Антитела против csf-1r человека и их применение

Антитела против csf-1r человека и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам против CSF-1R человека (CSF-1R антителам), способам их получения, фармацевтическим композициям указанных антител и к их применению.

Предпосылки создания изобретения

Рецептор CSF-1 (CSF-1R; синонимы: рецептор M-CSF; рецептор 1 колониестимулирующего фактора макрофагов (Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor-CSF-1R), EC 2.7.10.1, протоонкоген Fms, c-fms, Swiss Prot P07333, CD 115) известен с 1986 года (Coussens L. и др., Nature 320, 1986, сс.277-280). CSF-1R является фактором роста и кодируется протоонкогеном c-fms (см., например, обзор Roth P. и Stanley E.R., Curr. Top. Microbiol. ImmunoL, 181, 1992, сс.141-167).

CSF-1R является рецептором колониестимулирующего фактора макрофагов (macrophage colony stimulating factor - M-CSF, также обозначаемого CSF-1) и опосредует биологические эффекты этого цитокина (Sherr C.J. и др., Cell, 41, 1985, сс.665-676). Клонирование рецептора 1 колониестимулирующего фактора макрофагов (colony stimulating factor-1 receptor - c-fms) впервые описано в работе Roussel M.F. и др., Nature, 325, 1987, сс.549-552. В этой публикации было описано, что CSF-1R обладает трансформирующим потенциалом, зависящим от изменений в С-конце белка, включая потерю ингибирующего тирозин 969 фосфорилирования, связывающего Cbl и за счет этого регулирующего снижение регуляции рецептора (Lee P.S. и др., Embo J., 18, 1999, сс.3616-3628).

CSF-1R является одноцепочечной трансмембранной рецепторной тирозинкиназой (receptor tyrosine kinase - RTK) и представителем семейства мотивов иммуноглобулина (immunoglobulin - Ig), содержащих ферменты RTK, отличающиеся повторениями доменов Ig во внеклеточной части рецептора. Внутриклеточный домен протеин-тирозинкиназы прерывается уникальным инсертированным доменом, который также имеется у других представителей семейства III класса RTK, которые также включают рецепторы фактора роста тромбоцитов (platelet derived growth factor receptors - PDGFR), рецептор фактора роста стволовых клеток (stem cell growth factor receptor - c-Kit) и рецептор цитокина fins-like (fins-like cytokine receptor - FLT3). Несмотря на структурную гомологию среди представителей семейства рецепторов факторов роста, они проявляют различные тканеспецифичные функции. Преимущественно CSF-1R экспрессируется на клетках, происходящих от моноцитов, а также в половой сфере у женщин и в плаценте. Кроме того, экспрессия CSF-1R описана в клетках Лангерганса в коже, субпопуляции клеток гладкой мускулатуры (Inaba Т. и др., J. Biol. Chem., 267, 1992, сс.5693-5699), в В-клетках (Baker A.H. и др., Oncogene, 8, 1993, сс.371-378) и микроглие (Sawada, M., и др., Brain Res. 509 (1990) 119-124).

Основными биологическими эффектами передачи сигнала CSF-1R являются дифференциация, пролиферация, миграция и выживание кроветворных клеток-предшественниц в линию макрофагов (включая остеокласты). Активирование CSF-1R опосредуется его лигандом, M-CSF. Связывание M-CSF с CSF-1R индуцирует формирование гомодимеров и активирование киназы путем фосфорилирования тирозина (Stanley E.R. и др., Mol. Reprod. Dev., 46, 1997, сс.4-10). Дополнительная передача сигнала опосредуется р85 субъединицей PI3K и Grb2, соединяющимися с метаболическими путями PI3K/AKT и Ras/MAPK, соответственно. Эти два важные метаболические пути передачи сигнала могут регулировать пролиферацию, выживание и апоптоз. К другим передающим сигнал молекулам, которые связывают фосфорилированный внутриклеточный домен в CSF-1R, относятся STAT1, STAT3, PLCy и Cbl (Bourette R.P. и Rohrschneider L.R., Growth Factors, 17, 2000, сс.155-166).

Передача сигнала через CSF-1R выполняет физиологическую роль в иммунном ответе, в реконструкции костей и в репродуктивной системе. Было показано, что у животных с нокаутом M-CSF-1 (Pollard J.W., Mol. Reprod. Dev., 46, 1997, сс.54-61) или CSF-1R (Dai X.M. и др., Blood, 99, 2002, сс.111-120) имеются остеопетрозные, гематопоэтические, связанные с тканевыми макрофагами и репродуктивные фенотипы в соответствии с ролью CSF-1R в соответствующих типах клеток.

Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, сс.1786-1793, описывают некоторые антитела против CSF-1R, которые ингибируют действие CSF-1 (см. Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, сс.1786-1793). Ashum R.A. и др., Blood, 73, 1989, сс.827-837, описывают антитела CSF-1R. Lenda D.M. и др., Journal of immunology, 170, 2003, сс.3254-3262, описывают пониженное восстановление популяции макрофагов, пролиферацию и активирование у мышей с недостаточностью CSF-1, что приводит к пониженному тубулярному апоптозу при воспалении почки. Kitaura Н. и др., Journal of dental research, 87, 2008, сс.396-400, описывают анти-CSF-1 антитело, которое подавляет ортодонтическое движение зуба. В WO 2001/030381 описывают ингибиторы действия CSF-1, включая антисмысловые нуклеотиды и антитела, несмотря на то, что описывают только антисмысловые нуклеотиды. WO 2004/045532 относится к предупреждению метастазов и разрежения костей, а также к лечению метастазирующих форм рака с помощью M-CSF антагониста, описанного только в качестве антагонистических анти-CSF-1-антител. WO 2005/046657 относится к лечению воспалительной болезни кишечника с помощью анти-CSF-1-антител. US 2002/0141994 относится к ингибиторам колиниестимулирующих факторов. WO 2006/096489 относится к лечению ревматоидного артрита с помощью анти-CSF-1-антител.

WO 2009/026303 и WO 2009/112245 относятся к анти-CSF-1R антителам.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с CSF-1R человека, отличающееся связыванием с тем же эпитопом, что и депонированное антитело DSM ACC2922.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело отличается включением в качестве области CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:17.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело отличается тем, что:

а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6; или

б) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:9, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:10 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:11, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:12, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:13 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:14; или

в) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:17, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:18 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:19, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:20, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:21 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:22; или

г) вариант антител по пунктам а), б) или в) имеет пересаженную область CDR, является гуманизированным или у него ослаблен Т-клеточный эпитоп.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело отличается тем, что:

а) аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи является последовательность SEQ ID NO:7, и аминокислотной последовательностью вариабельного домена легкой цепи является последовательность SEQ ID NO:8; или

б) аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи является последовательность SEQ ID NO:15, и аминокислотной последовательностью вариабельного домена легкой цепи является последовательность SEQ ID NO:16; или

в) аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи является последовательность SEQ ID NO:23, и аминокислотной последовательностью вариабельного домена легкой цепи является последовательность SEQ ID NO:24; или

г) вариант антител по пунктам а), б) или в) имеет пересаженную область CDR, является гуманизированным или у него ослаблен Т-клеточный эпитоп.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, связывающееся с CSF-1R человека и отличающееся указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, относится к подклассу IgG1 человека или подклассу IgG4 человека.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, включающая антитело по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также включает фармацевтическую композицию, отличающуюся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей.

Настоящее изобретение также включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для получения фармацевтической композиции.

Настоящее изобретение также включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения CSF-1R-опосредованных заболеваний.

Настоящее изобретение также включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения рака.

Настоящее изобретение также включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения разрежения костей.

Настоящее изобретение также включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для предупреждения или лечения метастазов.

Настоящее изобретение также включает применение антитела, отличающееся включением антитела, связывающегося с CSF-1R человека, которое отличается указанными выше свойствами по связыванию эпитопа или в другом варианте указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей для лечения воспалительных заболеваний.

Один из объектов настоящего изобретения является антителом, связывающимся с CSF-1R человека, отличающимся включением в качестве области CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи области CDR3, имеющей последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:17.

Другой объект настоящего изобретения является антителом, связывающимся с CSF-1R человека, который отличается тем, что:

а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6; или

б) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:9, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:10 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:11, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:12, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:13 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:14; или

в) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:17, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:18 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:19, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:20, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:21 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:2; или

г) вариант антител по пунктам а), б) или в) имеет пересаженную область CDR, является гуманизированным или у него ослаблен Т-клеточный эпитоп.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело отличается включением:

а) аминокислотной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:7, и аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:8; или

б) аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи является последовательность SEQ ID NO:15, и аминокислотной последовательностью вариабельного домена легкой цепи является последовательность SEQ ID NO:16; или

в) аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи является последовательность SEQ ID NO:23, и аминокислотной последовательностью вариабельного домена легкой цепи является последовательность SEQ ID NO:24; или

г) вариант антител по пунктам а), б) или в) имеет пересаженную область CDR, является гуманизированным или у него ослаблен Т-клеточный эпитоп.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению связываются с CSF-1R человека со сродством, составляющим по меньшей мере от 10^-8 моль/л до 10^-12 моль/л.

В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению является гуманизированным антителом.

Другим объектом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи антитела по настоящему изобретению. Предпочтительно нуклеиновая кислота кодирует тяжелую цепь антитела, связывающуюся с CSF-1R человека, отличающуюся включением в качестве области CDR3 тяжелой цепи область CDR3 с последовательностью SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:17.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по настоящему изобретению, отличается тем, что:

а) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:1, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:2 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:4, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:5 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:6; или

б) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:9, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:10 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:11, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:12, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:13 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:14; или

в) вариабельный домен тяжелой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:17, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:18 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:19, и вариабельный домен легкой цепи включает область CDR3 последовательности SEQ ID NO:20, область CDR2 последовательности SEQ ID NO:21 и область CDR1 последовательности SEQ ID NO:22; или

г) вариант антител по пунктам а), б) или в) имеет пересаженную область CDR, является гуманизированным или у него ослаблен Т-клеточный эпитоп.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает векторы экспрессии, содержащие нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, способные экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы, для рекомбинантного получения такого антитела.

Настоящее изобретение дополнительно включает прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, включающие вектор по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно включает способ получения рекомбинантного гуманизированного антитела по настоящему изобретению, отличающийся экспрессией по настоящему изобретению в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах и выделением указанного антитела из указанных клеток или супернатанта культуры клеток. Настоящее изобретение дополнительно включает антитело, которое можно получить таким способом рекомбинации.

Антитела по настоящему изобретению оказываются полезными для пациентов, нуждающихся в лечении, направленном на CSF-1R. Антитела по настоящему изобретению обладают новыми, обладающими признаками изобретения свойствами, которые полезны для пациента с опухолевым заболеванием, особенно с раком.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ лечения пациента больного раком, включающий введение пациенту, у которого установлен такой диагноз (и который, следовательно, нуждается в такой терапии), эффективного количество антитела, связывающегося с CSF-1R человека по настоящему изобретению. Антитело вводят предпочтительно в фармацевтической композиции.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ лечения больного раком пациента отличается введением пациенту антитела по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает применение антитела по настоящему изобретению для лечения больного раком пациента и для получения фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение включает способ получения фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, включающую антитело по настоящему изобретению, необязательно вместе с буфером и/или адъювантом, применимым для переработки антител в фармацевтических целях.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтические композиции, включающие антитело по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть включена в продукт или в набор.

Описание фигур

Фиг.1. Подавление роста опухолевых клеток BeWo в культуре 3D при лечении разными анти-CSF-1R моноклональными антителами в концентрации 10 мкг/мл. Ось

X: жизнеспособность выражена в относительных световых единицах (ОСЕ), соответствующих содержанию АТФ в клетках (метод CellTiterGlo). Ось Y: исследованные пробы: минимальная среда (0,5% ФСБ), IgGI мыши (mIgG1, 10 мкг/мл), IgG2a мыши (mIgG2a, 10 мкг/мл), только CSF-1, <CSF-1R>10A4.1G11 и SC-02, клон 2-4А5. Наивысшее подавление роста, индуцированного CSF-1, наблюдают с анти-CSF-1R антителами по настоящему изобретению.

Подробное описание

I. Определения

К понятию «антитело» относятся различные формы антител, включая, но ими перечень не ограничивается, целые антитела, фрагменты антител, гуманизированные антитела, химерные антитела, антитела с делегированным эпитопом Т-клеток и другие генетически сконструированные антитела, если у них сохраняются специфические свойства по настоящему изобретению.

«Фрагменты антител» включают часть антитела полной длины, предпочтительно его вариабельный домен, или по меньшей мере его сайт связывания антитела. К примерам фрагментов антител относятся диантитела, молекулы одноцепочечных антител и полиспецифичные антитела, сформированные из фрагментов антител. Антитела scFv описаны, например, Huston J.S., Methods in EnzymoL, 203, 1991, сс.46-88. Кроме того, фрагменты антител включают одноцепочечные пептиды, обладающие свойствами домена V_H, связывающегося с CSF-1R, то есть способного к сборке вместе с доменом V_L, или доменом V_L, связывающимся с CSF-1R, то есть способного к сборке вместе с доменом V_H для функционального сайта связывания антигена и за этот счет обеспечения определенного свойства.

Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклональных антител» в контексте настоящего изобретения относится к получению молекул антител одной аминокислотной композиции.

Понятие «химерное антитело» относится к моноклональному антителу, включающему вариабельную область, т.е. область связывания, от мыши и по меньшей мере часть константной области, производной от другого источника или вида, обычно полученную методами рекомбинации ДНК. Особенно предпочтительны химерные антитела, включающие вариабельную область мыши и константную область человека. Такие химерные антитела мыши/человека являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулина, включающим сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулина крысы, и сегменты ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулина человека. К другим формам «химерных антител» по настоящему изобретению относятся те формы, у которых класс или подкласс модифицирован или изменен по сравнению с исходным антителом. Такие «химерные» антитела также обозначают «измененные и отнесенные к другому классу антитела». К способам получения химерных антител относятся традиционные способы рекомбинации ДНК и способы генной трансфекции, в настоящее время известные в данной области. См., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81, 1984, сс.6851-6855; US 5202238 и US 5204244.

Понятие «CDR-пересаженный вариант» в контексте настоящего изобретения означает вариабельный домен антитела, включающий области, определяющие комплементарность (области CDR или гипервариабельные области) из одного источника или вида, и каркасные участки (FR) из разных источников или видов, обычно полученный методами рекомбинации ДНК. Предпочтительны CDR-пересаженные варианты вариабельных доменов, включающих области CDR и участки FR человека.

Понятие «вариант с ослабленным эпитопом Т-клеток» в контексте настоящего изобретения означает вариабельный домен антитела, модифицированного для удаления или снижения иммуногенности путем удаления эпитопов Т-клеток человека (пептидные последовательности в вариабельных доменах, способные связывать молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса II). С помощью такого метода выявляют взаимодействия между боковыми цепочками аминокислот вариабельного домена и специфическими карманами связывания со связывающей бороздкой ГКГС II класса. Выявленные иммуногенные области мутируют для элиминации иммуногенности. В целом такие методы описаны, например, в WO 98/52976.

Понятие «гуманизированный вариант» в контексте настоящего изобретения означает вариабельный домен антитела, который восстанавливают из областей, определяющих комплементарность (CDR), происходящих не от человека, например, от другого вида, и от каркасных участков (FR), происходящих от человека, и который дополнительно модифицирован для того, чтобы также восстановить или улучшить связывающее сродство и специфичность исходного вариабельного домена, происходящего не от человека. Такие гуманизированные варианты обычно получают методами рекомбинации ДНК. Восстановление сродства и специфичности исходного вариабельного домена, не являющегося доменом человека, представляет критическую стадию, причем для такого восстановления применяют разные методы. В одном методе определяют, является ли полезной интродукция мутаций, так называемых обратных мутаций, в области CDR, не являющиеся областями человека, а также в участки FR, происходящие от человека. Соответствующие положения для таких обратных мутаций могут быть выявлены, например, путем анализа последовательности или анализа гомологии, выбора каркасного участка человека (метод фиксированных каркасов молекул; гомологичное соответствие или метод оптимального приближения), использования консенсусных последовательностей, отбора участков FR от нескольких разных моноклональных антител (mAb) человека, или замещением остатков, происходящих не от человека, на трехмерной поверхности с наиболее обычными остатками, обнаруженными в mAb человека («перекладка» или «облицовка»).

К антителам по настоящему изобретению также относятся такие антитела, которые обладают «консервативными модификациями последовательности», модификациями нуклеотидной и аминокислотной последовательности, которые не влияют или изменяют указанные выше свойства антитела по настоящему изобретению. Модификации могут быть интродуцированы стандартными методами, известными в данной области, например, сайт-направленным мутагенезом и ПЦР-опосредованным мутагенезом. К консервативным аминокислотным замещениям относятся те, в которых аминокислотный остаток замещен другим аминокислотным остатком со сходной боковой цепью. В данной области определены семейства аминокислотных остатков со сходными боковыми цепями. Эти семейства содержат аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, заранее рассчитанный остаток аминокислоты, не относящейся к числу незаменимых аминокислот, в анти-CSF-1R антителе человека предпочтительно может быть замещен другим аминокислотным остатком из семейства с тем же типом боковой цепи.

Аминокислотные замещения могут быть осуществлены путем мутагенеза, основываясь на молекулярном моделировании согласно описанию Riechmann L. и др., Nature, 332, 1988, сс.323-327, и Queen С.и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1989, сс.10029-10033.

Обозначение «CSF-1R» в контексте настоящего изобретения относится к CSF-1R человека (SEQ ID NO:15) CSF-1R (синонимы: CSF-1 рецептор, M-CSF рецептор; рецептор 1 колониестимулирующего фактора макрофагов, ЕС 2.7.10.1, протоонкоген Fms, c-fms, Swiss Prot P07333, CD115,) и применяется с 1986 года (Coussens L. и др., Nature, 320, 1986, сс.277-280). CSF-1R является фактором роста и кодируется протоонкогеном c-fms (обзор представлен, например, в работе Roth Р. и Stanley E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 181, 1992, сс.141-167).

CSF-1R является рецептором M-CSF (колониестимулирующего фактора макрофагов, также называемого CSF-1) и опосредует биологические действия этого цитокина (Sherr C.J. и др., Cell, 41, 1985, сс.665-676). Клонирование рецептора колониестимулирующего фактора-1 (также называемого c-fms) впервые описано в работе Roussel M., F., и др., Nature, 325, 1987, сс.549-552. В этой публикации показывают, что CSF-1R обладает трансформирующим потенциалом, зависящим от изменений в С-конце белка, включая утрату ингибирующего фосфорилирования тирозина 969, которое связывает Cbl и тем самым регулирует снижение регуляции рецептора (Lee P.S. и др., Embo J., 18, 1999,сс.3616-3628).

CSF-1R является одноцепочечной трансмембранной рецепторной тирозинкиназой (receptor tyrosine kinase - RTK) и представителем семейства ферментов RTK, содержащих мотив иммуноглобулина (Ig), которые отличаются повторяющимися доменами Ig во внеклеточной части рецептора. Внутриклеточный домен протеин-тирозинкиназы прерывается уникальным инсертированным доменом, который также имеется у других представителей семейства III класса RTK, которые включают рецепторы фактора роста тромбоцитов (platelet derived growth factor receptors - PDGFR), рецептор фактора роста стволовых клеток (stem cell growth factor receptor - c-Kit) и рецептор цитокина fins-like (fins-like cytokine receptor - FLT3). Несмотря на структурную гомологию среди представителей семейства рецепторов факторов роста, они проявляют различные тканеспецифичные функции. Преимущественно CSF-1R экспрессируется в клетках, происходящих от моноцитов, а также в половой сфере у женщин и в плаценте. Кроме того, экспрессия CSF-1R описана в клетках Лангерганса в коже, субпопуляции клеток гладкой мускулатуры (Inaba Т. и др., J. Biol. Chem., 267, 1992, сс.5693-5699), в В-клетках (Baker A.H. и др., Oncogene, 8, 1993, сс.371-378) и в микроглие (Sawada, M., и др., Brain Res. 509 (1990) 119-124).

В контексте настоящего изобретения понятия «связывание с CSF-1R человека», или «который связывается с CSF-1R человека», или «анти-CSF-1R» используют взаимозаменяемо и относят к специфическому связыванию антитела с антигеном в отношении CSF-1R человека. Связывающее сродство представляет KD-величину 1,0×10^-8 моль/л или ниже при 35°С, предпочтительно KD-величину 1,0×10^-9 моль/л или ниже при 35°С. Связывающее сродство определяют стандартным методом связывания, например, методом поверхностного плазменного резонанса (фирма Biacore®) (см. пример 4).

Понятие «эпитоп» означает белковый детерминант, способный специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, например, аминокислот или боковых цепей Сахаров, и обычно эпитопы обладают трехмерными структурными свойствами, а также специфическим зарядом. Конформационные и неконформационные эпитопы различают тем, что связывание с первыми вариантами эпитопов, но не со вторыми, утрачиваются в присутствии денатурирующих растворителей. Предпочтительно антитело по настоящему изобретению связывается специфически с нативным, но не денатурированным CSF-1R.

Фраза «связывание с тем же эпитопом, что и депонированное антитело DSM ACC2922» в контексте настоящего изобретения означает анти-CSF-1R антитело по настоящему изобретению, которое связывается с тем же эпитопом на CSF-1R, с которым связывается антитело <CSF-1R> 7H5.2G10 (депонировано в коллекции под номером DSM ACC2922). Способность анти-CSF-1R антитела по настоящему изобретению связывать эпитоп может быть определена, используя методы, известные в этой области. Антитело в отношении CSF-1R измеряют при 25°С методом поверхностного плазменного резонанса (ППР) путем анализа подавления конкурентного связывания in vitro для определения способности исследуемого антитела подавлять связывание антитела <CSF-1R> 7H5.2G10 (депонировано в коллекции под номером DSM ACC2922) с CSF-1R. Исследование может быть выполнено методом BIAcore (фирма Pharmacia BiosensorAB, Uppsala, Швеция), согласно описанному, например, в примере 5. В примере 5 процент (%) ожидаемого связывающего ответа антитела против CSF-1R по настоящему изобретению, конкурирующего со связыванием антитела <CSF-1R> 7H5.2G10 (депонировано в коллекции под номером DSM ACC2922), рассчитывают по формуле «100×относительный Ответ (общая_ранняя_стабильность)/rMax», где величину rMax рассчитывают по формуле «относительный Ответ(общая_поздняя_стабильность)×молекулярная масса антитела/молекулярная масса антигена» согласно описанному в инструкциях по картированию эпитопа методом BIAcore. Минимальный связывающий ответ также рассчитывают по парам идентичных антител 1 и 2 (см. пример 5). Соответственно, полученную максимальную величину + 50% устанавливают в качестве пороговой величины для существенной величины конкуренции, и таким образом, существенного связывания с тем же эпитопом (см. пример 5 по антителу <CSF-1R> 7H5.2G10 рассчитанная пороговая величина составляет 7+3,5=10,5). Таким образом, связывание антитела с CSF-1R человека, отличающегося «связыванием с тем же эпитопом, что и <CSF-1R> 7H5.2G10 (депонировано в коллекции под номером DSM ACC2922)», обладает процентом (%) ожидаемого ответа по связыванию ниже 10,5 (ожидаемый процент ответа по связыванию <10,5).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению конкурируют с депонированным в коллекции антителом DSM ACC2922 за связывание с CSF-1R человека. Такое конкурентное связывание может быть определено, используя методы, известные в данной области. Антитело против CSF-1R измеряют при 25°С методом поверхностного плазменного резонанса (ППР) в анализе подавления конкурентного связывания in vitro для определения способности исследуемого антитела ингибировать связывание антитела <CSF-1R> 7H5.2G10 (депонировано в коллекции под номером DSM ACC2922) с CSF-1R. Исследование может быть проведено методом BIAcore (фирма Pharmacia Biosensor AB, Упсала, Швеция), например, в примере 5.

Понятие «вариабельный домен» (вариабельный домен легкой цепи (V_L), вариабельный домен тяжелой цепи (V_H)) в контексте настоящего изобретения означает каждую пару доменов легкой и тяжелой цепей, которые участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей имеют одну и ту же общую структуру, и каждый домен включает четыре каркасных участка (framework - FR), последовательности которых высоко консервативны, соединены тремя «гипервариабельными областями» (или областями, определяющими комплементарность (CDR). Каркасные участки принимают конформацию β-слоя и области CDR могут формировать петли, соединяющие структуру β-слоя. Области CDR в каждой цепи поддерживаются в свойственной им трехмерной структуре за счет каркасных участков и формируются вместе с областями CDR из сайта связывания антигена другой цепи. Области CDR3 тяжелой и легкой цепей антитела играют весьма важную роль в связывающей специфичности/сродстве антител по настоящему изобретению и соответственно представляют другой объект по настоящему изобретению.

В контексте настоящего изобретения понятие «антигенсвязывающая часть антитела» относится к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. Антигенсвязывающая часть антитела включает аминокислотные остатки от «областей, определяющих комплементарность (complementary determining region - CDR)». В контексте настоящего изобретения понятие «каркасный участок (framework или FR)» относится к тем вариабельным областям домена, которые отличаются от остатков гипервариабельной области. Соответственно вариабельные домены легких и тяжелых цепей антитела включают от N- к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Главным образом область CDR3 тяжелой цепи является той областью, которая наибольшим образом влияет на связывание антигена и определяет свойства антитела. Области CDR и FR определяют в соответствии со стандартным описанием Kabat E.A. и др. в кн.: «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5-е изд., изд-во Public Health Service, Национальные институты здравоохранения, Bethesda, Мэриленд, и/или те остатки, которые происходят из «гипервариабельной петли».

В контексте настоящего изобретения понятия «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» относятся к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно двухцепочечной ДНК.

В контексте настоящего изобретения понятие «аминокислота» означает группу природных карбоновых α-аминокислот, включающую аланин (по трехбуквенному коду: ala, по однобуквенному коду: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновая кислота (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовая кислота (glu, Е), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), прооин (pro, Р), серии (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).

Понятие «иммуноконъюгат» означает антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичными молекулами, включая цитотоксический агент, но не только его.

Понятие «индивидуум» или «субъект» подразумевает млекопитающсс. К млекопитающим относятся, но ими перечень не ограничивается, домашние животные (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматы (например, люди и другие виды приматов, например, обезьяны), кролики и грызуны (например, мыши и крысы). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения индивидуумом или субъектом является человек.

Понятие «выделенное» антитело относится к антителу, выделенному из свойственной ему природной среды. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело очищено более чем до 95% или 99% чистоты, что подтверждают, например, электрофорезом (например, SDS-PAGE, изоэлектрическим фокусированием (isoelectric focusing - IEF), капиллярным электрофорезом) или хроматографически (например, ионообменная ВЭЖХ или ВЭЖХ обратной фазы). Обзор методов оценки чистоты антитела см., например, в публикации Flatman и др., J. Chromatogr. В, 848, 2007, сс.79-87.

Понятие «выделенная» нуклеиновая кислота относится к нуклеиновой кислоте, выделенной из свойственной ему природной среды. К выделенным нуклеиновым кислотам относятся молекулы нуклеиновой кислоты, содержащиеся в клетках, которые обычным образом содержат молекулы нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или локализована в хромосоме, но эта локализация отличается от природной хромосомальной локализации.

Фраза «выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая анти-CSF-1R антитело» относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим тяжелую и легкую цепи антитела (или его их фрагменты), включая такую молекулу (молекулы) нуклеиновой кислоты в одном векторе или в разных векторах, и такая молекула (молекулы) нуклеиновой кислоты содержится в одной или в нескольких локализациях в клетке-хозяине.

Понятие «нативные антитела» относится к природным молекулам иммуноглобулина различной структуры. Например, нативные IgG антитела являются гетеротетрамерными гликопротеи