Стабильное при хранении жидкое моющее или чистящее средство, содержащее протеазу и целлюлазу

Стабильное при хранении жидкое моющее или чистящее средство, содержащее протеазу и целлюлазу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области жидких моющих или чистящих средств. В частности, изобретение относится к содержащим ферменты жидким моющим и чистящим средствам, которые содержат определенные протеазы в комбинации с целлюлазой, а также к способу применения подобных средств. Кроме того, изобретение относится к применению определенных протеаз в жидких моющих или чистящих средствах, которые содержат целлюлазу.

В моющих и чистящих средствах предпочтительно используют протеазы типа субтилизина. Используемые в известных из уровня техники моющих или чистящих средствах протеазы своим первоначальным происхождением обязаны микроорганизмам, например, родов Bacillus, Streptomyces, Humicola или Pseudomonas, и/или их производят известными методами биотехнологии с помощью соответствующих микроорганизмов, например трансгенных хозяев для экспрессии родов Bacillus или элементарных нитевидных грибов.

В частности, современные жидкие моющие средства в растущих количествах содержат другие ферменты, в особенности целлюлазы (эндоглюканазы). Целлюлаза является ферментом, катализирующим гидролиз 1,4-β-D-глюкозидных связей целлюлозы (целлобиозы), лихенина и/или β-D-глюкананов. Целлюлазы нередко способны гидролизовать также 1,4-связи β-D-глюканов, которые помимо 1,4-связей содержат также 1,3-связи. Согласно принятой Комиссией по ферментам (ЕС) цифровой системе классификации ферментов целлюлазам соответствует ЕС-номер 3.2.1.4, и в соответствии с этим они относятся к третьему из шести основных классов ферментов, то есть к гидролазам Е.С.3.-.-.-, а именно к гликозилазам (Е.С.3.2.-.-) и, на более низком уровне, к гликозидазам (Е.С.3.2.1.-), то есть к ферментам, которые гидролизуют О- и/или S-гликозильные соединения. Целлюлазы способны расщеплять целлюлозу до β-глюкозы. Следовательно, целлюлазы при стирке прежде всего оказывают воздействие на содержащие целлюлозу или ее производные остатки и катализируют их гидролиз.

В международной заявке WO 95/23221 описаны протеазы, соответственно варианты протеазы типа субтилизина из Bacillus lentus DSM 5483, пригодные для использования в моющих или чистящих средствах. В одной из указанных протеаз может быть заменена также аминокислота R99E, A, S или G. Кроме того, моющие средства согласно цитируемой заявке могут содержать другие ферменты, к которым относится также целлюлаза. Моющие средства могут быть твердыми или жидкими. Однако в цитируемой публикации отсутствует непосредственная и однозначная информация о жидком моющем средстве, содержащем целлюлазу в комбинации с протеазой, которая в положении 99 в качестве аминокислоты содержит глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D), аспарагин (N) или глутамин (Q), или аланин (А), глицин (G) или серин (S). То же относится и к европейскому патенту ЕР 1921147.

Недостаток содержащих протеазу и целлюлазу жидких моющих и чистящих средств уровня техники состоит в том, что они обладают недостаточной стабильностью при хранении, а следовательно, уже спустя короткое время в значительной мере утрачивают целлюлолитическую и/или протеолитическую, прежде всего целлюлолитическую активность. Присутствие протеазы часто приводит к потере целлюлолитической активности, поскольку протеаза дезактивирует целлюлазу. При этом моющее или чистящее средство утрачивает оптимальную эффективность очистки.

В основу настоящего изобретения была положена задача устранить указанный выше недостаток и предложить содержащие протеазу и целлюлазу жидкие моющие или чистящие средства, которые обладают достаточной, соответственно повышенной стабильностью при хранении, что прежде всего относится к их целлюлолитической активности.

В соответствии с этим объектом настоящего изобретения является жидкое моющее или чистящее средство, включающее:

(а1) протеазу, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности, и которая в положении 99 при отсчете согласно SEQ ID NO. 1 содержит в качестве аминокислоты глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D),

(а2) протеазу, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности, и которая в положении 99 при отсчете согласно SEQ ID NO. 1 содержит в качестве аминокислоты аспарагин (N) или глутамин (Q), или

(a3) протеазу, которая содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности, и которая в положении 99 при отсчете согласно SEQ ID NO. 1 содержит в качестве аминокислоты аланин (а), глицин (G) или серин (S), и

(b) целлюлазу.

Неожиданно было обнаружено, что жидкое моющее или чистящее средство, которое содержит комбинацию указанной выше протеазы с целлюлазой, предпочтительно обладает стабильностью при хранении. В частности, оно обладает более высокой целлюлолитической активностью после хранения по сравнению с моющим или чистящим средством, которое отличается от предлагаемого в изобретении средства лишь присутствующей в соответствующем средстве протеазой, причем в подлежащих сравнению средствах протеаза в начале хранения присутствует в такой же концентрации (в пересчете на активный фермент). Таким образом, предусматриваемая в настоящем изобретении протеаза обеспечивает пониженную дезактивацию целлюлазы. Однако пониженная дезактивация целлюлазы посредством используемой в соответствии с настоящим изобретением протеазы не обусловлена недостаточной активностью последней.

Кроме того, предлагаемое в изобретении средство отличается соответствующей, преимущественно высокой, в частности, предпочтительной эффективностью удаления чувствительных к протеазе загрязнений. Подобная эффективность очистки по отношению по меньшей мере к одному чувствительному к протеазе загрязнению проявляется также, в частности, при низких температурах, например, в температурном интервале от 10 до 50°С, предпочтительно от 10 до 40°С или от 20 до 40°С. Таким образом, предлагаемое в изобретении средство обеспечивает удовлетворительное или более эффективное удаление по меньшей мере одного загрязнения, предпочтительно нескольких чувствительных к протеазе загрязнений текстильных изделий и/или твердых поверхностей, например поверхностей посуды.

Таким образом, в отличие от цитированной в начале описания международной заявки WO 95/23221 в настоящем изобретении речь идет об особенно предпочтительном выборе, приводящем к получению эффективного и стабильного при хранении жидкого моющего средства, что прежде всего относится к его протеолитической и/или целлюлолитической активности, соответственно остаточной активности после хранения.

Согласно изобретению под эффективностью очистки подразумевают способность отбеливать одно или несколько загрязнений, прежде всего загрязнений белья. Примерами подобных загрязнений являются пятна крови-молока/туши на хлопке, цельного яйца/пигмента на хлопке, шоколада-молока/туши на хлопке, арахисового масла-пигмента/туши на сложном полиэфире/хлопке, травы на хлопке или какао на хлопке, в частности такие, как указано ниже. В соответствии с изобретением соответствующей эффективностью очистки обладает как моющее или чистящее средство, которое содержит протеазу и целлюлазу, соответственно образуемый этим средством моющий, соответственно чистящий раствор, так и сама протеаза, соответственно целлюлаза. Таким образом, присущая ферментам эффективность очистки способствует эффективности очистки средством, соответственно образуемым средством моющим, соответственно чистящим раствором. Эффективность очистки предпочтительно определяют, как указано ниже.

Под моющим, соответственно чистящим раствором подразумевают содержащий моющее или чистящее средство рабочий раствор, который воздействует на текстильные изделия или ткань (моющий раствор), соответственно на твердые поверхности (чистящий раствор), а, следовательно, вступает в контакт с загрязнениями, находящимися на текстильные изделиях, соответственно тканях, или на твердых поверхностях. Моющий, соответственно чистящий раствор обычно образуется на начальной стадии процесса стирки или чистки, например, в результате разбавления моющего или чистящего средства водой в стиральной машине или другой пригодной емкости.

В соответствии с настоящим изобретением предлагаемое в изобретении моющее или чистящее средство обладает стабильностью при хранении, если после хранения оно характеризуется более высокой активностью целлюлазы по сравнению с контрольной композицией, которая отличается от предлагаемого в изобретении моющего или чистящего средства лишь содержащейся в ней протеазой. Таким образом, предлагаемое в изобретении моющее или чистящее средство после хранения характеризуется более высокой активностью целлюлазы по сравнению с контрольной композицией. Оба подлежащих сравнению средства в начале хранения содержат одинаковое количество целлюлазы, соответственно обладают одинаковой концентрацией целлюлазы и/или одинаковой целлюлолитической исходной активностью. Кроме того, в начале хранения протеаза присутствует в обоих средствах в одинаковой концентрации в пересчете на активный фермент, и оба средства обрабатывают одинаковым образом, что прежде всего относится к условиям их хранения и определению ферментативной активности. Хранение средств предпочтительно осуществляют (в порядке возрастания) в течение по меньшей мере 24 часов, 48 часов, 72 часов, пяти дней, одной недели, двух недель, трех недель, четырех недели или восьми недель. Хранение предпочтительно осуществляют при температуре 20°С, 25°С или 30°С, особенно предпочтительно при 30°С.

Ферментативную активность можно определять обычно используемыми для этого методами, которые реализуют в соответствие с типом соответствующего фермента. Методы определения активности известны специалистам в области технологии ферментов, и их используют в установленном порядке. Методы определения активности протеазы опубликованы, например, в Tenside, том 7 (1970), c.125-132. Кроме того, протеолитическую активность можно определять путем высвобождения хромофорного пара-нитроанилина (pNA) из субстрата suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-п-нитроанилид (suc-AAPF-pNA). Протеаза расщепляет субстрат и высвобождает пара-нитроанилин. Высвобождение pNA обусловливает усиление поглощения при 410 нм, зависимость которого от времени является мерой ферментативной активности (смотри Del Mar и другие, 1979). Измерения осуществляют при температуре 25°С, показателе рН 8,6 и длине волны 410 нм. Время измерения составляет 5 минут при интервале измерений от 20 до 60 секунд. Активность протеазы предпочтительно указывают в РЕ (единицах протеазы).

Активность целлюлазы определяют обычно используемыми для этого методами. Активность целлюлазы предпочтительно определяют, как указано ниже. Целлюлазы высвобождают из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) глюкозу. Подлежащие исследованию образцы инкубируют в определенных условиях реакции (100 ммолей натрийфосфатного буфера, рН 7,5, 40°С, 15 минут) совместно с субстратом (1,25% КМЦ). Образцы реагируют с гидразидом п-гидроксибензойной кислоты в присутствии висмута с образованием желтого окрашивающего вещества, которое может быть определено фотометрически при 410 нм. Необходимым условием является щелочной показатель рН во время реакции окрашивания. При этом мерой ферментативной активности является окрашивание соответствующего количества высвобождаемого сахара (смотри Lever, Anal. Biochem., 1972, 47 & 1977, 81).

Стабилизацию ферментов в соответствии с настоящим изобретением особенно предпочтительно определяют, как указано выше, с использованием содержащего протеазу и целлюлазу жидкого моющего или чистящего средства, которое хранят в течение по меньшей мере четырех, но не более восьми недель при температуре 30°С, причем протеолитическую активность определяют путем высвобождения хромофорного пара-нитроанилина из субстрата suc-AAPF-pNA, в то время как целлюлолитическую активность определяют, как указано выше.

Протеаза, присутствующая в предлагаемом в изобретении моющем или чистящем средстве, содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и которая в положении 99 при отсчете согласно SEQ ID NO. 1 содержит в качестве аминокислоты глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D), аспарагин (N) или глутамин (Q), или аланин (А), глицин (G) или серин (S). Аминокислотная последовательность предпочтительно идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности в порядке возрастания по меньшей мере на 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и еще более предпочтительно на 99%. SEQ ID NO. 1 является последовательностью зрелой щелочной протеазы из Bacillus lentus DSM 5483, опубликованной в международной заявке WO 92/21760, которую следует считать соответствующей ссылкой.

Согласно изобретению обнаружено, что благодаря добавлению подобной протеазы к жидкому моющему или чистящему средству, которое содержит целлюлазу, получают особенно стабильное при хранении жидкое моющее средство, что прежде всего относится к остающейся после хранения целлюлолитической активности, в частности, после хранения, длительность которого в порядке возрастания предпочтительно составляет 24 часа, 48 часов, 72 часов, пять дней, одну неделю, две недели, три недели, четыре недели или восемь недель.

Протеаза, содержащаяся в предлагаемом в изобретении моющем или чистящем средстве, обладает протеолитической активностью, то есть способностью гидролизовать пептидные связи полипептида, соответственно белка. Таким образом, она является ферментом, катализирующим гидролиз пептидных связей, а следовательно, способным расщеплять пептиды или белки. Протеазой прежде всего является субтилаза, особенно предпочтительно субтилизин.

Целлюлаза является ферментом указанного в начале описания типа. Для обозначения целлюлазы можно использовать термины-синонимы, в частности эндоглюканаза, эндо-1,4-бета-глюканаза, карбоксиметилцеллюлаза, эндо-1,4-бета-D-глюканаза, бета-1,4-глюканаза, бета-1,4-эндоглюкангидро-лаза, целлудекстриназа или авицелаза. Решающее значение для определения, является тот или иной фермент соответствующей настоящему изобретению целлюлазой, имеет способность этого фермента гидролизовать 1,4-β-D-глюкозидные связи целлюлозы.

К поставляемым на рынок сбыта целлюлазам (эндоглюканазам) согласно изобретению относится, например, обогащенный эндоглюканазой грибовидный препарат целлюлазы, соответственно его усовершенствованные варианты, поставляемые фирмой Novozymes под торговым названием Celluzyme®. Выпускаемые этой фирмой продукты Endolase® и Carezyme® основаны на 50 kD-EG, соответственно 43 kD-EG из Humicola Insolens DSM 1800. Другими используемыми товарными продуктами указанной фирмы являются, Cellusoft®, Renozyme® и Celluclean®. Кроме того, можно использовать, например, целлюлазы, поставляемые фирмой АВ Enzymes (Финляндия) под торговыми названиями Ecostone® и Biotouch®, которые по меньшей мере частично основаны на 20 kD-EG из черноплодки. Другими поставляемыми фирмой АВ Enzymes целлюлазами являются Econase® и Ecopulp®. К другим пригодным целлюлазам относятся целлюлазы из Bacillus sp. CBS 670.93 и CBS 669.93, причем целлюлазы из Bacillus sp. CBS 670.93 под торговым названием Puradax® поставляет фирма Danisco/Genencor. Другими используемыми товарными продуктами фирмы Danisco/Genencor являются ʺGenencor detergent cellulase Lʺ и IndiAge®Neutra.

Согласно изобретению можно использовать также варианты указанных выше ферментов, которые могут быть получены посредством точечных мутаций. Особенно предпочтительными целлюлазами являются варианты целлюлазы из Thielavia terrestris, описанные в международной заявке WO 98/12307, целлюлазы из Melanocarpus, в частности из Melanocarpus albomyces, описанные в международной заявке WO 97/14804, целлюлазы типа EGIII из Trichoderma reesei, описанные в европейском патенте ЕР 1305432, соответственно варианты, которые могут быть получены из указанных целлюлаз, в частности, описанные в европейских патентах ЕР 1240525 и ЕР 1305432, а также целлюлазы, описанные в международных заявках WO 1992006165, WO 96/29397 и WO 02/099091. Соответствующие публикации и относящийся к ним объем раскрытия следует считать относящимися к настоящей заявке ссылками.

Согласно другому варианту осуществления изобретения моющее или чистящее средство отличается тем, что протеаза содержит также по меньшей мере одну из следующих аминокислот (при отсчете положений согласно SEQ ID NO. 1):

(a) треонин в положении 3 (3Т),

(b) изолейцин в положении 4 (4I),

(c) аланин, треонин или аргинин в положении 61 (61А, 61Т или 61R),

(d) аспарагиновую или глутаминовую кислоту в положении 154 (154D или 154Е),

(e) пролин в положении 188 (188Р),

(f) метионин в положении 193 (193М),

(g) изолейцин в положении 199 (199I),

(h) аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или глицин в положении 211 (211D, 211Е или 211G),

(i) комбинации аминокислот от (а) до (h).

Таким образом, протеаза помимо одной из указанных аминокислот, находящейся в положении 99, содержит в соответствующих положениях одну или несколько аминокислот из приведенного выше перечня. Аминокислоты из этого перечня могут придавать протеазам другие предпочтительные свойства и/или дополнительно усиливать те свойства, которыми они уже обладают. Указанные выше аминокислоты способствуют, в частности, повышению протеолитической активности и/или стабильности протеаз в жидком моющем или чистящем средстве, соответственно в образуемом этим моющим или чистящим средством моющем растворе. Таким образом, благодаря добавлению подобной протеазы к жидкому моющему или чистящему средству, которое содержит целлюлазу, получают также особенно стабильное при хранении жидкое моющее средство, что прежде всего относится не только к остающейся после хранения целлюлолитической активности, но и предпочтительно также к остающейся после хранения протеолитической активности, в частности, после хранения, длительность которого предпочтительно составляет в порядке возрастания 24 часа, 48 часов, 72 часов, пять дней, одну неделю, две недели, три недели, четыре недели или восемь недель. Кроме того, подобное средство обладает повышенной эффективностью очистки чувствительных к протеазе и/или целлюлазе загрязнений.

При этом положения аминокислот задают путем выравнивания аминокислотной последовательности подлежащей использованию протеазы из Bacillus lentus в соответствии с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO. 1. Поскольку протеаза из Bacillus lentus в уровне техники представляет собой важный молекулярный эталон для описания протеазы и изменений аминокислот, при упорядочении положений аминокислот предпочтительно следует ссылаться на их отсчет в протеазе из Bacillus lentus (SEQ ID NO. 1). Кроме того, при отсчете положений аминокислот руководствуются их положением в зрелом белке. Подобное упорядочение прежде всего необходимо соблюдать также в том случае, если аминокислотная последовательность подлежащей использованию протеазы содержит большее число аминокислотных остатков, чем протеаза из Bacillus lentus согласно SEQ ID NO. 1. Исходя из указанных положений в аминокислотной последовательности протеазы из Bacillus lentus, положения аминокислот в подлежащей использованию согласно изобретению протеазе аналогичны именно тем, которые приписаны им при выравнивании.

Таким образом, при выравнивании в соответствии с SEQ ID NO. 1, а следовательно, при отсчете согласно SEQ ID NO. 1 помимо положения 99 особенно предпочтительными должны являться положения 3, 4, 61, 154, 188, 193, 199 и 211. В указанных положениях в молекуле протеазы из Bacillus lentus природного типа находятся аминокислотные остатки S3, V4, G61, S154, А188, V193, V199 и L211. Особенно предпочтительными являются аминокислоты 3Т, 4I, 61А, 154D, 154Е, 211D, 211G и 211Е, если соответствующие положения в подлежащей использованию согласно изобретению протеазе уже не заняты одной из этих предпочтительных аминокислот. Замены 3Т и 4I, например, благодаря стабилизирующему воздействию на молекулу приводят к повышению стабильности при хранении и чистящей эффективности протеазы, а следовательно, к повышению эффективности очистки предлагаемым в изобретении жидким моющим или чистящим средством, которое содержит протеазу.

При реализации соответствующего положения одной или нескольких указанных выше аминокислот помимо положения 99 имеют место другие отклонения от последовательности SEQ ID NO. 1, поскольку эта последовательность содержит в соответствующем положении другую аминокислоту. Следовательно, в зависимости от числа имеющихся отклонений от последовательности SEQ ID NO. 1 получают разные максимальные значения идентичности, которыми может обладать подлежащая использованию согласно изобретению протеаза, даже если во всех прочих аминокислотах они должны совпадать с SEQ ID NO. 1. Данное обстоятельство в конкретном случае следует учитывать для каждой возможной комбинации предлагаемых аминокислот, а также в зависимости от длины аминокислотной последовательности протеазы. Так, например, максимальная идентичность при одном, двух, три, четырех, пяти, шести, семи, восьми или девяти изменениях аминокислотной последовательности составляет 99,63%, 99,26%, 98,88%, 98,51%, 98,14%, 97,77%, 97,40%, 97,03%, соответственно 96,65% в случае последовательности, состоящей из 269 аминокислот, соответственно 99,64%, 99,27%, 98,91%, 98,55%, 98,18%, 97,82%, 97,45%, 97,09%, соответственно 96,73% в случае последовательности, состоящей из 275 аминокислот.

Идентичность последовательностей нуклеиновых или аминокислот определяют путем сравнения этих последовательностей. Сравнение осуществляют, сопоставляя друг с другом аналогичные чередования в последовательностях нуклеотидов или последовательностях аминокислот. Подобное сравнение, предпочтительно выполняемое на основе широко известного и обычно используемого в уровне техники алгоритма BLAST (смотри, например, Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) ʺBasic local alignment search tool.ʺ J. Mol. Biol. 215:403-410, а также Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller and David J. Lipman (1997): ʺGapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programsʺ; Nucleic Acids Res., 25, c.3389-3402), в принципе состоит в сопоставлении друг с другом аналогичных чередований нуклеотидов или аминокислот в последовательностях нуклеиновых кислот, соответственно аминокислот. Представленное в табличной форме упорядочение соответствующих положений называют выравниванием. Другим доступным из уровня техники алгоритмом является алгоритм FASTA. Сравнение последовательностей (выравнивание), в особенности сравнение сложных последовательностей обычно выполняют с помощью компьютерных программ. Так, например, часто используют серию программ Clustal (смотри, например, Chenna и другие (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research. 31, 3497-3500), T-Coffee (смотри, например, Notredame и другие (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) или программы, основанные на указанных выше программах, соответственно алгоритмах. Согласно настоящему изобретению сравнения последовательностей и выравнивания предпочтительно осуществляют, используя компьютерную программу Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Карлсбад, Калифорния, США) с заданными (по умолчанию) стандартными параметрами.

Указанное сравнение позволяет судить о подобии сравниваемых последовательностей. Подобие обычно указывают в процентах идентичности, что соответствует доле идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков в одинаковых или соответствующих друг другу положениях при выравнивании. Другой относящийся к гомологии термин используют в случае консервативных замен аминокислот в последовательностях аминокислот, то есть аминокислот с подобными свойствами, поскольку последние в составе белка чаще всего обладают аналогичными активностями, соответственно функциями. Таким образом, подобие сравниваемых последовательностей может быть указано также в процентах гомологии или в процентах подобия. Касающиеся идентичности и/или гомологии данные могут относиться к целым полипептидам или генам или лишь к отдельным участкам последовательностей. Следовательно, гомологи, соответственно идентичные участки разных последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот определяются совпадениями в последовательностях. Подобные участки часто обладают одинаковыми или подобными функциями. Они могут быть короткими участками, состоящими лишь из небольшого числа нуклеотидов, соответственно аминокислот. Подобные короткие участки часто выполняют весьма важные для общей активности белка функции. В связи с этим целесообразным может быть отнесение соответствий последовательностей лишь к отдельным, при необходимости коротким участкам. Однако в соответствии с настоящим изобретением в отсутствие особых указаний данные, касающиеся идентичности, соответственно гомологии, относятся ко всей длине соответствующей указанной последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот.

В другом варианте данного объекта изобретения моющее или чистящее средство отличается тем, что протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая, как указано выше, идентична указанной в SEQ ID NO. 1 аминокислотной последовательности и которую получают (соответственно которая может быть получена) из протеазы согласно SEQ ID NO. 1 путем однократного или многократного консервативного замещения аминокислот, причем, как указано выше, в протеазе в положении 99 по-прежнему присутствует одна из предусматриваемых для указанного положения аминокислот. Термин «консервативное замещение аминокислот» означает замену (замещение) аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, причем подобная замена не приводит к изменению полярности или заряда замененной в указанном положении аминокислоты: так, например, речь идет о замене неполярного аминокислотного остатка другим неполярным аминокислотным остатком. В соответствии с изобретением консервативными замещениями аминокислот являются, например, G=A=S, I=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.

В другом варианте осуществления изобретения предлагаемое в изобретении моющее или чистящее средство отличается также тем, что эффективность выполняемой им очистки по меньшей мере соответствует эффективности очистки моющим или чистящим средством, содержащим протеазу, которая включает аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 или SEQ ID NO. 8, особенно предпочтительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO. 2. Эффективность очистки определяют в системе стирки, которая содержит включающее целлюлазу моющее средство в дозировке от 2,0 до 9,0 граммов на литр моющего раствора, а также протеазу, причем подлежащие сравнению протеазы используют в одинаковой концентрации (в пересчете на активный белок) и причем определяют эффективность удаления одного или нескольких загрязнений кровь-молоко/тушь на хлопке, цельное яйцо/пигмент (яичный меланж/сажа) на хлопке, арахисовое масло-пигмент/тушь на сложном полиэфире/хлопке и трава на хлопке, в частности, одного или нескольких следующих загрязнений:

- кровь-молоко/тушь на хлопке: продукт Nr. C-05, который может быть поставлен CFT (Центром по испытанию материалов, B.V. Влаардинген, Нидерланды),

- цельное яйцо/пигмент (яичный меланж/сажа) на хлопке: продукт Nr. 10N, который может быть поставлен фирмой wfk Testgewebe GmbH (Брюгген-Брахт, Германия), или продукт C-S-37, который может быть предоставлен CFT (Центром по испытанию материалов, B.V. Влаардинген, Нидерланды),

- арахисовое масло-пигмент/тушь на сложном полиэфире/хлопке: продукт Nr. PC-10, который может быть поставлен CFT (Центром по испытанию материалов, B.V. Влаардинген, Нидерланды),

- трава на хлопке: продукт Nr. 164, который может быть поставлен фирмой Eidgenossische Material- und Prufanstalt (EMPA) Testmaterialien AG (St. Gallen, Швейцария),

путем измерения степени белизны подвергнутых стирке текстильных изделий, процесс стирки которых реализуют в течение по меньшей мере 30 минут, при необходимости в течение 60 минут, при температуре 20°С и жесткости воды от 15,5 до 16,5° (немецкая жесткость).

Моющее средство для системы стирки является жидким моющим средством, которое обладает следующим составом (все данные указаны в массовых процентах): от 0,3 до 0,5% ксантана, от 0,2 до 0,4% антивспенивающего средства, от 6 до 7% глицерина, от 0,3 до 0,5% этанола, от 4 до 7% сульфоэфира жирного спирта, от 24 до 28% неионных поверхностно-активных веществ, 1% борной кислоты, от 1 до 2% цитрата натрия (дигидрата), от 2 до 4% соды, от 14 до 16% жирных кислот кокосовых орехов, 0,5% 1-гидроксиэтан-(1,1-дифосфоновой кислоты), от 0 до 0,4% поливинилпирролидона, от 0 до 0,05% оптических отбеливателей, от 0 до 0,001% красителя, от 0,0002 до 0,06% целлюлазы (активного белка), в качестве которой предпочтительно используют препарат целлюлазы Ecostone N400® фирмы АВ Enzymes, остальное деминерализованная вода. Протеазу в моющем средстве используют в концентрации от 0,001 до 0,1%, предпочтительно от 0,01 до 0,06% (в пересчете на активный белок). Дозировка жидкого моющего средства составляет от 2,0 до 9,0, предпочтительно от 3,0 до 8,2 и от 4,0 до 7,5 граммов на литр моющего раствора, особенно предпочтительно 4,7 граммов на литр моющего раствора. Стирку осуществляют при показателе рН в диапазоне от 8 до 10,5, предпочтительно от 8 до 9. Значения активности в моющем растворе как протеазы, так и целлюлазы в начале стирки отличаются от ноля.

Степень белизны, то есть отбеливания загрязнений, в качестве меры эффективности очистки определяют оптическими методами измерения, предпочтительно фотометрически. Пригодным для этой цели прибором является, например, спектрометр Minolta CM508d. Используемые для измерения приборы обычно подвергают предварительной калибровке с белым стандартом, который предпочтительно поставляют вместе с прибором.

В другом варианте осуществления изобретения моющее или чистящее средство отличается также тем, что его стабильность при хранении по меньшей мере соответствует стабильности при хранении моющего или чистящего средства, которое содержит протеазу, включающую аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности в SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 или SEQ ID NO. 8, особенно предпочтительно в SEQ ID NO. 2. Предлагаемое в изобретении моющее или чистящее средство обладает подобной стабильностью при хранении в том случае, если после хранения в течение восьми недель при 30°С активность содержащейся в нем целлюлазы соответствует активности целлюлазы, содержащейся в используемом для сравнения моющем или чистящем средстве, или превышает ее, причем предлагаемое в изобретении средство отличается от используемого для сравнения моющего или чистящего средства лишь содержащейся в нем протеазой.

Под используемым для сравнения средством особенно предпочтительно подразумевают жидкое моющее средство, которое обладает следующим составом (все данные указаны в массовых процентах): от 0,3 до 0,5% ксантана, от 0,2 до 0,4% антивспенивающего средства, от 6 до 7% глицерина, от 0,3 до 0,5% этанола, от 4 до 7% сульфоэфира жирного спирта, от 24 до 28% неионных поверхностно-активных веществ, 1% борной кислоты, от 1 до 2% цитрата натрия (дигидрата), от 2 до 4% соды, от 14 до 16% жирных кислот кокосовых орехов, 0,5% 1-гидроксиэтан-(1,1-дифосфоновой кислоты), от 0 до 0,4% поливинилпирролидона, от 0 до 0,05% оптических отбеливателей, от 0 до 0,001% красителя, от 0,0002 до 0,06% целлюлазы (активного белка), в качестве которой предпочтительно используют препарат целлюлазы Ecostone N400® фирмы АВ Enzymes, остальное деминерализованная вода. Протеазу используют в моющем средстве в концентрации от 0,001 до 0,1%, предпочтительно от 0,01 до 0,06% (в пересчете на активный белок).

В начале хранения оба подлежащих сравнению средства обладают одинаковой исходной целлюлолитической активностью, содержат протеазу в одинаковой концентрации (в пересчете на активный фермент) и оба средства подвергают обработке одинаковым методом. Протеолитическую активность в соответствующих средствах определяют посредством высвобождения хромофора (пара-нитроанилина, pNA) из субстрата suc-AAPF-pNA, в то время как соответствующую целлюлолитическую активность определяют, как указано выше. Значения исходной активности протеазы и целлюлазы в соответствующих средствах отличаются от ноля.

Использование обладающей одинаковой активностью соответствующей целлюлазы и протеаз с одинаковым диапазоном концентраций (в пересчете на активный белок) позволяет сравнивать реальные ферментативные свойства также и при возможном несоответствии отношений активного вещества к общему белку (удельной активности).

Согласно настоящему изобретению в отсутствие особых указаний соответствующие количественные данные приводят в пересчете на массу жидкого моющего средства.

Многочисленные протеазы, в частности субтилизины, образуются в виде так называемых пребелков, то есть совместно с пропептидом и сигнальным пептидом, причем функция сигнального пептида обычно заключается в обеспечении выведения протеазы из продуцирующей ее клетки в периплазму или окружающую клетку среду, тогда как пропептид обычно необходим для корректного образования складчатой структуры протеазы. Сигнальный пептид и пропептид, как правило, являются N-концевой частью пребелка. Сигнальный пептид в природных условиях отщепляется от остальной протеазы посредством сигнальной пептидазы. Затем происходит поддерживаемое пропептидом корректное окончательное формирование складчатой структуры протеазы. В этом случае протеаза находится в своей активной форме и сама отщепляет пропептид. После отщепления пропептида зрелая протеаза, прежде всего субтилизин, проявляет присущую ей каталитическую активность без первоначально присутствовавших N-концевых аминокислот. Для технического применения в общем случае и, в частности, в соответствии с настоящим изобретением, более предпочтительными, чем пребелки, являются зрелые протеазы, то есть участвующие в процессе ферменты после их получения. Кроме того, протеазы из продуцирующих их клеток после формировния полипептидной цепи можно модифицировать, например, путем присоединения молекул сахара, формилирования, аминирования и так далее. Подобные модификации являются посттрансляционными модификациями и могут, однако, не должны оказывать влияние на функцию протеазы.

Кроме того, зрелая протеаза может быть укорочена с ее N- и/или C-концов, вследствие чего предлагаемое в изобретении моющее или чистящее средство содержит протеазу, укороченную по сравнению с SEQ ID NO. 1, соответственно SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 или SEQ ID NO. 8, то есть фрагмент. В этом случае любые касающиеся идентичности данные относятся к участку, на котором соответствующий фрагмент при выравнивании приведен в соответствие с SEQ ID NO. 1. Однако соответствующий фрагмент в каждом случае включает положение, которое при выравнивании приведено в соответствие с положением 99 SEQ ID NO. 1, и в этом положении содержит соответствующую аминокислоту. В предпочтительном варианте фрагмент включает также одно или несколько других указанных выше положений, в которых он содержит соответствующую аминокислоту. Кроме того, подобный фрагмент обладает протеолитической активностью. Соответствующий другой предпочтительный фрагмент включает аминокислотную последовательность, которая на протяжениии по меньшей мере 50 или по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267 или 268 взаимосвязанных положений аминокислот совпадает с SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 или SEQ ID NO. 8 с учетом указанных выше аминокислот в положении 99 и при необходимости также в положениях 3, 4, 61, 154, 188, 193, 199 и/или 211. Эффективность очистки предлагаемым в изобретении жидким моющим или чистящим средством с подобным фрагментом и/или стабильность подобного средства при хранении особенно предпочтительно по меньшей мере аналогичны таковым, характерным для моющего или чистящего средства, которое включает протеазу, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности в SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 или SEQ ID NO. 8, соответственно определена, как указано выше.

Другим объектом настоящего изобретения является жидкое моющее или чистящее средство, содержащее:

(а) протеазу, выбранную из группы, включающей:

а. протеазу, содержащую аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 или SEQ ID NO. 8,

b. протеазу, которая по меньшей мере в одном поло