Чистящие композиции, содержащие варианты амилазы в соответствии с перечнем последовательностей

Чистящие композиции, содержащие варианты амилазы в соответствии с перечнем последовательностей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на перечень последовательностей

Данная заявка содержит перечень последовательностей в форме, которую способен прочитать компьютер. Форма, которую способен прочитать компьютер, включена в данную заявку путем ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к чистящим композициям, содержащим варианты альфа-амилазы, которые имеют улучшенную чистящую эффективность по сравнению с их родительской амилазой в процессах обработки поверхности в холодной воде.

Уровень техники

Альфа-амилазы (альфа-1,4-глюкан-4-глюканогидролазы, Е.С. 3.2.1.1) составляют группу ферментов, которые катализируют гидролиз крахмала и других линейных и разветвленных 1,4-глюкозидных олиго- и полисахаридов.

Среди первых бактериальных альфа-амилаз, которые использовались, были альфа-амилаза из B. licheniformis, также известная как термамил, который в значительной степени был охарактеризован, и для данного фермента была определена кристаллическая структура. Щелочные амилазы, такие как альфа-амилаза, полученные из Bacillus sp., как раскрыто в WO 95/26397, образуют конкретную группу альфа-амилаз, которые нашли применение в моющих средствах. Большинство из данных известных бактериальных амилаз были модифицированы для того, чтобы улучшить их функциональность в конкретном применении.

Способы повышения термостабильности альфа-амилаз были хорошо изучены. Suzuki et al. (1989) раскрывает химерные альфа-амилазы, в которых конкретные области В. amyloliquefaciens альфа-амилазы замещены на соответствующие области В. licheniformis альфа-амилазы. Химерные альфа-амилазы были сконструированы с целью идентифицирования областей, отвечающих за термостабильность. Обнаружено, что такие области включают аминокислотные остатки 177-186 и аминокислотные остатки 255-270 В. amyloliquefaciens альфа-амилазы. Igarashi et al. 1998 показали, что термостабильность амилаз AmyS-типа может быть повышена путем делеции двух аминокислотных остатков, R179-G180, (AmyS нумерация) из петли (от F 178 до А184). Однако, Shiau et al. (2003) показали, что AmyS фермент с делецией в той же петле имеет более низкую специфическую активность для гидролиза кукурузного крахмала при высокой температуре, чем исходный фермент, отрицая одно из принципиальных преимуществ AmyS амилаз.

По экологическим причинам все более важным было понизить температуру в процессах стирки, мытья посуды и/или очистки. Тем не менее, большинство ферментов, включая амилазы, имеют оптимальную температуру, которая является выше температуры, обычно используемой в низкотемпературной стирке. Альфа-амилаза является ключевым ферментом для использования в композициях моющего средства, и ее использование становится все более важным для удаления крахмалистых пятен во время стирки белья или мытья посуды. Таким образом, важно найти варианты альфа-амилазы, которые сохраняют свою моющую эффективность, эффект и/или активность по удалению пятен при снижении температуры. Однако, несмотря на эффективность, имеющихся на данный момент ферментных композиций моющих средств, существует много пятен, которые трудно удалить полностью. Данные проблемы усложняются возросшим использованием низких температур стирки (например, холодная вода) и более коротких циклов стирки. Таким образом, желательно иметь амилолитические ферменты, которые могут функционировать при низкой температуре и в тоже время сохранять или повышать другие желательные свойства, такие как удельная активность (амилолитическая активность), стабильность и/или моющая эффективность.

Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение чистящих композиций, содержащих варианты альфа-амилаз, которые могут быть использованы в процессах стирки, мытья посуды и/или очистки при низких температурах, таких как температуры 5-35°С. Дополнительной целью настоящего изобретения является обеспечение вариантов альфа-амилазы, которые имеют улучшенную моющую эффективность при низких температурах по сравнению с родительской альфа-амилазой или по сравнению с альфа-амилазой с любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12.

Сущность изобретения

В первом аспекте изобретение обеспечивает чистящую композицию, содержащую:

(а) вариант родительской альфа-амилазы, содержащий изменение в двух или больше (нескольких) положениях, соответствующих положениям G304, W140, W189, D134, Е260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 и G477 зрелого полипептида SEQ ID NO: 1, при этом каждое изменение независимо представляет собой замещение, делецию или вставку, и причем вариант имеет, по меньшей мере, 80% или, по меньшей мере, 87%, но меньше, чем 100% идентичность последовательности со зрелым полипептидом любой из SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, и при этом вариант имеет активность альфа-амилазы;

(b) и чистящее вспомогательное вещество, предпочтительно, в количестве от 0,01 до 99,9 мас. %.

Изобретение также обеспечивает способ обработки поверхности, предпочтительно текстиля, который включает стадии, на которых:

(i) образовывают водный моющий раствор, содержащий воду и чистящую композицию, содержащую:

(a) вариант родительской альфа-амилазы, содержащий изменение в двух или больше (нескольких) положениях, соответствующих положениям G304, W140, W189, D134, Е260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 и G477 зрелого полипептида SEQ ID NO: 1, при этом каждое изменение независимо представляет собой замещение, делецию или вставку, и причем вариант имеет, по меньшей мере, 80% или, по меньшей мере, 87%, но меньше, чем 100% идентичность последовательности со зрелым полипептидом любой из SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, и при этом вариант имеет активность альфа-амилазы; и

(b) и чистящее вспомогательное вещество, предпочтительно, в количестве от 0,01 до 99,9 мас. %;

(ii) обрабатывают поверхность водным моющим раствором, предпочтительно, при температуре 40°C или меньше, или, более предпочтительно, при температуре 30°C или меньше, наиболее предпочтительно, при температуре 20°C или меньше; и

(iii) промывают поверхность.

В соответствии со следующим аспектом изобретения обеспечена чистящая композиция, содержащая: вариант родительской альфа-амилазы, содержащий изменение в двух или больше (нескольких) положениях, соответствующих положениям G304, W140, W189, D134, Е260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 и G477 зрелого полипептида SEQ ID NO: 1, при этом каждое изменение независимо представляет собой замещение, делецию или вставку, и причем вариант имеет, по меньшей мере, 80%, или, по меньшей мере, 87%, но меньше, чем 100% идентичность последовательности со зрелым полипептидом любой из SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, и при этом вариант имеет, активность альфа-амилазы; и чистящее вспомогательное вещество, предпочтительно в количестве от 0,01 до 99,9 мас. %.

Изобретение также обеспечивает способ обработки поверхности, предпочтительно текстиля, который включает стадии, на которых:

(i) образовывают водный моющий раствор, содержащий воду и такую чистящую композицию,

(ii) обрабатывают поверхность водным моющим раствором, предпочтительно, при температуре 40°С или меньше, или, более предпочтительно, при температуре 30°С или меньше, наиболее предпочтительно, при температуре 20°С или меньше; и

(iii) промывают поверхность.

Детальное описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает чистящую композицию, содержащую:

(a) вариант родительской альфа-амилазы, содержащий изменение в двух или больше (нескольких) положениях, соответствующих положениям G304, W140, W189, D134, Е260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 и G477 зрелого полипептида SEQ ID NO: 1, при этом каждое изменение независимо представляет собой замещение, делецию или вставку, и причем вариант имеет, по меньшей мере, 80%, или, по меньшей мере, 87%, но меньше, чем 100% идентичность последовательности со зрелым полипептидом любой из SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, и при этом вариант имеет, активность альфа-амилазы;

(b) чистящее вспомогательное вещество, предпочтительно в количестве от 0,01 до 99,9 мас. %.

Определения

Активность альфа-амилазы: Термин «активность альфа-амилазы» означает активность альфа-1,4-глюкан-4-глюканогидролаз, Е.С. 3.2.1.1, которые составляют группу ферментов, которые катализируют гидролиз крахмала и других линейных и разветвленных 1,4-глюкозидных олиго- и полисахаридов.

Вариант: Термин «вариант» означает полипептид, имеющий активность альфа-амилазы, который включает изменение, то есть замещение, вставку и/или делецию, в одном или больше (нескольких) положениях. Замещение означает замену аминокислоты, занимающей положение, на отличающуюся аминокислоту; делеция означает удаление аминокислоты, занимающей положение; и вставка означает добавление 1-3 аминокислот по соседству к аминокислоте, занимающей положение.

Мутант: Термин «мутант» означает полинуклеотид, кодирующий вариант.

Фермент дикого типа: Термин альфа-амилаза «дикого типа» означает альфа-амилазу, экспрессированную существующим в природе микроорганизмом, таким как бактерия, дрожжи или нитчатый гриб, найденный в природе.

Родитель или родительская альфа-амилаза: Термин «родитель» или «родительская альфа-амилаза» означает альфа-амилазу, в которой изменение делают для того, чтобы получить варианты фермента в соответствии с настоящим изобретением. Родитель может быть встречающимся в природе (дикого типа) полипептидом или его вариантом.

Выделенный вариант: Термин «выделенный вариант» означает вариант, который является модифицированным руками человека. В одном аспекте, вариант является, по меньшей мере, на 1% чистым, например, по меньшей мере, на 5% чистым, по меньшей мере, на 10% чистым, по меньшей мере, на 20% чистым, по меньшей мере, на 40% чистым, по меньшей мере, на 60% чистым, по меньшей мере, на 80% чистым, и, по меньшей мере, на 90% чистым, как определено с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза.

По существу чистый вариант: Термин «по существу чистый вариант» означает препарат, который содержит не больше, чем 10%, не больше, чем 8%, не больше, чем 6%, не больше, чем 5%, не больше, чем 4%, не больше, чем 3%, не больше, чем 2%, не больше, чем 1%, и не больше, чем 0,5% по массе другого полипептидного материала, с которым он нативно или рекомбинантно связан. Предпочтительно, вариант является, по меньшей мере, на 92% чистым, например, по меньшей мере, на 94% чистым, по меньшей мере, на 95% чистым, по меньшей мере, на 96% чистым, по меньшей мере, на 97% чистым, по меньшей мере, на 98% чистым, по меньшей мере, на 99%, по меньшей мере, на 99,5% чистым, и на 100% чистым по массе от общего полипептидного материала, присутствующего в препарате. Варианты в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно, находятся по существу в чистой форме. Это может быть осуществлено, например, путем получения варианта с помощью хорошо известных рекомбинантных способов или с помощью классических способов очистки.

Зрелый полипептид: Термин «зрелый полипептид» означает полипептид в его конечной форме после трансляции и любых пост-трансляционных модификаций, таких как N-терминальный процессинг, С-терминальный процессинг, гликозилирование, фосфорилирование, и т.д.

Зрелый полипептид, кодирующий последовательность: Термин «зрелый полипептид, кодирующий последовательность» означает полинуклеотид, который кодирует зрелый полипептид, имеющий активность альфа-амилазы.

Идентичность последовательностей: Сходство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром «идентичность последовательностей».

Применительно к настоящему изобретению, степень идентичности последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями определяют, используя алгоритм Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который выполняется в Needle программе EMBOSS пакета (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Необязательными параметрами, которые используются, являются штраф на внесение делеции в выравнивание 10, штраф на продолжение делеции 0,5 и EBLOSUM62 (EMBOSS версии BLOSUM62) подстановочная матрица. Результаты выполнения Needle, обозначенные «самая длинная идентичность» (полученная, используя - опцию без замечаний), используют, как процентную идентичность и рассчитывают следующим образом:

(Идентичные остатки x 100)/(длина выравнивания - общее количество делеций в выравнивании)

Применительно к настоящему изобретению, степень идентичности последовательностей между двумя дезоксирибонуклеотидными последовательностями определяют, используя алгоритм Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, ранее), который выполняется в Needle программе EMBOSS пакета (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, ранее), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Необязательными параметрами, которые используются, являются штраф на внесение делеции в выравнивание 10, штраф на продолжение делеции 0,5, и EDNAFULL (EMBOSS версии NCBI NUC4.4) подстановочная матрица. Результаты выполнения Needle, обозначенные «самая длинная идентичность» (полученная, используя - опцию без замечаний) используют, как процентную идентичность и рассчитывают следующим образом:

(Идентичные дезоксирибонуклеотиды x 100)/(длина выравнивания - общее количество делеций в выравнивании)

Фрагмент: Термин «фрагмент» означает полипептид, имеющий одну или больше (несколько) аминокислот, удаленных с аминого и/или карбоксильного конца зрелого полипептида; при этом фрагмент имеет активность альфа-амилазы.

Подпоследовательность: Термин «подпоследовательность» означает полинуклеотид, имеющий одну или больше (несколько) нуклеотидов, удаленных с 5'-и/или 3'-конца зрелого полипептида, кодирующего последовательность; при этом подпоследовательность кодирует фрагмент, имеющий активность альфа-амилазы.

Аллельный вариант: Термин «аллельный вариант» означает любую из двух или больше альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельная вариация возникает в природе за счет мутации, и может в результате приводить к полиморфизму в пределах популяций. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в кодированном полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененные аминокислотные последовательности. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодированный аллельным вариантом гена.

Выделенный полинуклеотид: Термин «выделенный полинуклеотид» означает полинуклеотид, который является модифицированным руками человека. В одном аспекте, выделенный полинуклеотид является, по меньшей мере, на 1% чистым, например, по меньшей мере, на 5% чистым, по меньшей мере, на 10% чистым, по меньшей мере, на 20% чистым, по меньшей мере, на 40% чистым, по меньшей мере, на 60% чистым, по меньшей мере, на 80% чистым, по меньшей мере, на 90% чистым, и, по меньшей мере, на 95% чистым, как определено с помощью агарозного электрофореза. Полинуклеотиды могут быть геномного, кДНК, РНК, полусинтетического, синтетического происхождения, или любыми их комбинациями.

По существу чистый полинуклеотид: Термин «по существу чистый полинуклеотид» означает полинуклеотидный препарат, свободный от других посторонних или нежелательных нуклеотидов и в форме, приемлемой для использования в генно-инженерных системах продуцирования полипептида. Таким образом, по существу чистый полинуклеотид содержит не больше, чем 10%, не больше, чем 8%, не больше, чем 6%, не больше, чем 5%, не больше, чем 4%, не больше, чем 3%, не больше, чем 2%, не больше, чем 1%, и не больше, чем 0,5% по массе другого полинуклеотидного материала, с которым он нативно или рекомбинантно связан. По существу чистый полинуклеотид может, однако, включать существующие в природе 5'- и 3'- нетранслируемые области, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительным является то, что по существу чистый полинуклеотид является, по меньшей мере, на 90% чистым, например, по меньшей мере, на 92% чистым, по меньшей мере, на 94% чистым, по меньшей мере, на 95% чистым, по меньшей мере, на 96% чистым, по меньшей мере, на 97% чистым, по меньшей мере, на 98% чистым, по меньшей мере, на 99% чистым, и, по меньшей мере, на 99,5% чистым по массе. Полинуклеотиды в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно, находятся по существу в чистой форме.

Кодирующая последовательность: Термин «кодирующая последовательность» означает полинуклеотид, который непосредственно определяет аминокислотную последовательность его полипептидного продукта. Границы кодирующей последовательности, как правило, определяют с помощью открытой рамки считывания, которая обычно начинается с ATG инициирующего кодона или альтернативных инициирующих кодонов, таких как GTG и TTG, и заканчивается терминирующим кодоном, таким как ТАА, TAG и TGA. Кодирующей последовательностью может быть ДНК, кДНК, синтетический или рекомбинантный полинуклеотид.

кДНК: Термин «кДНК» означает молекулу ДНК, которая может быть получена путем обратной транскрипции из зрелой, сплайсированной, молекулы мРНК, полученной из эукариотической клетки. кДНК не содержит интронные последовательности, которые могут присутствовать в соответствующей геномной ДНК. Исходный, первичный РНК транскрипт представляет собой предшественник мРНК, который является процессированным за счет серии стадий, включая сплайсинг, перед появлением в виде зрелой сплайсированной мРНК.

Конструкт нуклеиновой кислоты: Термин «конструкт нуклеиновой кислоты» означает молекулу нуклеиновой кислоты, или одно- или двух-цепочечную, которая выделена из встречающегося в природе гена или модифицирована, чтобы содержать сегменты нуклеиновых кислот до некоторой степени, которые иначе не могли бы существовать в природе, и которые являются синтетическими. Термин конструкт нуклеиновой кислоты является равнозначным термину «экспрессионная кассета», когда конструкт нуклеиновой кислоты содержит контрольные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности в соответствии с настоящим изобретением.

Контрольные последовательности: Термин «контрольные последовательности» означает все компоненты, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего вариант в соответствии с настоящим изобретением. Каждая контрольная последовательность может быть нативной или чужеродной к полинуклеотиду, который кодирует вариант, или нативной, или чужеродной друг к другу. Такие контрольные последовательности включают, но не ограничиваются этим, лидерную последовательность, полиаденилированную последовательность, пропептидную последовательность, промотор, сигнальную пептидную последовательность и транскрипционный терминатор. Как минимум, контрольные последовательности включают промотор и транскрипционные и трансляционные стоп сигналы. Контрольные последовательности могут быть обеспечены с линкерами с целью введения специфических сайтов рестрикции, которые облегчают лигирование контрольных последовательностей с кодирующей областью полинуклеотида, кодирующего вариант.

Функционально связанный: Термин «функционально связанный» означает конфигурацию, в которой контрольная последовательность расположена в соответствующем положении по отношению к кодирующей последовательности полинуклеотида таким образом, что контрольная последовательность направляет экспрессию кодирующей последовательности.

Экспрессия: Термин «экспрессия» включает любую стадию, вовлеченную в продуцирование варианта, включая, но не ограничиваясь этим, транскрипцию, пост-транскрипционную модификацию, трансляцию, пост-трансляционную модификацию и секрецию.

Вектор экспрессии: Термин «вектор экспрессии» означает молекулу линейной или циклической ДНК, которая содержит полинуклеотид, кодирующий вариант, и функционально связана с дополнительными нуклеотидами, которые обеспечивают ее экспрессию.

Клетка-хозяин: Термин «клетка-хозяин» означает любой тип клетки, который является восприимчивым к трансформации, трансфекции, трансдукции, и подобным с конструктом нуклеиновой кислоты или вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением. Термин «клетка-хозяин» охватывает любое потомство родительской клетки, которое не является идентичным к родительской клетке из-за мутаций, которые происходят во время репликации.

Способ удаления крахмала: Выражение «способ удаления крахмала» относится к любому виду способа, в результате которого крахмал удаляется (или превращается), такого как в способах стирки, где крахмал удаляют с текстиля, например, очистка текстиля, такая как стирка. Способ удаления крахмала также мог быть очисткой твердой поверхности, такой как мытье посуды, или это мог быть способ очистки в целом, такой как промышленная чистка и чистка в учреждениях. Выражение также включает другие способы удаления крахмала или превращения крахмала, получения этанола, превращения крахмала в жидкое состояние, расшлихтовку текстиля, производства бумаги и целлюлозы, приготовления пива и, в основном, моющих средств.

Улучшенное свойство: Термин «улучшенное свойство» означает характеристику, связанную с вариантом, который является улучшенным по сравнению с родительским. Такие улучшенные свойства включают, но не ограничиваются этим, термическую активность, термостабильность, pH активность, pH стабильность, субстрат/кофакторная специфичность, улучшенные поверхностные свойства, специфичность продукта, повышенную стабильность или растворимость в присутствии предварительно обработанной биомассы, улучшенную стабильность в условиях хранения и химическую стабильность.

Моющая эффективность: В представленном контексте термин «моющая эффективность» используется как способность фермента удалять крахмал или крахмал-содержащие пятна, присутствующие на объекте, который подвергают чистке, во время, например, стирки или очистки твердой поверхности, такой как мытье посуды. Моющая эффективность может быть количественно определена путем расчета так называемого параметра интенсивности (Int), определенного в описании AMSA или в испытании моющей эффективности в стакане в разделе Способы, представленном ниже.

Улучшенная моющая эффективность: Термин «улучшенная моющая эффективность» в данной заявке определяется как вариант фермента, показывающий изменение моющей эффективности варианта амилазы по отношению к моющей эффективности родительской амилазы или по отношению к альфа-амилазе, имеющей идентичную аминокислотную последовательность указанного варианта, но не имеющей делеции в одном или больше из определенных положений, или по отношению к активности альфа-амилазы, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 4, например, путем усиленного удаления пятна. Термин «моющая эффективность» включает очистку в целом, например, очистку твердой поверхности, в виде мытья посуды, а также моющую эффективность на текстиле, такую как стирка, и также промышленную чистку и чистку в учреждении.

Низкая температура: «Низкая температура» представляет собой температуру 5-35°С, предпочтительно 5-30°С, более предпочтительно 5-25°С, более предпочтительно 5-20°С, наиболее предпочтительно 5-15°С, и, в частности, 5-10°С. В предпочтительном варианте осуществления, «низкая температура» представляет собой температуру 10-35°С, предпочтительно 10-30°С, более предпочтительно 10-25°С, наиболее предпочтительно 10-20°С, и, в частности, 10-15°С.

Правила для обозначения вариантов

Применительно к настоящему изобретению, зрелый полипептид, раскрытый в SEQ ID NO: 1, используют для определения соответствующего аминокислотного остатка в другой альфа-амилазе. Аминокислотную последовательность другой альфа-амилазы выравнивают со зрелым полипептидом, раскрытым в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, и исходя из выравнивания, номер положения аминокислоты, соответствующий любому аминокислотному остатку в зрелом полипептиде, раскрытом в SEQ ID NO: 1, определяют, используя алгоритм Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который выполняется в Needle программе EMBOSS пакета (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней.

Идентификация соответствующего аминокислотного остатка в другой альфа-амилазе может быть подтверждена путем выравнивания множественных полипептидных последовательностей, используя «ClustalW» (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948).

Когда другой фермент отличается от зрелого полипептида SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6 таким образом, что сравнение, основываясь на традиционной последовательности, дает сбой при обнаружении их взаимосвязи (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), то могут быть использованы другие алгоритмы сравнения последовательность попарно. Большая чувствительность поиска на основе последовательности может быть достигнута, используя программы поиска, которые используют вероятностные представления семейств полипептидов (профилей), чтобы проводить поиск по базам данным. Например, PSI-BLAST программа генерирует профили за счет итеративного процесса поиска по базе данных и является способной к обнаружению отдаленных гомологов (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Еще большая чувствительность может быть достигнута, если семейство или суперсемейтво полипептида имеет один или больше представителей в базе данных структуры белка. Программа, такая как GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) использует информацию из различных источников (PSI-BLAST, прогнозирование вторичной структуры, профили структурного выравнивания и возможности сольватации), как входящие данные к нейронной сети, что предсказывает структурную складку для запрашиваемой последовательности. Аналогичным образом, способ по Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919 может быть использован для выравнивания последовательности неизвестной структуры с моделями суперсемейства, представленными в SCOP базе данных. Данные выравнивания могут быть последовательно использованы, чтобы сгенерировать гомологичные модели для полипептида, и такие модели могут оценивать на правильность использования инструменты, разработанные для такой цели.

Для белков известной структуры, некоторые инструменты и ресурсы являются доступными для восстановления и генерирования структурных выравниваний. Например, SCOP суперсемейства белков были структурно выравнены, и данные выравнивания являются доступными и загружаемыми. Две или больше белковые структуры могут быть выравнены, используя многообразие алгоритмов, таких как матрица выравнивания расстояния (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) или комбинаторное удлинение (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), и внедрение данных алгоритмов дополнительно может быть использовано в базе данных запрашиваемой структуры со структурой, представляющей интерес, для того чтобы обнаружить возможные структурные гомологи (например, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

В описании вариантов альфа-амилазы в соответствии с настоящим изобретением, описанная ниже номенклатура адаптирована для легкости ссыки. В общепринятой номенклатуре IUPAC используется однобуквенное или трехбуквенное сокращение аминокислоты.

Замещения. Для аминокислотного замещения используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, замещенная аминокислота. Соответственно, замещение треонина на аланин в положении 226 обозначают как «Thr226Ala» или «Т226А». Различные мутации разделяются путем добавления отметки («+»), например, «Gly205Arg+Ser411Phe» или «G205R+S411F», представляющие замещения в положениях 205 и 411 глицина (G) на аргинин (R) и серина (S) на фенилаланин (F), соответственно.

Делеции. Для аминокислотной делеции используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение*. Соответственно, делецию глицина в положении 195 обозначают как «Glyl95*» или «G195*». Различные делеции разделены путем добавления отметки («+»), например, «Gly195*+Ser411*» или «G195*+S411*».

Вставки. Для аминокислотной вставки используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота. Соответственно, вставка лизина после глицина в положение 195 обозначают как «Gly195GlyLys» или «G195GK». Вставку множественных аминокислот обозначают как [исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота #1, вставленная аминокислота #2; и т.п.]. Например, вставка лизина и аланина после глицина в положение 195 представлена как «Gly195GlyLysAla» или«C195GKA».

В таких случаях вставленный(е) аминокислотный(е) остаток(и) является пронумерованным путем добавления строчных букв у номера положения аминокислотного остатка, предшествующего вставленному(ым) аминокислотному(ым) остатку(ам). В примере, описанном выше, последовательность должна быть представлена таким образом:

Родительская:	Вариант:
195	195 195а 195b
G	G - K - А

Множественные изменения. Варианты, содержащие множественные изменения разделены путем добавления отметок («+»), например, «Arg170Tyr+Gly195Glu» или «R170Y+G195E», представляя замещение тирозина и глутаминовой кислоты на аргинин и глицин в положениях 170 и 195, соответственно.

Различные замещения. Когда различные замещения могут быть введены в положение, различные замещения разделяют, используя запятую, например, «Arg170Tyr,Glu» представляет собой замещение аргинина на тирозин или глутаминовую кислоту в положении 170. Таким образом, «Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala» обозначает следующие варианты:

«Tyr167Gly+Arg170Gly», «Tyr167Gly+Arg170Ala», «Tyr167Ala+Arg170Gly» и «Tyr167Ala+Arg170Ala».

Родительские альфа-амилазы

Родительская альфа-амилаза может быть полипептидом с, по меньшей мере, 80% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1.

В аспекте, предшественник имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1, по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 87%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100%, который имеет активность альфа-амилазы. В одном аспекте, аминокислотная последовательность предшественника отличается не больше, чем десятью аминокислотами, например, пятью аминокислотами, четырьмя аминокислотами, тремя аминокислотами, двумя аминокислотами и одной аминокислотой от зрелого полипептида SEQ ID NO: 1.

Предшественник предпочтительно содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В другом аспекте, предшественник содержит или состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO: 1.

В другом варианте осуществления, предшественник представляет собой аллельный вариант зрелого полипептида SEQ ID NO: 1.

Родительская альфа-амилаза также может быть полипептидом с, по меньшей мере, 80% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте, предшественник имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 87%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100%, который имеет активность альфа-амилазы. В одном аспекте, аминокислотная последовательность предшественника отличается не больше, чем десятью аминокислотами, например, пятью аминокислотами, четырьмя аминокислотами, тремя аминокислотами, двумя аминокислотами и одной аминокислотой от зрелого полипептида SEQ ID NO: 2.

Предшественник предпочтительно содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В другом аспекте, предшественник содержит или состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления, предшественник представляет собой аллельный вариант зрелого полипептида SEQ ID NO: 2.

Родительская альфа-амилаза также может быть полипептидом с, по меньшей мере, 80% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте, предшественник имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 87%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100%, который имеет активность альфа-амилазы. В одном аспекте, аминокислотная последовательность предшественника отличается не больше, чем десятью аминокислотами, например, пятью аминокислотами, четырьмя аминокислотами, тремя аминокислотами, двумя аминокислотами и одной аминокислотой от зрелого полипептида SEQ ID NO: 3.

Предшественник предпочтительно содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. В другом аспекте, предшественник содержит или состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO: 3.

В другом варианте осуществления, предшественник представляет собой аллельный вариант зрелого полипептида SEQ ID NO: 3.

Родительская альфа-амилаза также может быть полипептидом с, по меньшей мере, 80% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4.

В другом аспекте, предшественник имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4, по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 87%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100%, который имеет активность альфа-амилазы. В одном аспекте, аминокислотная последовательность предшественника отличается не больше, чем десятью аминокислотами, например, пятью аминокислотами, четырьмя аминокислотами, тремя аминокислотами, двумя аминокислотами и одной аминокислотой от зрелого полипептида SEQ ID NO: 4.

Предшественник предпочтительно содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. В другом аспекте, предшественник содержит или состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO: 4.

В другом варианте осуществления, предшественник представляет собой аллельный вариант зрелого полипептида SEQ ID NO: 4.

Родительская альфа-амилаза также может быть полипептидом с, по меньшей мере, 80% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5.

В другом аспекте, предшественник имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5, по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 87%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100%, который имеет активность альфа-амилазы. В одном аспекте, аминокислотная последовательность предшественника отличается не больше, чем десятью аминокислотами, например, пятью аминокислотами, четырьмя аминокислотами, тремя аминокислотами, двумя аминокислотами и одной аминокислотой от зрелого полипептида SEQ ID NO: 5.

Предшественник предпочтительно содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5. В другом аспекте, предшественник содержит или состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO: 5.

В другом варианте осуществления, предшественник представляет собой аллельный вариант зрелого полипептида SEQ ID NO: 5.

Родительская альфа-амилаза также может быть полипептидом с, по меньшей мере, 80% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 6.

В другом аспекте, предшественник имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 6, по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 87%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или 100%, который имеет активность альфа-амилазы. В одном аспекте, аминокислотная последовательность предшественника отличается не больше, чем десятью аминокислотами, например, пятью аминокислотами, четырьмя аминокислотами, тремя аминокислотами, двумя аминокислотами и одной аминокислотой от зрелого полипептида SEQ ID NO: 6.

Предшественник предпочтительно содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. В другом аспекте, предшественник содержит или состоит из зрелого полипептида SEQ ID NO: 6.

В другом варианте осуществления, предшественник представляет собой аллельный вариант зрелого полипептида SEQ ID NO: 6.

Родительская альфа-амилаза также может быть полипептидом с, по меньшей мере, 80% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 7.

В другом аспекте, предшественник имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 7, по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 87%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей м