Полипептиды с лизоцимной активностью и полинуклеотиды, кодирующие их

Полипептиды с лизоцимной активностью и полинуклеотиды, кодирующие их

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данная заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, который включен в данный документ с помощью ссылки.

ССЫЛКА НА АТОМНЫЕ КООРДИНАТЫ

В данной заявке на фигуре 6 изложены атомные координаты трехмерной структуры лизоцима Acremonium alkalophilum CBS114.92.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к полипептидам с лизоцимной активностью, каталитическим доменам и полинуклеотидам, кодирующим полипептиды и каталитические домены. Настоящее изобретение также относится к конструктам нуклеиновой кислоты, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды, а также к способам получения и применения полипептидов и каталитических доменов.

Описание уровня техники

Лизоцим представляет собой О-гликозилгидролазу, продуцируемую в качестве защитного механизма против бактерий многими организмами. Фермент вызывает гидролиз клеточных стенок бактерий путем расщепления гликозидных связей пептидогликана; важной структурной молекулы у бактерий. После того как их клеточные стенки были ослаблены действием лизоцима, бактериальные клетки лизируются в результате воздействия осмотического давления.

Лизоцим встречается у многих организмов, таких как вирусы, растения, насекомые, птицы, рептилии и млекопитающие. У млекопитающих лизоцим был выделен из носового секрета, слюны, слез, кишечника, мочи и молока. Фермент расщепляет гликозидные связи между атомом углерода номер 1 N-ацетилмурамовой кислоты и атомом углерода номер 4 N-ацетил-D-глюкозамина. In vivo эти два углевода полимеризуются с образованием полисахарида клеточной стенки.

Существует возрастающая заинтересованность в потенциале лизоцимных ферментов в качестве противомикробных средств. Например, была продемонстрирована активность лизоцима в отношении таких патогенов, как Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Enterococcus faecium, Bacillus stearothermophilus, Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium periringens, Clostridium sporogenes, Clostridium tyrobutyricum и Listeria monocytogenes.

Лизоцим был отнесен к пяти различным семействам гликозидгидролаз (GH) (CAZy, www.cazy.org): лизоцим белка куриного яйца (GH22), лизоцим белка куриного яйца (GH23), лизоцим бактериофага Т4 (GH24), белок жгутика Sphingomonas (GH73) и лизоцимы Chalaropsis (GH25). Лизоцимы из семейств GH23 и GH24 известны преимущественно у бактериофагов и не были идентифицированы у грибов. Оказалось, что лизоцим семейства GH25 не является структурно родственным с другими семействами лизоцима.

Предлагалось применение лизоцима в корме для животных (см., например, W0 00/21381 и WO 04/026334), при производстве сыра (см., например, WO 05/080559), консервации пищевых продуктов (Hughey and Johnson (1987) Appl Environ Microbiol 53:2165), как моющий средств (см., например, US 5041236 и ЕР 0425016), при уходе за полостью рта (см., например, US 4355022, WO 04/017988 и WO 08/124764), в косметологии и дерматологии, контрацепции, урологии и гинекологии (см., например, WO 08/124764).

Лизоцим GH25 был описан у Chalaropsis (Felsch JW, Ingagami Τ, and Hash JH. (1975), ʺThe N,Ο-Diacetylmuramidase of Chalaropsis species; V The complete amino acid sequence, J. Biol. Chem. 250(10): 3713-3720).

Лизоцим белка куриного яйца, который представляет собой основной продукт, доступный на коммерческом рынке, не расщепляет N,6-O-диацетилмурамидазу, например, в клеточных стенках Staphylococcus aureus и, следовательно, не способен лизировать этот важный патоген человека среди прочих (Masschalck В, Deckers D, Michiels CW (2002), ʺLytic and nonlytic mechanism of inactivation of gram-positive bacteria by lysozyme under atmospheric and high hydrostatic pressureʺ, J Food Prot. 65(12): 1916-23).

Наблюдали, что разные лизоцимы характеризовались разными специфичностями в отношении разных микроорганизмов. Таким образом, желательно иметь несколько доступных лизоцимов для того, чтобы была возможность выбора подходящих ферментов для каждого конкретного применения. Таким образом, новые полипептиды с лизоцимной активностью являются желательными.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенным грибковым полипептидам, принадлежащим к семейству GH25 и обладающим лизоцимной активностью.

Настоящее изобретение дополнительно относится к выделенным полипептидам с лизоцимной активностью, выбранным из группы, состоящей из:

а) полипептида, последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична зрелому полипептиду из SEQ ID NO: 4 или зрелому полипептиду из SEQ ID NO: 8;

(b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична кодирующей зрелый полипептид последовательности из SEQ ID NO: 3; кодирующей зрелый полипептид последовательности из SEQ ID NO: 7;

(c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях умеренно-высокой жесткости с кодирующей зрелый полипептид последовательностью из SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7, или последовательностью полной длины, комплементарной ей;

d) варианта зрелого полипептида из SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8, содержащего замену, делецию и/или вставку в одном или более (например, нескольких) положениях; и

(е) фрагмента полипептида (а), (b), (с) или (d), который обладает лизоцимной активностью.

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим полипептиды; конструктам нуклеиновых кислот, рекомбинантным векторам экспрессии, рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды; и к способам получения полипептидов.

Более того, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим полипептид согласно настоящему изобретению, таким как моющие композиции, композиции корма для животных и композиции для экстракции бактериальной геномной ДНК.

Настоящее изобретение также относится к полипептидам согласно настоящему изобретению, обладающим противомикробной активностью, и способам применения полипептидов согласно настоящему изобретению в качестве ингибиторов образования биопленки, в моющих средствах, при уходе за зубами, в корме для животных и для разрушения клеточных стенок бактерий.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему сигнальный пептид, содержащий аминокислоты с 1 по 19 в SEQ ID NO: 4 или аминокислоты с -23 по -1 в SEQ ID NO: 8 или состоящий из них, который функционально связан с геном, кодирующим белок; к конструктам нуклеиновых кислот, векторам экспрессии и рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды; и к способам получения белка.

Обзор перечня последовательностей

SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность ДНК гена Р244А7 GH24, которая выделена из Acremonium alkalophilum CBS 114.92.

SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность, которая выведена из SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 представляет собой последовательность ДНК гена Р242М9 GH25, которая выделена из Acremonium alkalophilum CBS114.92.

SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность, которая выведена из SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5 представляет собой прямой праймер F-P242M9.

SEQ ID NO: 6 представляет собой обратный праймер F-P242M9.

SEQ ID NO: 7 представляет собой последовательность ДНК синтетически оптимизированного гена GH25.

SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность, которая выведена из SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 9 представляет собой прямой праймер BamHI.

SEQ ID NO: 10 представляет собой обратный праймер EcoRI.

Краткое описание фигур

На фигуре 1 показаны результаты анализов радиальной диффузии лизоцима GH24 Acremonium alcalophilum (ЕХР03890, SEQ ID NO: 2), лизоцима GH25 Acremonium alcalophilum (EXP03864, SEQ ID NO: 4) и эталонного лизоцима GH25 из Aspergillus fumigatus у S. carnosus и Ε. coli.

На фигуре 2 показана температурная стабильность лизоцима Р242М9 GH25 Acremonium alcalophilum (SEQ ID NO: 4) при 60, 76, 70, 75, 80 и 85°C через 30 или 60 секунд, которую определяют по падению оптической плотности раствора с ресуспендированным Micrococcus luteus АТТС №4698, измеренной на спектрофотометре при 540 нм.

На фигуре 3 показана термостабильность лизоцима GH25 Р242М9 (SEQ ID NO: 4), которую определяют с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) в 50 мМ ацетате Na рН 4,5, 50 мМ ацетате Na с рН 5,5 и 50 мМ MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоте), рН 6,5.

На фигуре 4 показана лизоцимная активность 4 концентраций лизоцима GH25 Р242М9 (SEQ ID NO: 4), синтетического лизоцима GH25 (SEQ ID NO: 8) и 11 вариантов SEQ ID NO: 8, которую определяют по падению оптической плотности раствора ресуспендированного Clostridium perfringens NN01260.

