настоящему изобретению, могут быть созданы посредством гибридомного способа, впервые описанного Kohleret et al, Nature 256:495 (1975), или могут быть созданы с помощью способов рекомбинантных ДНК (см., например, пат. США № 4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из фаговых библиотек антител, используя техники, описанные в статьях Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), например.

К моноклональным антителам в настоящем документе конкретно относятся «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых участок тяжелой и/или легкой цепи идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям антител, полученных из конкретного вида или относящихся к определенному классу или подклассу антител, тогда как остальная(ые) цепь(и) идентична(ы) или гомологична(ы) соответствующим последовательностям антител, полученных из другого вида или относящихся к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что у них наблюдается желаемая биологическая активность (пат. США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Термин «гипервариабельный регион», используемый в настоящем документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельный регион содержит аминокислотные остатки из «региона, определяющего комплементарность» или «CDR» (т.е. остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological I