Способы снижения числа базофилов

Способы снижения числа базофилов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам снижения числа эозинофилов в организме человека.

Предпосылки создания изобретения

Эозинофилы принимают участие в развитии различных заболеваний, включающих аллергические заболевания, и, как полагают, играют важную роль в росте заболеваемости аллергическими заболеваниями, такими как хроническая бронхиальная астма и атопический дерматит (Adv. Immunol., 39, 177 (1986), Immunol. Today, 13, 501 (1992)). Кроме того, эозинофилы также принимают участие в развитии заболеваний, которые обычно относятся к гиперэозинофильному синдрому (ГЭС), такому как эозинофилия, эозинофильный энтерогастрит, эозинофильный лейкоз, эозинофильная гранулема и болезнь Кимуры (Ann. Intern, Med., 97, 78 (1982)). ассоциировано с заметной тканевой эозинофилией (U.S. Armed Forces Med. J., 2, 1085 (1951)). Согласно реестру патентов Японии, относящихся к раку костной ткани, (за 1972-1984) 379 из 404 (93,8%) пациентов, страдают от эозинофильной гранулемы. Эозинофильная гранулема на ранней стадии главным образом включает эозинофилы и гистиоциты, а гранулема на поздней стадии включает фиброз или может привести к развитию пневмосклероза. Следовательно, наряду с воспалительными заболеваниями, такими как аллергия, эозинофилы могут вызывать другие различные заболевания.

Интерлейкин-5 (далее ИЛ-5), интерлейкин-3 (далее ИЛ-3) и гранулоцит/макрофаг колониестимулирующий фактор (далее КМ-КСФ), которые являются членами семейства цитокинов, принимают участие в регуляции дифференциации, пролиферации и активации эозинофилов. Установлено, что один из цитокинов, а именно ИЛ-5, специфично действует на эозинофилы и специфично индуцирует терминальную дифференциацию (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 2288 (1988)).

В условиях in vitro ИЛ-3 и/или ГМ-КСФ могут активировать эозинофилы или пролонгировать их выживание (J. Clin. Invest., 81, 1986 (1988)). Более того, ИЛ-3 и/или ГМ-КСФ действуют также преимущественно на индукцию незрелых эозинофилов из миелоидных стволовых клеток (Blood, 76, 1956 (1990)). Кроме того, хемокины, такие как эотаксин и RANTES (в норме контролирующие активацию экспрессированных и секретированных Т-клеток), индуцируют хемотаксис эозинофилов к очагам воспаления (Clin. Exp. Allergy, 26, 1005 (1996)). Факторы стволовых клеток (далее ФСК) принимают участие в накоплении эозинофилов при аллергическом бронхите. Наряду с ИЛ-5 существует множество факторов, влияющих на функцию эозинофилов.

Эозинофилы подразделяются на подгруппы, гранулированные эозинофилы и дегранулированные эозинофилы. Установлено, что эозинофилы превращаются гранулированные после активации (Immunology, 47, 531 (1982)). Дегранулированнные эозинофилы также относятся к активированным эозинофилам. Сообщается, что в эозинофилах периферической крови пациентов, страдающих от ГЭС, наряду с качественными изменениями происходят и количественные изменения (Clin. Exp. Immunol., 24, 423 (1976)). Активированные эозинофилы принимают в прогрессии симптома ГЭС (Am. J. Cardiol., 52, 321 (1983)). Кроме пациентов, страдающими от ГЭС, активированные эозинофилы присутствуют также в периферической крови и в бронхоальвеолярных смывах (БАС) пациента с диагнозом бронхиальная астма (Am. Rev. Respir. Dis, 132, 981 (1985)). На активированных эозинофилах экспрессируются различные рецепторы, такие как рецепторы цитокинов (J. Immunol., 142, 4416 (1989)). По сравнению с гранулированными эозинофилами указанные дегранулированные эозинофилы обладают повышенной чувствительностью к ИЛ-5 (Clin. Exp. Immunol., 85, 312 (1991), J. Exp. Med., 172, 1347 (1990)).

Установлено также, что указанные активированные эозинофилы выживают in vitro в отсутствии цитокинов, индуцирующих дифференциацию и пролиферацию эозинофилов (J. Exp. Med., 170, 343 (1989)). Таким образом, свойства активированных эозинофилов аналогичны свойствам эозинофилов, которые инфильтруют ткани, такие как альвеолы (Int. Arch. Allergy Immunol., 120, 91 (1999)). Подробные причины нечувствительности активированных эозинофилов к действию цитокинов неизвестны, однако их дегрануляция и пролонгированное выживание вероятно обусловлены различными функционально важными соединениями, иными чем ИЛ-5.

Соединения, ингибирующие активность цитокинов или хемокинов, которые принимают участие в дифференциации или пролиферации эозинофилов, можно рассматривать как агенты, которые ингибируют функции эозинофилов. Однако, в большинстве случаев указанные агенты не действуют на цитокин-нечувствительные эозинофилы, которые активированы и инфильтрованы в очаги воспаления. Следовательно, эозинофил-специфичное ингибирование и индукция гибели активированных эозинофилов необходимы для подавления функций любого эозинофила. Однако, до настоящего времени неизвестен противовоспалительный агент, которые способен индуцировать апоптоз активированных эозинофилов.

В настоящее время лечение пациентов, страдающих от эозинофильных заболеваний, включает введение стероидов. Однако, введение стероидов часто ассоциировано с побочными действиями. В частности, такое лечение сопровождается некоторыми другими проблемами, например, при временном прекращении введения стероидов патологическое состояние пациента может возвращаться к исходному уровню, а продолжительное введение стероидов индуцируют резистентность к лекарственному агенту. Следовательно, существует необходимость в разработке безопасных и эффективных способов лечения заболеваний и нарушений, опосредованных эозинофилами.

Краткое изложение сущности изобретения

В изобретении предлагается способ снижения числа эозинофилов в организме человека, который заключается в том, что указанному пациенту вводят соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, которое включает (а) фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р и (б) Fc-фрагмент иммуноглобулина.

Краткое описание фигур

Некоторые варианты осуществления изобретения иллюстрируются следующими фигурами, не ограничивающими его объем.

Фиг. 1. Снижение содержания катионного белка эозинофилов (КБЭ) в сыворотке крови. КБЭ представляет собой маркер, продуцируемый эозинофилами. У пациентов из группы 1 указанное снижение содержания КБЭ (см. фиг. 1) соответствует снижению числа эозинофилов. На оси у приводится концентрация КБЭ (нг/мл), на оси х указано время (дни).

Фиг. 2. Обратимое снижение числа базофилов в периферической крови. Базофилы в кровотоке измеряли у пациентов группы 1. На оси у приводится число базофилов (базофилы/мм), а на оси х указано время (дни). Быстрое снижение числа базофилов в периферической крови наблюдается через 24 ч после введения.

Фиг. 3. Повышенный (обратимый) число hsCRP (с-реактивный белок, который ассоциируется с высокой чувствительностью) у субъектов с эозинофилией в начальной стадии (базовая линия). Анализ указанного маркера у пациентов группы 1 свидетельствует о том, что наблюдается ожидаемая иммунная ответная реакция на клетки, экспрессирующие ИЛ-5Р. На оси у приводится концентрация hsCRP (мг/дл), а на оси х указано время (дни).

Фиг. 4. Минимальное увеличение содержания ИЛ-6 в сыворотке крови. На фиг. приводятся результаты анализа цитокина ИЛ-6 у пациентов группы 1. На оси у приводится концентрация ИЛ-6 (пг/мл), а на оси х указано время (ч).

Фиг. 5. Вариабельное снижение числа нейтрофилов в кровотоке. На обеих панелях приводятся результаты анализа числа нейтрофилов у пациентов группы 1.

Фиг.6. Вариабельное снижение числа лимфоцитов в кровотоке. На обеих панелях приводятся результаты анализа числа лимфоцитов у пациентов группы 1.

Фиг. 7. Устойчивое и умеренное снижение числа NK-клеток (%) в день 1. Число NK-клеток у пациентов группы 1 измеряли до лечения, в день 1 после введения и в день 28 после введения.

Фиг. 8. Пониженный FE_NO у субъектов с более высокой базовой линией. Фракцию выдыхаемого оксида азота измеряли у пациентов группы 1. Указанный анализ является неинвазивным методом диагностики воспаления легких, причем данные указывают на тенденцию снижения тяжести заболевания.

Фиг. 9. Анализ цитотоксичности in vitro. Число MEDI-563 измеряли при анализе цитотоксичности in vitro по сравнению с контрольными антителами, которые не связываются с ИЛ-5Р (А), а также с дополнительным контрольным фукозилированным MEDI-563 (Б). В эксперименте использовали клетки-эффекторы KC 1333 и клетки-мишени CTLL2 в соотношении 5:1. Цитотоксичность измеряли через 4 ч. На оси Y приводится измеренная цитотоксичность (%), на оси Х указана концентрация антител.

Фиг. 10. Связывание MEDI-563 с рчИЛ-5Рα. Аффинность MEDI-563 к рекомбинантному ИЛ-5Рα измеряли методом плазменного поверхностного резонанса в трех отдельных экспериментах.

Фиг. 11. Связывание MEDI-563 с rhuFcγRs. На фиг. приводятся результаты измерения аффинности MEDI-563 к нескольким образцам рекомбинантного FcγRs человека при сравнении с аффиностью изотипически родственных фукозилированных контрольных антител. Следует отметить, что MEDI-563 связывается с huFcyRIIIa с более высокой аффинностью (в 5-10 раз) по сравнению с muFcyRIV.

Фиг. 12. На фиг. представлены результаты иммуногистохимического анализа экспрессии ИЛ-5Рα в легких мыши ИЛ-9tg.

Фиг. 13. На фиг. представлены результаты иммуногистохимического анализа экспрессии ИЛ-5Рα в назальных полипах с использованием MEDI-563, которое окрашивает все эозинофилы в назальных полипах.

Фиг. 14. Легкая степень транзиторной нейтропении у субъектов. На фиг. показано абсолютное число нейтрофилов у субъектов группы 1. На оси Y приводится число нейтрофилов (нейтрофилы/мм³), а на оси Х указано время (дни).

Фиг. 15. Связывание MEDI-563 с эозинофилами цельной крови здоровых доноров. Анализ проточной цитометрией проводили с использованием образцов цельной крови, как описано в примере 6. На трех панелях, прежде всего на третьей панели, озаглавленной ʺсвязывание MEDI-563 с эозинофиламиʺ, приводятся данные цитофлуориметрии, свидетельствующие о связывании MEDI-563 с эозинофилами.

Фиг. 16. Анализ лейкоцитов из трансгенных по ИЛ-5 мышей проводили методом цитофлуориметрии. Анализ лейкоцитов из трансгенных по ИЛ-5 мышей проводили проточной цитометрией проводили, как описано в примере 7. На фиг. 16А показаны результаты анализа методом цитофлуориметрии эозинофилов SiglecF+CCR3+. На фиг. 16Б показано, что все эозинофилы (SiglecF+CCR3+) из костного мозга, селезенки, крови и легких экспрессируют ИЛ-5Рα+, при этом в анализе использовали МА Н7 анти-ИЛ-5Рα.

Фиг. 17. По данным ЗАКЦ in vitro MEDI-563 снижают число позитивных по ИЛ-5Р одноядерных клеток костного мозга. Изолированные, не прикрепленные к субстрату одноядерные клетки костного мозга, подвергали воздействию MEDI-563 или изотипических контрольных антител (R347) в присутствии клеток-эффекторов, окрашенных CFSE. Позитивные по ИЛ-5Р клетки идентифицировали с использованием антител КМ1257 и конъюгата ПЭ с козьим анти-Mu IgG. Контрольное окрашивание образцов проводили с использованием изотипических контрольных антител 1А7 и конъюгата ПЭ с козьим анти-Mu IgG. Профили окрашивания популяций клеток после обработки MEDI-563 или R347 представлены в виде отдельных графиков KM1257/ПЭ по сравнению с CFSE или 1А7/ПЭ по сравнению с CFSE. Сравнение графиков KM1257/ПЭ по сравнению с CFSE, полученных для образцов, обработанных MEDI-563 и R347, свидетельствует о том, что в результате ЗАКЦ, опосредованной MEDI-563, из образца практически полностью удаляются все клетки, позитивные по ИЛ-5Р.

Фиг. 18. MEDI-563 обратимо снижают число эозинофилов в периферической крови у субъектов с легкой формой астмы. Шести волонтерам с легкой формой астмы вводили однократную дозу внутривенно (А) 0,03 мг/кг или (Б) 0,1 мг/кг MEDI-563. Число эозинофилов в периферической крови определяли методом проточной цитометрии в день 0 до введения и через равные интервалы до дня 84 и в следующий период обследования. На оси y приводится число эозинофилов (эозинофилы/мм³), а на оси x указано время (дни). Быстрое снижение числа эозинофилов в периферической крови наблюдалось через 24 ч после введения. Эозинопения, индуцированная MEDI-563, является обратимой.

Фиг. 19. По результатам иммуногистохимического анализа с использованием MEDI-563 все эозинофилы из легких здорового человека экспрессируют рецептор ИЛ-5Рα. На этой фигуре показаны результаты измерения образцов А, Б, В и Г.

Фиг. 20. По результатам иммуногистохимического анализа с использованием MEDI-563 все эозинофилы из образцов легочной биопсии у пациентов с диагнозом астма экспрессируют рецептор ИЛ-5Рα.

Фиг. 21. Экспрессию рецептора ИЛ-5Рα первичными базофилами и эозинофилами, полученными от здоровых доноров, анализировали методом проточной цитометрии. На фиг. приводятся профили окрашивания, полученные с использованием антител анти-ИЛ-5Рα MEDI-563 и изотипических контрольных антител с другой специфичностью. В качестве позитивного контроля использовали клетки CTLLh5r (опухолевые клетки, трансфектированные ИЛ-5Рα/β).

Фиг. 22. Анализ антител-зависимой клеточной цитотоксичности (ЗАКЦ) in vitro. Активность дефукозилированных и фукозилированных MEDI-563 сравнивали по данным ЗАКЦ in vitro. В качестве клеток-эффекторов и клеток-мишеней использовали изолированные первичные NK-клетки и эозинофилы, соответственно, при соотношении 5:1. Анализ проводили в присутствии 1 нг/мл ИЛ-2 человека. Гибель клеток регистрировали методом проточной цитометрии при окрашивании красителем Annexin V. На оси Y приводится цитотоксичность (% от максимальной цитотоксичности), а на оси X указана концентрация антитела. Величина ЕС₅₀ дефукозилированных антител MEDI-563 составляет 0,965 пМ.

Фиг. 23. Анализ антител-зависимой клеточной цитотоксичности (ЗАКЦ) in vitro. Активность дефукозилированных и фукозилированных MEDI-563 сравнивали по данным ЗАКЦ in vitro. В качестве клеток-эффекторов и клеток-мишеней использовали изолированные первичные клетки NK-клетки и базофилы, соответственно. На оси Y приводится цитотоксичность (% от максимальной цитотоксичности), а на оси Х указана концентрация антител. Величина ЕС₅₀ дефукозилированных антител MEDI-563 составляет 0,561 пМ.

Фиг. 24. Анализ дегрануляции эозинофилов по данным антител-зависимой клеточной цитотоксичности (ЗАКЦ) in vitro. Высвобождение продуцируемого эозинофилами нейротоксина (ПЭН) анализировали методом ЗАКЦ in vitro в присутствии различных концентраций фукозилированных (MEDI-563F) и дефукозилированных (MEDI-563) анти-ИЛ-5Рα антител. При проведении анализа в качестве клеток-мишеней и клеток-эффекторов использовали свежеизолированные эозинофилы и NK-клетки или клетки РВМС, соответственно. Для сравнения приводится максимальная дегрануляция эозинофилов при обработке 1% тритоном Х-100.

Фиг. 25. MEDI-563 специфично связывается с эпитопом в составе домена D1 внеклеточного фрагмента рецептора ИЛ-5Рα человека. Связывание антитела с трансгенными клетками, временно экспрессирующими гибридные белки ИЛ-5Рα, анализировали проточной цитометрией. На фиг.приводятся профили окрашивания флуоресцентным красителем. ʺПоликлональные антителаʺ и ʺMEDI-563ʺ обозначают профили окрашивания, наблюдаемые при использовании поликлональных антител против ИЛ-5Рα человека и MEDI-563, соответственно. ʺДвойное окрашиваниеʺ обозначает профиль флуоресцентного окрашивания с использованием ʺполиклональныхʺ антител (ось x) и MEDI-563 (ось y). (А) Для серии трансгенов гибридных ИЛ-5Рα человека/мыши наблюдается нестабильная экспрессия. ʺНокаутныеʺ трансгены представляют собой гибридные конструкты ИЛ-5Рα, включающие один внеклеточный домен рецептора мыши в составе основной последовательности (каркаса) рецептора человека. ʺНокинныеʺ трансгены представляют собой гибридные конструкты ИЛ-5Рα, включающие один внеклеточный домен рецептора человека в составе основной последовательности (каркаса) рецептора мыши. (Б) MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими ИЛ-5Рα человека. MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими ИЛ-5Рα мыши. (В) MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридные ИЛ-5Рα, включающие D1 рецептора мыши и внеклеточные домены D2-D3 рецептора человека (ʺнокаутные по D1ʺ). MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридные ИЛ-5Рα, включающие внеклеточные домены D2 или D3 рецептора мыши в составе основной последовательности (каркаса) рецептора человека (ʺнокаутные по D2 или D3ʺ). (Г) MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридные ИЛ-5Рα, включающие домен D1 рецептора человека и внеклеточные домены D2-D3 рецептора мыши (ʺнокинные по D1ʺ). MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα мыши, включающий внеклеточный домен D2 или D3 рецептора человека (ʺнокинные по D2 или D3ʺ).

Фиг. 26. MEDI-563 специфично связывается с эпитопом в составе сегмента В внеклеточного домена D1 рецептора ИЛ-5Рα человека. Антитела, связывающиеся с трансгенными клетками, эспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, анализировали методом проточной цитометрии. На фиг. приводятся профили окрашивания флуоресцентным красителем. ʺПоликлональные антителаʺ и ʺMEDI-563ʺ обозначают профили окрашивания, наблюдаемые при использовании поликлональных антител против ИЛ-5Рα человека и MEDI-563, соответственно. ʺДвойное окрашиваниеʺ обозначает профиль флуоресцентного окрашивания с использованием ʺполиклональныхʺ антител (ось x) и MEDI-563 (ось y). (А) Аминокислотная последовательность внеклеточного домена D1 рецептора ИЛ-5Рα мыши на 75% идентична аналогичной аминокислотной последовательности рецептора ИЛ-5Рα человека. Внеклеточный домен D1 рецептора ИЛ-5Рα подразделяется на сегменты А, В и С. На фиг. приводятся аминокислотные последовательности ИЛ-5Рα человека и мыши, SEQ ID №5 и 6 (1-102), соответственно. (Б) Для серии трансгенов гибридных ИЛ-5Рα человека/мыши наблюдалась нестабильная экспрессия. ʺНокаутныеʺ трансгены представляют собой гибридные конструкты ИЛ-5Рα, включающие один сегмент внеклеточного домена рецептора D1 мыши в составе основной последовательности (каркаса) рецептора человека. ʺНокинныеʺ трансгены представляют собой гибридные конструкты ИЛ-5Рα, включающие один сегмент внеклеточного домена D1 рецептора человека в составе основной последовательности (каркаса) рецептора мыши ʺD1 человека/D2 мыши/D3-ТМ мышиʺ. (В) MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими (1) ИЛ-5Рα человека, или (2) гибридный ИЛ-5Рα мыши, включающий внеклеточный домен D1 человека (нокинный по D1). MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими (1) рецептор ИЛ-5Рα мыши, или (2) гибридный ИЛ-5Рα человека, включающий внеклеточный домен D1 рецептора мыши. (Г) MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими рецептор, включающий сегмент В внеклеточного домена D1 рецептора мыши в составе каркаса рецептора человека (ʺнокаутные по Вʺ). MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий сегмент А или С внеклеточного домена D1 мыши в составе основной последовательности (каркаса) рецептора человека (ʺнокаутный по А или Сʺ). (Д) MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий сегмент В внеклеточного домена D1 в составе основной последовательности (каркаса) рецептора мыши ʺD1 человека/D2 мыши/D3-ТМ мышиʺ (ʺнокинный по Вʺ). MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий сегмент А или С рецептора человека в составе основной последовательности (каркаса) рецептора мыши ʺD1 человека/D2 мыши/D3 мышиʺ, (ʺнокинный по А или Сʺ).

Фиг. 27. MEDI-563 специфично связывается с эпитопом рецептора человека ИЛ-5Рα, включающим аминокислотный остаток Ile61 в составе внеклеточного домена D 1. Антитела, связывающиеся с трансгенными клетками, эспрессирующими вариант ИЛ-5Рα, анализировали методом проточной цитометрии. На фиг. приводятся профили окрашивания флуоресцентным красителем. ʺПоликлональные антителаʺ и ʺMEDI-563ʺ обозначают профили окрашивания, наблюдаемые при использовании поликлональных антител против ИЛ-5Рα человека и MEDI-563, соответственно. ʺДвойное окрашиваниеʺ обозначает профиль флуоресцентного окрашивания с использованием ʺполиклональныхʺ антител (ось x) и MEDI-563 (ось у). (А) На фиг. приводятся аминокислотные последовательности 50-61 внеклеточного домена D1 рецептора ИЛ-5Рα человека (40-61 SEQ ID №5). Остатки, выделенные курсивом, отличаются от соответствующих аминокислотных остатков в составе рецептора ИЛ-5Рα мыши. В трансгенных клетках экспрессируются серии вариантов рецептора ИЛ-5Рα, включающих, по меньшей мере, один мутантный аминокислотный остаток. ʺНокаутныеʺ варианты ИЛ-5Рα представляют собой мутантные белки человека, включающие, по меньшей мере, одну замену аминокислоты в белке человека на соответствующую аминокислоту из белка мыши. Например, вариант ʺнокаут DEʺ представляет собой ИЛ-5Рα человека, включающий замены аминокислот D56E и E58D. ʺНокинныеʺ варианты ИЛ-5Рα представляют собой гибридные белки, включающие D1 мыши, D2 человека, D3 мыши и ТМ домен мыши, где домен D1 мыши включает мутантный сегмент В, содержащий по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка в последовательности белка мыши на соответствующий остаток из последовательности рецептора человека. Например, ʺнокинный DEʺ вариант представляет собой гибридный ИЛ-5Рα, включающий мутантный сегмент В рецептора мыши, содержащий замены аминокислот E56D и D58E. (Б) MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими мутантный ИЛ-5Рα человека, включающий замены аминокислот K53Q, D56E, E58D, I61K (ʺнокаутный по KDEIʺ), MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими мутантный ИЛ-5Рα человека, включающий замены аминокислот N40H, N42D, Q46H (ʺнокаутный по NNQʺ) или D56E, E58D (ʺнокаутный по DEʺ) или N40H, N42D, D56E, E58D (ʺнокаутный по NNDEʺ). (В) MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий мутантный сегмент В рецептора мыши, содержащий замены аминокислот Q53K, E56D, D58E, K61I (ʺнокинный по KDEIʺ). (Г) MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими мутантный ИЛ-5Рα человека, включающий замену I61K (ʺнокаутный по 161ʺ). MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими мутантный ИЛ-5Рα человека, включающий замену K53Q (ʺнокаутный по K53ʺ), (Д) MEDI-563 специфично связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий мутантный сегмент В рецептора мыши, содержащий замену K61I (ʺнокинный по 161ʺ). MEDI-563 не связывается с трансгенными клетками, экспрессирующими гибридный ИЛ-5Рα, включающий мутантный сегмент В рецептора мыши, содержащий замену Q53K (ʺнокинный по K53ʺ).

Фиг. 28. Связывание антитела Н7 против гибридного ИЛ-5α мыши с FcγRs мыши. На фиг. представлена аффинность гибридного анти-ИЛ-5α мыши (Н7) к рекомбинантному FcγRs мыши при сравнении с аффинностью изотипически родственных фукозилированных контрольных антител. Константы диссоциации приводятся в нМ. Анализ проводили методом плазменного поверхностного резонанса.

Фиг. 29. (А) Эозинофилы идентифицировали проточной цитометрией в виде клеток с высоким боковым светорассеянием, которые позитивно окрашивались по CCR3 и Siglec-F. (Б) Эозинофилы из костного мозга, крови, селезенки и ткани легкого мышей ИЛ-STg селективно экспрессируют ИЛ-5Р.

Фиг. 30. Дефукозилированные и фукозилированные антитела Н7 уменьшают число эозинофилов в селезенке (А), ткани легкого (А) и крови (Б) мышей ИЛ-5Tg. He наблюдается снижения числа эозинофилов в костном мозге (Б). Дефукозилированные антитела Н7 более эффективны при удалении эозинофилов по сравнению с фукозилированными Н7, прежде всего при использовании низких доз антител. Данные представлены в виде среднего значения ±СО, число мышей в группе n=6-8, при проведении анализа с использованием указанных антител по сравнению с контрольными IgG p<0,05, критерий U Манна-Уитни U.

Фиг. 31. Дефукозилированные Н7 также уменьшают число эозинофилов в модели стимуляции аллергеном. Дефукозилированные Н7 уменьшают число эозинофилов в просвете дыхательных путей человека, в ткани легких, крови и костном мозге. Снижение было максимальным во всех отделах организма через 72 ч после конечной стимуляции (96 ч после введения антител). Данные представлены в виде среднего значения ±СО, число мышей в группе n=6, при проведении анализа с использованием указанных антител по сравнению с контрольными IgG *р<0,05, критерий U Манна-Уитни U.

Подробное описание изобретения

Как указано выше без привлечения конкретной гипотезы или теории, эозинофилы принимают участие в патогенезе множества заболеваний и нарушений. Многие из указанных заболеваний или нарушений характеризуются высоким уровнем эозинофилов (эозинофолия) и называются гиперэозинофильными синдромами.

Примерами заболеваний и нарушений, в которых принимают участие эозинофилы, являются астма, иммуноглобулин (IgE)-опосредованная пищевая аллергия, эозинофильный эзофагит (воспаление пищевода), воспалительное заболевание кишечника, ХОЗЛ, аллергический колит, гастро-эзофагеальный рефлюкс, эозинофильное желудочно-кишечное заболевание (ЭЖКЗ), эозинофильный гастроэнтерит, эндомиокардиальный фиброз, эндокардит Леффлера, болезнь Девиса, эпизодический отек Квинке, ассоциированный с эозинофилией, синдром эозинофилии-миалгии/синдром токсичного масла, зарегистрированный в Испании, цирроз печени, герпетиформный дерматит, буллезный пемфигоид, синдром Чарга-Стросса, острый миелогенный эозинофильный лейкоз, острый лимфоцитарный эозинофильный лейкоз, системный мастоцитоз с эозинофилией, аллергический ринит, экзема, гранулематоз Вегенера, нодозный полиартериит, эозинофильный фасцит и ревматоидный артрит.

Таким образом, в изобретении предлагается способ снижения числа эозинофилов в организме человека, который заключается в том, что указанному пациенту вводят соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, которое включает (а) фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р и (б) Fc-фрагмент иммуноглобулина.

В одном варианте изобретения предлагаются способы снижения числа эозинофилов в организме человека, которые заключаются в том, что указанному пациенту вводят соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, которое включает (а) фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р и (б) Fc-фрагмент иммуноглобулина. В конкретном варианте способ по изобретению уменьшает число эозинофилов в крови, костном мозге, желудочно-кишечном тракте (например, в пищеводе, желудке, тонкой кишке и ободочной кишке) или легком. В еще одном конкретном варианте способ по изобретению уменьшает число эозинофилов в крови. В еще одном конкретном варианте способ по изобретению уменьшает число эозинофилов в легких. В конкретном варианте способ по изобретению уменьшает число клеток-предшественников эозинофилов.

В другом варианте способ по изобретению уменьшает число эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 95% или по меньшей мере на приблизительно 99%. В конкретном варианте способ по изобретению уменьшает число эозинофилов ниже предела детектирования.

В другом варианте способ по изобретению уменьшает число предшественников эозинофилов по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 95% или по меньшей мере на приблизительно 99%. В конкретном варианте способ по изобретению уменьшает число предшественников эозинофилов ниже предела детектирования.

В другом варианте способ по изобретению элиминирует все детектируемые эозинофилы после однократного введения соединения, связывающегося с ИЛ-5Р. В конкретном варианте однократное введение соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, элиминирует все детектируемые эозинофилы по меньшей мере на приблизительно 1 день, по меньшей мере на приблизительно 2 дня, по меньшей мере на приблизительно 3 дня, по меньшей мере на приблизительно 4 дня, по меньшей мере на приблизительно 5 дней, по меньшей мере на приблизительно 6 дней, по меньшей мере на приблизительно 7 дней, по меньшей мере на приблизительно 2 недели, по меньшей мере на приблизительно 3 недели, по меньшей мере на приблизительно 4 недели, по меньшей мере на приблизительно 5 недель, по меньшей мере на приблизительно 6 недель, по меньшей мере на приблизительно 7 недель, по меньшей мере на приблизительно 8 недель, по меньшей мере на приблизительно 9 недель, по меньшей мере на приблизительно 10 недель, по меньшей мере на приблизительно 12 недель, по меньшей мере на приблизительно 14 недель, по меньшей мере на приблизительно 16 недель, по меньшей мере на приблизительно 20 недель или по меньшей мере на приблизительно 25 недель.

В другом варианте способ по изобретению элиминирует все детектируемые предшественники эозинофилов после однократного введения соединения, связывающегося с ИЛ-5Р. В конкретном варианте однократное введение соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, элиминирует все детектируемые эозинофилы по меньшей мере на приблизительно 1 день, по меньшей мере на приблизительно 2 дня, по меньшей мере на приблизительно 3 дня, по меньшей мере на приблизительно 4 дня, по меньшей мере на приблизительно 5 дня, по меньшей мере на приблизительно 6 дней, по меньшей мере на приблизительно 7 дней, по меньшей мере на приблизительно 2 недели, по меньшей мере на приблизительно 3 недели, по меньшей мере на приблизительно 4 недели, по меньшей мере на приблизительно 5 недель, по меньшей мере на приблизительно 6 недель, по меньшей мере на приблизительно 7 недель, по меньшей мере на приблизительно 8 недель, по меньшей мере на приблизительно 9 недель, по меньшей мере на приблизительно 10 недель, по меньшей мере на приблизительно 12 недель, по меньшей мере на приблизительно 14 недель, по меньшей мере на приблизительно 16 недель, по меньшей мере на приблизительно 20 недель или по меньшей мере на приблизительно 25 недель.

В конкретном варианте способ по изобретению включает введение субъекту однократной дозы 0,03 мг/кг соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, которое включает (а) фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р и (б) Fc-фрагмент иммуноглобулина, причем введение соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, приводит к снижению числа эозинофилов в кровотоке субъекта по меньшей мере на приблизительно 99%, а снижение заканчивается через 24 ч после введения и продолжается в течение по меньшей мере приблизительно 28 дней после введения.

В конкретном варианте способ по изобретению включает введение субъекту однократной дозы 0,1 мг/кг соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, которое включает (а) фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р и (б) Fc-фрагмент иммуноглобулина, причем введение соединения, связывающегося с ИЛ-5Р, приводит к снижению числа эозинофилов в кровотоке субъекта по меньшей мере на приблизительно 99%, а снижение заканчивается через 24 ч после введения и продолжается в течение по меньшей мере приблизительно 84 дней после введения.

В одном варианте соединения по настоящему изобретению, которые связываются с ИЛ-5Р, включает гибридные белки. В некоторых вариантах гибридные белки включают полипептидный фрагмент, который специфично связывается с ИЛ-5Р, а также Fc-фрагмент иммуноглобулина. Примеры полипептидного фрагмента, который специфично связывается с ИЛ-5Р, приводятся в US 7109299, 5677280 и в заявке US 2006/0014680 А1. В других вариантах полипептид, который специфично связывается с ИЛ-5Р, представляет собой ИЛ-5 человека (см., например, Tanabi и др., Journal of Biological Chemistry, 262 (34), 16580-16584 (1987)), или его фрагменты, производные или варианты (см., например, US 6465616).

В одном варианте соединения по настоящему изобретению, которые связываются с ИЛ-5Р, включают антитела. Антитела по настоящему изобретению включают, но, не ограничиваясь только ими, моноклональные антитела, синтетические антитела, полиспецифичные антитела (включая биспецифичные антитела), антитела человека, гуманизированные антитела, гибридные антитела, одноцепочечные Fvs (scFv) (включая биспецифичные scFvs), одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab’)-фрагменты, связанные дисульфидной связью Fvs (sdFv) и эпитоп-связывающие фрагменты любого из указанных выше антител. Антитела по настоящему изобретению прежде всего включают иммуноглобулины и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулинов, т.е., соединения, которые содержат антиген-связывающий участок, который специфично связывается с антигеном. Иммуноглобулины по изобретению включают белки любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.

Антитела, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают антитела, которые образуются в организме любого животного, включая птиц и млекопитающих (например, но, не ограничиваясь только ими, человека, мышей, обезьян, овец, кроликов, коз, морских свинок, верблюдов, лошадей и цыплят). В конкретных вариантах используются антитела человека или гуманизированные моноклональные антитела.

Антитела, которые можно использовать по настоящему изобретению, представляют собой моноспецифичные, биспецифичные, триспецифичные или полиспецифичные антитела. Полиспецифичные антитела специфично связываются с полипептидом, а также с гетерологичным эпитопом, таким как гетерологичный полипептид или материал твердой подложки. См.. например, WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360 и WO 92/05793, Tutt и др., J. Immunol., 147, 60-69 (1991), US 4474893, 4714681, 4925648, 5573920 и 5601819, и Kostelny и др., J. Immunol., 148, 1547-1553 (1992).

Антитела для применения по настоящему изобретению могут представлять собой одноцепочечные антитела. Схема и конструкция одноцепочечных антител описаны в статье Marasco и др., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 7889-7893 (1993).

Примеры антител по изобретению приводятся в US 7179464, 6538111, 6018032 и в заявках US 2004/0136996 A1 и 2005/0226867 А1.

В одном варианте соединения по настоящему изобретению, которые связываются с ИЛ-5Р, включают антитела. В другом варианте соединения по настоящему изобретению, которые связываются с ИЛ-5Р, представляют собой антитела, включающее любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID №1-4. В конкретном варианте соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, по настоящему изобретению представляет собой антитела, включающее аминокислотную последовательность SEQ ID №1 и 3. В конкретном варианте соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, по настоящему изобретению представляет собой антитела, включающее аминокислотную последовательность SEQ ID №2 и 4.

В одном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с таким эпитопом как MEDI-563. В конкретном варианте антителам является MEDI-563. В другом конкретном варианте соединение, связывающееся с ИЛ-5Р, по настоящему изобретению представляет собой антитела, которое специфично связывается с таким эпитопом как MEDI-563 при условии, что антитела не является MEDI-563.

В одном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 1-102 SEQ ID №5. В конкретном варианте антителам является MEDI-563. В другом конкретном варианте антитела по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 1-102 SEQ ID №5 при условии, что антитела не является MEDI-563.

В одном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 40-67 SEQ ID №5. В конкретном варианте антителам является MEDI-563. В другом конкретном варианте антитела по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 40-67 SEQ ID №5 при условии, что антитела не является MEDI-563.

В одном варианте соединение по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 52-67 SEQ ID №5. В конкретном варианте антителам является MEDI-563. В другом конкретном варианте антитела по настоящему изобретению, которое связывается с ИЛ-5Р, представляет собой антитела, которое специфично связывается с эпитопом, включающим аминокислотные остатки 52-67 SEQ ID №5