На фигуре 5 показана лизоцимная активность 4 концентраций лизоцима GH25 Р242М9 (SEQ ID NO: 4), синтетического лизоцима GH25 (SEQ ID NO: 8) и 11 вариантов SEQ ID NO: 8, которую определяют по падению оптической плотности раствора ресуспендированным клиническим изолятом Clostridium perfringens.

На фигуре 6 приведены атомные координаты трехмерной структуры лизоцима GH25 Acremonium alkalophilum CBS114.92. Эти атомные координаты могут помочь в создании трехмерной модели, описывающей структуру лизоцима GH25 Acremonium alkalophilum CBS114.92, и трехмерной модели гомологичных структур, таких как варианты вышеупомянутого лизоцима.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Лизоцим. Выражение ʺлизоцимнаяʺ активность определено в данном документе как активность О-гликозилгидролазы, которая катализирует гидролиз гликозидной связи между двумя или более углеводами или между углеводом и неуглеводным фрагментом. Лизоцимы расщепляют гликозидную связь между определенными остатками в мукополисахаридах и мукопептидах клеточных стенок бактерий, как например, 1,4-бета-связи между остатками N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина в пептидогликане и между остатками N-ацетил-D-глкжозамина в хитодекстринах, что приводит в результате к лизису бактерий. Лизоцим принадлежит к классу ферментов ЕС 3.2.1.17. В контексте настоящего изобретения лизоцимную активность определяют в соответствии с анализом помутнения, описанным в примере 4. В одном аспекте полипептиды согласно настоящему изобретению обладают по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% лизоцимной активности зрелого полипептида с одной из SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8.

Аллельный вариант. Выражение ʺаллельный вариантʺ означает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельное разнообразие возникает в естественных условиях вследствие мутации и может приводить в результате к полиморфизму в пределах популяций. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.

Πротивомикробная активность. Выражение ʺпротивомикробная активностьʺ определено в данном документе как активность, которая уничтожает или подавляет рост микроорганизмов, таких как водоросли, археи, бактерии, грибы и/или простейшие. Противомикробная активность может, например, быть бактерицидной, что означает уничтожение бактерий, или бактериостатической, что означает предотвращение роста бактерий. Противомикробная активность может включать катализ гидролиза 1,4-бета-связей между остатками N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина в пептидогликане, а также между остатками N-ацетил-D-глкжозамина в хитодекстринах. Противомикробная активность может также включать связывание лизоцима с поверхностью микроорганизма и подавление его роста. Противомикробный эффект также может включать применение лизоцимов согласно настоящему изобретению для активации бактериальных аутолизинов, в качестве иммуностимулятора, при ингибировании или снижении количества бактериальных токсинов и при воздействии опсонинов. В контексте настоящего изобретения противомикробную активность определяют в соответствии с анализом противомикробной активности, описанным в примере 10.

Измененное/модифицированное свойство. Выражение ʺизмененное/модифицированное свойствоʺ определено как характеристика, связанная с вариантом, которая изменена или модифицирована по сравнению с исходным лизоцимом или идентифицированной эталонной последовательностью. Измененное или модифицированное свойство может представлять собой характеристику, связанную с вариантом, которая улучшена, если не указано иное, по сравнению с другим эталонным лизоцимом или исходным лизоцимом. Примеры свойств, которые могут быть изменены/модифицированы или улучшены, приведены ниже.

Термостабильность. Выражение ʺтермостабильностьʺ относится к лизоцимной активности после периода инкубирования при повышенной температуре по сравнению с исходной или идентифицированной эталонной последовательностью либо в буфере или при условиях, таких как имеющие место во время хранения/транспортировки продукта, или при условиях, подобных имеющим место во время промышленного применения варианта. Вариант может проявлять или не проявлять измененный профиль активности при разных температурах по сравнению с исходной формой. В одном аспекте термостабильность варианта с лизоцимной активностью составляет по меньшей мере в 1,0 раз больше, например, по меньшей мере в 1,1 раза больше, по меньшей мере в 1,5 раза больше, по меньшей мере в 1,8 раза больше, по меньшей мере в 2 раза больше, по меньшей мере в 5 раз больше, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз больше, по меньшей мере в 20 раз больше и по меньшей мере в 25 раз больше термостабильности исходной или эталонной последовательности при выбранной температуре. Предпочтительно активность исследуют с применением анализа активности лизоцима по помутнению, описанном в разделе ʺМатериалы и способыʺ.

Температурный профиль/температурная стабильность. Выражение ʺтемпературный профиль/температурная стабильностьʺ относится к варианту фермента, проявляющему модифицированный температурный профиль по сравнению с исходной или идентифицированной эталонной последовательностью, где температурный профиль определен как зависимость лизоцимной активности от температуры. Активность при каждой температуре предпочтительно указана как относительная активность (в %), нормализованная к значению при оптимальной температуре. Оптимальная температура представляет собой такую температуру в пределах исследуемых температур (т.е. с шагом повышения на 5-10°С), при которых активность является наиболее высокой.

Стабильность при определенном рН. Выражение ʺстабильность при определенном рНʺ относится к варианту фермента, проявляющему структурную стабильность по сравнению с исходным лизоцимом или идентифицированной эталонной последовательностью после периода инкубирования при рН, который находится вне диапазона рН, в котором фермент является активным (диапазон рН, в котором фермент активен). Такой вариант может проявлять или не проявлять измененный профиль активности при разных значениях рН в сравнении с исходной формой. Например, вариант может не быть активным при повышенном или пониженном рН, но он способен сохранять свою трехмерную структуру и затем восстанавливать активность после возвращения к диапазону рН, в котором фермент активен. В качестве альтернативы, вариант может характеризоваться улучшенной способностью к рефолдингу по сравнению с исходной формой после инкубирования при повышенном или пониженном рН.

В одном аспекте профиль стабильности при разных значениях рН изменяют таким образом, что вариант лизоцима характеризуется улучшенной стабильностью при кислом рН. Как применяется в данном документе, кислый рН означает рН от 2 до 5,5, предпочтительно от 2,5 до 5,25, более предпочтительно от 3 до 5, еще более предпочтительно от 3,5 до 4. Предпочтительно, вариант лизоцима сохраняет по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, 70% или 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95% остаточной активности после инкубирования при заданном рН в течение 1 часа по сравнению с вариантом, который поддерживали при при рН 6,5 в течение того же времени. Предпочтительно, остаточная активность варианта лизоцима составляет по меньшей мере в 1,1 раза больше, по меньшей мере в 1,3 раза выше, по меньшей мере в 1,5 раза выше, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза выше, более предпочтительно по меньшей мере в 5 раз выше, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 7 раз выше и еще более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз выше, чем остаточная активность исходного лизоцима или идентифицированной эталонной последовательности, которые были обработаны при тех же условиях. Предпочтительно активность исследуют с применением анализа активности лизоцима по помутнению, описанным в разделе ʺМатериалы и способыʺ.

Активность при определенном рН. Выражение ʺактивность при определенном рНʺ определено в данном документе как проявление изменения профиля активности варианта лизоцима в зависимости от рН по сравнению с профилем зависимости активности от рН исходного лизоцима или идентифицированной эталонной последовательности. Профиль активности в зависимости от рН представляет меру эффективности фермента в предотвращении микробного роста, ликвидации микробных клеток и/или осуществлении катализа реакции гидролиза в диапазоне рН при указанных условиях, таких как температура и состав растворителя. Лизоцим характеризуется конкретным диапазоном рН, в котором полипептид является стабильным и сохраняет ферментативную активность, за пределами этого диапазона лизоцим становится менее активным и возможно также менее стабильным. В пределах диапазона рН обычно присутствует оптимум рН, при котором лизоцим проявляет наиболее высокую активность.

Вариант лизоцима с улучшенной активностью при щелочном рН (например, рН от 7,5 до 12, предпочтительно от 8 до 11, более предпочтительно от 8,5 до 10, еще более предпочтительно от 9 до 9,5) будет способен функционировать в более щелочных средах, как например, в моющих средствах.

Вариант с улучшенной активностью при кислом рН (например, рН от 2 до 6,5, предпочтительно от 2,5 до 6, более предпочтительно от 3 до 5,5, еще более предпочтительно от 3,5 до 5) будет способен функционировать при более кислых условиях, как например, консерванты в определенных пищевых продуктах.

Вариант с улучшенной активностью при рН от нейтрального до слабокислого (например, рН от 4 до 7,0, предпочтительно от 4,5 до 6,5, более предпочтительно от 5 до 6,5) будет способен функционировать при слабокислых или нейтральных условиях, как например, для применения молекулы-эубиотика в кормах, для стабилизации здоровой микрофлоры у животных или при подавлении роста/колонизации кишечника вирусными, паразитическими или бактериальными патогенами в Gl трактах животных.

В одном аспекте профиль активности в зависимости от рН изменяют таким образом, что вариант лизоцима обладает улучшенной активностью при более щелочном рН. Предпочтительно, активность варианта лизоцима при рН по меньшей мере на 0,5 единицы выше, предпочтительно по меньшей мере на 1,0 единицу рН выше, более предпочтительно по меньшей мере на 1,5 единицы рН выше, еще более предпочтительно по меньшей мере на 2,0 единицы рН выше составляет по меньшей мере в 1,1 раза выше, предпочтительно по меньшей мере в 1,5 раза выше, более предпочтительно по меньшей мере в 2 раза выше, еще более предпочтительно по меньшей мере в 5 раз выше и наиболее предпочтительно по меньшей мере в 10 раз выше, чем таковая исходного фермента или идентифицированной эталонной последовательности. Предпочтительно, вариант лизоцима одновременно сохраняет по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, 70%, или 80%, или 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере 100% активности исходного лизоцима или идентифицированная эталонная последовательность проявляет при своем оптимуме рН. Предпочтительно активность исследуют с применением анализа активности лизоцима по помутнению, описанным в разделе ʺМатериалы и способыʺ.

В другом аспекте профиль активности в зависимости от рН изменяют таким образом, что вариант лизоцима обладает улучшенной активностью при более кислом рН. Предпочтительно, активность варианта лизоцима при рН по меньшей мере на 0,5 единицы ниже, предпочтительно по меньшей мере на 1,0 единицу рН ниже, более предпочтительно по меньшей мере на 1,5 единицы рН ниже, еще более предпочтительно по меньшей мере на 2,0 единицы рН ниже составляет по меньшей мере в 1,1 раза выше, предпочтительно по меньшей мере в 1,5 раза выше, более предпочтительно по меньшей мере в 2 раза выше, еще более предпочтительно по меньшей мере в 5 раз выше и наиболее предпочтительно по меньшей мере в 10 раз выше, чем таковая исходного фермента или идентифицированной эталонной последовательности. Предпочтительно, вариант лизоцима одновременно сохраняет по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, 70%, или 80%, или 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере 100% активности исходного лизоцима или идентифицированная эталонная последовательность проявляет при своем оптимуме рН. Предпочтительно активность исследуют с применением анализа активности лизоцима по помутнению, описанным в разделе ʺМатериалы и способыʺ.

Субстратная специфичность. Выражение ʺсубстратная специфичностьʺ относится к специфичности лизоцима в отношении типа бактерии, которую он может уничтожать/подавлять и/или в отношении модельных субстратов лизоцима (например, олигомеров p-NP-(NAG-NAM)n или p-NP-(NAG)m). Путем модификации субстратной специфичности лизоцима можно изменить тип бактерий, которые может уничтожать и/или подавлять лизоцим. В одном аспекте субстратную специфичность лизоцима расширяют, тем самым обеспечивая возможность уничтожения и/или подавления других типов бактерий помимо бактерий, которые может уничтожать и/или подавлять лизоцим дикого типа.

Чувствительность к гликированию. Неферментативное гликирование представляет собой самопроизвольный пострансляционный процесс, при котором восстанавливающие сахара связываются ковалентно со свободными аминогруппами в белках преимущественно по лизиновым (K) остаткам. Гликирование может воздействовать на активность лизоцима. Согласно настоящему изобретению чувствительность лизоцима к неферментативному гликированию можно снизить путем изменения определенных аминокислот.

Улучшенные свойства могут также включать термические свойства, как например, стабильность при гранулировании, стабильность при обработке паром, расширенный профиль активности в зависимости от температуры. Кроме того, улучшенные свойства могут включать чувствительность к протеазам и/или характер гликозилирования. Улучшения предпочтительно оценивают в зависимости от желаемых условий применения.

Каталитический домен. Выражение ʺкаталитический доменʺ означает участок фермента, содержащий каталитический аппарат фермента.

ʺДНК. Выражение ʺкДНКʺ означает молекулу ДНК, которую можно получить посредством обратной транскрипции из зрелой сплайсированной молекулы мРНК, полученной из эукариотической или прокариотической клетки. В кДНК отсутствуют последовательности интронов, которые могут присутствовать в соответствующей геномной ДНК. Исходный, первичный РНК-транскрипт представляет собой предшественник для мРНК, который подвергается процессингу в ходе ряда этапов, в том числе сплайсингу, до того, как станет зрелой сплайсированной мРНК.

Кодирующая последовательность. Выражение ʺкодирующая последовательностьʺ означает полинуклеотид, который непосредственно определяет аминокислотную последовательность полипептида. Границы кодирующей последовательности обычно определяются открытой рамкой считывания, которая начинается со старт-кодона, такого как ATG, GTG или TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как ТАА, TAG или TGA.

Кодирующая последовательность может представлять собой геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК или их сочетание.

Регуляторные последовательности. Выражение ʺрегуляторные последовательностиʺ означает последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего зрелый полипептид согласно настоящему изобретению. Каждая регуляторная последовательность может быть нативной (т.е. из того же гена) или чужеродной [т.е. из отличающегося гена) относительно полинуклеотида, кодирующего полипептид, или нативной или чужеродной друг относительно друга. Такие регуляторные последовательности включают без ограничения лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, последовательность пропептида, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Как минимум, регуляторные последовательности включают промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. В регуляторных последовательностях могут быть предусмотрены линкеры с целью введения специфических сайтов рестрикции, способствующих лигированию регуляторных последовательностей с кодирующим участком полинуклеотида, кодирующего полипептид.

Экспрессия. Выражение ʺэкспрессияʺ включает любой этап, вовлеченный в продуцирование полипептида, в том числе без ограничения транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Вектор экспрессии. Выражение ʺвектор экспрессииʺ означает линейную или циклическую молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, и функционально связана с регуляторными последовательностями, которые обеспечивают ее экспрессию.

Фрагмент. Выражение ʺфрагментʺ означает полипептид или каталитический домен, у которого отсутствуют одна или несколько (например, некоторые) аминокислот с амино- и/или карбоксильного конца зрелого полипептида или домена; причем фрагмент обладает лизоцимной активностью. В одном аспекте фрагмент содержит по меньшей мере 184 аминокислотных остатка (например, аминокислоты с 25 по 208 в SEQ ID NO: 4) или по меньшей мере 195 аминокислотных остатков (например, аминокислоты с 22 по 216 в SEQ ID NO: 4). В одном аспекте фрагмент содержит по меньшей мере 184 аминокислотных остатка (например, аминокислоты с 10 по 193 в SEQ ID NO: 8) или по меньшей мере 195 аминокислотных остатков (например, аминокислоты с 5 по 199 в SEQ ID NO: 8).

Клетка-хозяин. Выражение ʺклетка-хозяинʺ означает любой тип клеток, который является чувствительным к трансформации, трансфекции, трансдукции или и подобному конструктом или вектором экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид согласно настоящему изобретению. Выражение ʺклетка-хозяинʺ охватывает любое потомство исходной клетки, которое не является идентичным исходной клетке вследствие мутаций, которые имеют место в ходе репликации.

Выделенный. Выражение ʺвыделенныйʺ означает вещество в форме или окружении, которые не встречаются в естественных условиях. Неограничивающие примеры выделенных веществ включают (1) любое не встречающееся в естественных условиях вещество, (2) любое вещество, в том числе без ограничения любой фермент, вариант, нуклеиновую кислоту, белок, пептид или кофактор, которые по меньшей мере частично удалены из одной, или нескольких, или всех встречающихся в естественных условиях составляющих, с которыми они связаны в естественных условиях; (3) любое вещество, модифицированное руками человека в сравнении с таким веществом, встречающимся в природе; или (4) любое вещество, модифицированное путем увеличения количества вещества в сравнении с другими компонентами, с которыми оно связано в естественных условиях (например, несколько копий гена, кодирующего вещество; применение более сильного промотора, чем промотор, связанный в естественных условиях с геном, кодирующим вещество). Выделенное вещество может присутствовать в образце ферментативного бульона.

Зрелый полипептид. Выражение ʺзрелый полипептидʺ означает полипептид в его конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как процессинг N-концевой части, усечение С-концевой части, гликозилирование, фосфорилирование и т.д. В одном аспекте зрелый полипептид представляет собой аминокислоты с 20 по 227 в SEQ ID NO: 4 или аминокислоты с 1 по 208 в SEQ ID NO: 8 на основании данных программы SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), с помощью которой предсказали, что аминокислоты с 1 по 19 в SEQ ID NO: 4 и аминокислоты с -40 по -18 в SEQ ID NO: 8 представляют собой сигнальные пептиды. Из уровня техники известно, что клетка-хозяин может продуцировать смесь двух или более разных зрелых полипептидов (т.е. с разными С-концевыми и/или N-концевыми аминокислотами), экспрессируемых одним тем же полинуклеотидом.

Кодирующая зрелый полипептид последовательность. Выражение ʺкодирующая последовательность зрелого полипептидаʺ означает полинуклеотид, который кодирует зрелый полипептид, обладающий лизоцимной активностью. В одном аспекте кодирующая зрелый полипептид последовательность представляет собой объединенную последовательность из нуклеотидов с 58 по 147 и нуклеотидов с 302 по 835 в SEQ ID NO: 3, а также нуклеотидов с 121 по 744 в SEQ ID NO: 7 на основе данных программы SignalP (Nielsen et al., 1997, выше), с помощью которой предсказали, что нуклеотиды с 1 по 63 в SEQ ID NO: 3 и нуклеотиды с 1 по 69 в SEQ ID NO: 7 кодируют сигнальные пептиды.

Конструкт нуклеиновой кислоты. Выражение ʺконструкт нуклеиновой кислотыʺ означает либо одно- либо двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, которая является выделенной из встречающегося в естественных условиях гена или является до некоторой степени модифицированной с тем, чтобы она содержала сегменты нуклеиновых кислот, которая в ином случае не может существовать в естественных условиях, или которая является синтетической, которая содержит одну или несколько регуляторных последовательностей.

Функционально связанный. Выражение ʺфункционально связанныйʺ означает конфигурацию, в которой регуляторная последовательность размещена в соответствующем положении относительно кодирующей последовательности полинуклеотида так, что регуляторная последовательность управляет экспрессией кодирующей последовательности.

Идентичность последовательности. Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром ʺидентичность последовательностиʺ.

В контексте целей настоящего изобретения идентичность последовательности у двух аминокислотных последовательностей определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который применен в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версия 5.0.0 или более поздняя. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия EMBOSS с BLOSUM62). Выводимые данные в Needle, помеченные ʺнаиболее длинный идентичный участокʺ (полученные с применением опции nobrief), применяют в качестве процентной идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные остатки ×100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).

В контексте настоящего изобретения идентичность последовательности у двух последовательностей дезоксирибонуклеотидов определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), который применен в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно версия 5.0.0 или более поздняя. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EDNAFULL (версия EMBOSS с NCBI NUC4.4). Выводимые данные в Needle, помеченные ʺнаиболее длинный идентичный участокʺ (полученные с применением опции nobrief), применяют в качестве процентной идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные дезоксирибонуклеотиды ×100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).

Условия жесткости. Условия различной жесткости определены ниже.

Выражение ʺусловия очень низкой жесткостиʺ означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°С в 5Х SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл разрезанной и денатурированной ДНК спермы лосося и 25% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в конце промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2Х SSC, 0,2% SDS при 45°С.

Выражение ʺусловия низкой жесткостиʺ означает в отношении зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°С в 5Х SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл разрезанной и денатурированной ДНК спермы лосося и 25% формамиде после стандартной процедуры Саузерн-блоттнига в течение 12-24 часов. Материал-носитель в конце промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2Х SSC, 0,2% SDS при 50°С.

Выражение ʺусловия умеренной жесткостиʺ означает в отношении зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°С в 5Х SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл разрезанной и денатурированной ДНК спермы лосося и 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в конце промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2Х SSC, 0,2% SDS при 55°С.

Выражение ʺусловия умеренно-высокой жесткостиʺ означает в отношении зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°С в 5Х SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл разрезанной и денатурированной ДНК спермы лосося и 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в конце промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2Х SSC, 0,2% SDS при 60°С.

Выражение ʺусловия высокой жесткостиʺ означает в отношении зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°С в 5Х SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл разрезанной и денатурированной ДНК спермы лосося и 50% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в конце промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2Х SSC, 0,2% SDS при 65°С.

Выражение ʺусловия очень высокой жесткостиʺ означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°С в 5Х SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл разрезанной и денатурированной ДНК спермы лосося и 50% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в конце промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2Х SSC, 0,2% SDS при 70°С.

Подпоследовательность. Выражение ʺподпоследовательностьʺ означает полинуклеотид, у которого отсутствуют один или несколько (например, некоторые) нуклеотидов с 5ʹ и/или 3ʹ конца кодирующей последовательности зрелого полипептида; причем подпоследовательность кодирует фрагмент, обладающий лизоцимной активностью. В одном аспекте подпоследовательность содержит по меньшей мере 552 нуклеотида (например, объединенная последовательность из нуклеотидов с 73 по 147 и нуклеотидов с 302 по 778 в SEQ ID NO: 3) или по меньшей мере 585 нуклеотидов (например, объединенная последовательность из нуклеотидов с 64 по 147 и нуклеотидов с 302 по 802 в SEQ ID NO: 3). В дополнительном аспекте подпоследовательность содержит по меньшей мере 552 нуклеотида (например, последовательность из нуклеотидов с 148 по 699 в SEQ ID NO: 7) или по меньшей мере 585 нуклеотидов (например, последовательность из нуклеотидов с 133 по 717 в SEQ ID NO: 7).

Практически чистый полинуклеотид. Выражение ʺпрактически чистый полинуклеотидʺ означает, что препарат полинуклеотида не содержит других посторонних или нежелательных нуклеотидов и в форме, подходящей для применения в системах для получения созданных методами генной инженерии полипептидов. Таким образом, практически чистый полинуклеотид содержит не более 10%, не более 8%, не более 6%, не более 5%, не более 4%, не более 3%, не более 2%, не более 1% и не более 0,5% по весу отличного от полинуклеотида материала, с которым они связаны в своем естественном состоянии или при получении с помощью рекомбинации. По сути чистый полинуклеотид, тем не менее, может включать встречающиеся в естественных условиях 5ʹ и 3ʹ нетранслируемые участки, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительно, полинуклеотид является по меньшей мере на 90% чистым, например, по меньшей мере на 92% чистым, по меньшей мере на 94% чистым, по меньшей мере на 95% чистым, по меньшей мере на 96% чистым, по меньшей мере на 97% чистым, по меньшей мере на 98% чистым, по меньшей мере на 99% чистым и по меньшей мере на 99,5% чистым по весу. Полинуклеотиды согласно настоящему изоб