Конъюгаты антагонистов интегрина для нацеленной доставки к клеткам, экспрессирующим альфа-v-бета-3

Конъюгаты антагонистов интегрина для нацеленной доставки к клеткам, экспрессирующим альфа-v-бета-3

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к синтезу и реакции эффективных и селективных низкомолекулярных антагонистов интегрина, содержащих подходящие линкеры и функциональные группы для химической реакции с другими молекулами, содержащими реакционно-способные нуклеофильные группы, например тиольные группы, для образования ковалентной связи между молекулой, которую нужно конъюгировать, и нацеливающим фрагментом. Низкомолекулярные нацеливающие антагонисты связываются с распознаваемыми ими системами рецепторов, как, например, антагонисты рецептора интегрина типа альфа-V-бета-3 (αVβ3) с димером αVβ3. Ковалентно связываемые молекулы включают низкомолекулярные терапевтические вещества, полимеры, пептиды и олигонуклеотиды. Сюда входят 5ʹ-тиосодержащие олигонуклеотиды для получения производных 5ʹ-тио-миРНК в качестве средств для обеспечения нацеленной доставки указанных миРНК. Такие дериватизированные миРНК в составе конъюгата с подходящими агентами для трансфекции способствуют селективной доставке миРНК в клетки, экспрессирующие такие рецепторы интегрина, таким образом предотвращая экспрессию целевых генов за счет РНК-интерференции (РНКи).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Интегрин αVβ3 типа представляет собой рецептор витронектина [Hermann, P. et al. "The vitronectin receptor and its associated CD47 molecule mediates proinflammatory cytokine synthesis in human monocytes by interaction with soluble CD23" [The Journal of cell biology 144 (1999): 767-75]. Он состоит из двух компонентов, интегрина альфа V и интегрина бета 3 (CD61) и экспрессируется тромбоцитами и клетками других типов. Было показано, что ингибиторы αVβ3, такие как этарацизумаб, можно применять в качестве антиангиогенных средств.

РНК-интерференция - хорошо известный процесс, при котором трансляция информационной РНК (иРНК) в белок затруднена за счет ассоциации или связывания комплементарных или частично комплементарных олигонуклеотидов, таких как малая интерферирующая РНК (миРНК), короткая шпилечная РНК (кшРНК), микро-РНК (миРНК) или антисмысловые олигонуклеотиды. Молекулы миРНК представляют собой двуспиральные молекулы РНК, длиной обычно в интервале 19-25 нуклеотидов, которые образуют ассоциаты с рядом белков в цитоплазме, известных как RISC (индуцированный РНК комплекс сайленсинга). В конечном итоге RISC разделяет двуспиральную миРНК, давая возможность одной цепи связаться или образовать ассоциат с комплементарным или частично комплементарным участком молекулы иРНК, после чего иРНК разрушается под действием RISC, или ее трансляция предупреждается иным путем, вследствие чего подавляется экспрессия кодируемого белка или продукта гена.

Одна из проблем в использовании нуклеиновых кислот, таких как миРНК, в терапевтических целях (в частности, для систематического введения у человека) заключается в доставке нуклеиновых кислот: (1) к конкретной целевой ткани или типам клеток и (2) к цитоплазме указанных клеток (т.е. туда, где указанная иРНК присутствует и транслируется в белок). Проблема доставки частично обусловлена тем фактом, что нуклеиновые кислоты отрицательно заряжены и легко разрушаются (особенно, если они не модифицированы), эффективно фильтруются почками, и их нельзя как таковые легко транспортировать в цитоплазму. Таким образом, основная масса исследований сфокусирована на разрешении проблемы доставки с помощью различных носителей и композиций, включая лизосомы, мицеллы, пептиды, полимеры, конъюгаты и аптамеры. См., например: Ling et al, Advances in Systemic siRNA Delivery, Drugs Future 34(9): 721 (September 2009). Некоторые более перспективные средства доставки включают применение липидных систем, включая липидные наночастицы. См., например: Wu et al., Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery, AAPS J. 11(4): 639-652 (December 2009); Международная Заявка на патент №WO 2010/042877, Hope et al ("Improved Amino Lipids And Methods For the Delivery of Nucleic Acids"). Тем не менее, сохраняется необходимость в дальнейшем улучшении нацеленной доставки миРНК; а также в таких веществах, как низкомолекулярные соединения, пептиды, другие нуклеиновые кислоты, флуоресцирующие молекулы и полимеры, для конкретных целевых клеток и цитоплазмы таких клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы I:

где R1, R2 и n определены в подробном описании и формуле изобретения. В частности, настоящее изобретение относится к соединениям формулы I для улучшенной доставки конъюгированных молекул, таких как низкомолекулярные вещества, пептиды, нуклеиновые кислоты, флуоресцирующие молекулы и полимеры, к клеткам-мишеням, экспрессирующим димер αVβ3, для различных терапевтических целей и других видов применения. Настоящее изобретение относится также к способам изготовления и применения таких соединений.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1а: В Табл. 1. представлен состав конкретных дериватизированных по 5ʹ-концу одинарных и двойных цепей миРНК.

Фиг. 1b: В Табл. 2 представлены данные анализа для низкомолекулярных конъюгатов миРНК.

Фиг. 1c: В Табл. 3 представлены активности низкомолекулярных конъюгатов миРНК в анализах антагонистов интегрина и данные по KD для миРНК.

Фиг. 1d: В Табл. 4 представлены идентичность, характеристика и связывающая активность меченых изомером FITC реагентов.

На Фиг. 1е представлена гистограмма (красный: Дуплекс-27 500 нМ и Пример 140, 10 мкМ; зеленый: Дуплекс-27).

На Фиг. 2 представлен пример отображения захвата миРНК (Дуплекс-27 (500 нМ).

На Фиг. 3 представлены изображения клеток Jurkat с FITC, конъюгированным с соединением из Примера FITC-5 (LFA-1 антагонист-меченный FITC) при концентрации 10 мкМ.

На Фиг. 4 представлены изображения клеток Jurkat с FITC, конъюгированным с соединением из Примера FITC-14 (VLA-4 антагонист-меченный FITC) в концентрации 10 мкМ. На гистограмме показан сдвиг в присутствии дуплекса миРНК с элементом, нацеливающим на VLA-4. В присутствии антагониста VLA-4 из примера 140, указанный сдвиг оказывается сжатым.

На Фиг. 5 показано снижение экспрессии АНА1 в клетках H1299 при их обработке дуплексами миРНК, которые были дериватизированы по 5ʹ-смысловой цепи с помощью низкомолекулярного соединения, нацеливающего к интегрину. Y-ось отображает наблюдаемый уровень экспрессии АНА1. Более низкий столбик отражает более высокую степень выключения (более высокую степень трансфекции миРНК); высокий столбик - более низкую степень выключения (т.е. более низкую степень трансфекции миРНК). Дуплексы голубого цвета включают нацеливающую модификацию на 5ʹ-конце смысловой цепи; дуплексы розового цвета содержат нацеливающую модификацию на 5ʹ-конце смысловой цепи, а также флюорофор Nu547, присоединенный по 5ʹ-концу антисмысловой цепи.

На Фиг. 6 показаны уровни экспрессии иРНК GAPDH, маркера клеточного здоровья. Идентичность уровней экспрессии для тех клеток, которые были обработаны дериватизированной миРНК, по сравнению обработанными холостым образцом и необработанными клетками, говорит об отсутствии токсичности для клеток при используемых концентрациях и длительности обработки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не указано иное, следующие специфические термины и выражения, используемые в описании и формуле изобретения, имеют приведенные ниже определения.

Термин "радикал" обозначает атом или группу химически связанных атомов, которые присоединены к другому атому или молекуле посредством одной или более химических связей, составляя таким образом часть молекулы. Например, переменные R1 и R2 формулы I обозначают радикалы, которые присоединены к структуре, изображенной на формуле I, посредством ковалентной связи, где это указано.

Термин "конъюгированный фрагмент" обозначает структуру, представляющую собой терапевтическое средство или полезное соединение, пептид, полимер, низкомолекулярное вещество, флюоресцирующую молекулу, олигонуклеотид или нуклеиновую кислоту. Примерами являются лекарственные вещества, терапевтические пептиды, антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК и флюоресцеинизотиоцианат (FITC).

Если не указано иное, термин "водород" или "гидро" обозначает радикал, состоящий из атома водорода (-Н), а не Н₂.

Термин "галоген" обозначает радикал фтора, хлора, бром или йода.

Термин "алкил" обозначает моновалентную линейную или разветвленную насыщенную углеводородную группу, включающую от 1 до 12 атомов углерода. В частных воплощениях алкил включает от 1 до 7 атомов углерода, и в частности, от 1 до 4 атомов углерода. Примеры алкила включают метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил или трет-бутил. Термин "TFA" обозначает трифторуксусную кислоту.

Если не указано иное, термин "соединение формулы" или "соединения формулы" обозначает любое соединение, выбранное из рода соединений, охватываемых указанной формулой (включая любые фармацевтически приемлемые соль или эфир любого такого соединения, если не указано иное).

Термин "фармацевтически приемлемые соли" обозначает такие соли, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства свободных оснований или свободных кислот, которые не являются нежелательными с биологической или иной точки зрения. Такие соли могут быть образованы неорганическими кислотами, такими как хлороводородная кислота, бромоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п., предпочтительно хлороводородная кислота, и органическими кислотами, такими как уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, салициловая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, N-ацетилцистеин и т.п. Кроме того, соли можно получать добавлением неорганического основания или органического основания к свободной кислоте. Соли, образованные неорганическим основанием, включают, без ограничения, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния и т.п. Соли, образованные органическими основаниями, включают, без ограничения, соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, включая природные замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы, такие как изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин, этаноламин, лизин, аргинин, N-этилпиперидин, пиперидин, полиаминовые смолы и т.п. В зависимости от природы заместителей, соединения по настоящему изобретению могут существовать также в форме цвиттер-ионов.

Соединения по настоящему изобретению могут присутствовать в форме фармацевтически приемлемых солей. Соединения по настоящему изобретению могут также присутствовать в форме фармацевтически приемлемых эфиров (т.е. метиловых и этиловых эфиров кислот формулы I для применения в качестве пролекарств). Соединения по настоящему изобретению можно также сольватировать, т.е. гидратировать. Сольватацию можно осуществлять в ходе процесса получения или она может протекать как следствие гигроскопических свойств изначально безводного соединения формулы I (гидратация).

Соединения, которые имеют одинаковую молекулярную формулу, но различаются по природе или последовательности связей составляющих атомов или расположения атомов в пространстве носят название "изомеры". Изомеры, которые различаются по расположению атомов в пространстве, называются "стереоизомеры". Диастереомеры представляют собой стереоизомеры с противоположной конфигурацией при одном или более хиральных центров, которые не являются энантиомерами. Стереоизомеры, включающие один или более асимметрических центров, представляющие собой несовместимые друг с другом зеркальные отображения друг друга, носят название "энантиомеры". Если соединение содержит асимметрический центр, например, если атом углерода связан с четырьмя различными группами, возможна пара энантиомеров. Энантиомер можно охарактеризовать по абсолютной конфигурации его асимметрического центра или центров, и она описывается правилами для определения R- и S-конфигурации Канна, Ингольда и Прелонга, или же исходя из того, каким образом данная молекула вращает плоскость поляризованного света, и обозначается как правовращающий или левовращающий (т.е. как (+) или (-)-изомеры, соответственно). Хиральное соединение может существовать как в виде индивидуального энантиомера, так и в виде их смеси. Смесь, содержащая равные части энантиомеров, называется "рацемическая смесь".

Термин "терапевтически эффективное количество" обозначает количество соединения, которое эффективно для предотвращения, облегчения или улучшения симптомов заболевания или удлинения срока жизни субъекта, которому проводят лечение. Определение терапевтически эффективного количества находится в компетенции специалиста в данной области техники. Терапевтически эффективное количество или дозировка соединения по настоящему изобретению может изменяться в широких пределах и ее можно определять способом, известным в данной области техники. Такую дозировку следует подбирать в соответствии с индивидуальными требованиями в каждом конкретном случае, включая конкретное вводимое(ые) соединение(я), способ введения, состояние, подлежащее лечению, а также пациента, которому проводят лечение. Суточную дозу можно вводить единственной дозой или разделенными дозами, или, в случае парентерального введения, ее можно вводить путем непрерывной инфузии.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает всевозможные материалы, совместимые с фармацевтическим введением, включая растворители, дисперсионные среды, оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и агенты, замедляющие абсорбцию и другие материалы и соединения, совместимые с фармацевтическим введением. За исключением тех случаев, когда любая стандартная среда или агент не совместимы с действующим веществом, их применение в композициях по настоящему изобретению рассматривается. В композиции можно также включать дополнительные действующие вещества.

В частности, настоящее изобретение относится к соединениям формулы I:

или их фармацевтически приемлемым солям, или эфирам; где n равно от 1 до 24 и

где

R¹ выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

где m равно 0 или 1;

(2) соединения формулы:

где X представляет собой N или CH;

(3) соединения формулы:

(4) соединения формулы:

и

(5) соединения формулы:

;

R² выбран из группы, состоящей из:

(1) соединения формулы:

(2) соединения формулы:

(3) соединения формулы:

и

(4) соединения формулы:

где R³ представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

.

Используемый в приведенных выше структурах символ указывает на то положение, по которому данная структура или радикал присоединены к основной молекуле посредством ковалентной связи. Кроме того, фраза "к ПЭГ" или "к S" или подобное выражение, используемое в сочетании с указанным выше символом, указывает на то, в каком месте и каким образом данная структура или радикал присоединены к основной молекуле, если имеется несколько возможных положений для присоединения. Например, если R² представляет собой соединение формулы:

,

где X представляет собой соединение формулы:

.

то структура, соответствующая формуле I, будет следующей:

где R1, R3 и n определены в формуле I.

Настоящее изобретение относится также к способам изготовления и применения соединений формулы I, а также фармацевтических композиций, содержащих такие соединения. Соединения формулы I полезны для улучшения доставки низкомолекулярных веществ, белков, нуклеиновых кислот, полимеров, флюоресцирующих маркеров и других веществ к клеткам-мишеням, экспрессирующим рецептор αVβ3. В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к композициям и лекарственным формам, содержащим соединения формулы I, которые полезны для доставки миРНК в цитоплазму клеток-мишеней, экспрессирующих рецептор αVβ3, для ингибирования экспрессии конкретных целевых белков за счет РНК-интерференции.

В более частных воплощениях, настоящее изобретение относится к применению соединений формулы I в композициях для облегчения доставки нуклеиновых кислот, таких как миРНК, к опухолевым клеткам и клеткам других типов, экспрессирующим рецепторы αVβ3. Кроме того, частью настоящего изобретения является применение соединений формулы I в изготовлении композиций для доставки, предназначенных для лечения воспалительных и пролиферативных расстройств, таких как рак.

R¹ представляет собой низкомолекулярный антагонист интегрина, который нацеливает соединения формулы I к комплексам рецепторов интегрина, облегчая таким образом их доставку к клеткам, которые экспрессируют такие рецепторы.

В некоторых воплощениях нацеливающие фрагменты структуры R¹ низкомолекулярного антагониста интегрина присоединены по такому положению, чтобы аффинность низкомолекулярного вещества к рецептору интегрина существенно не снижалась, по сравнению со свободным низкомолекулярным антагонистом интегрина. Фрагменты R¹ формулы I нацелены к димеру интегрина αVβ3.

В частных воплощениях R¹ представляет собой нацеливающий к интегрину αVβ3 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль, или эфир, где m равно 0 или 1.

В других воплощениях R¹ представляет собой нацеливающий к интегрину αVβ3 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль, или эфир, где X представляет собой N или CH.

В других воплощениях R¹ представляет собой нацеливающий к интегрину αVβ3 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль, или эфир.

В других воплощениях R¹ представляет собой нацеливающий к интегрину αVβ3 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль, или эфир.

В других воплощениях R¹ представляет собой нацеливающий к интегрину αVβ3 фрагмент формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль, или эфир.

R² может представлять собой реакционно-способные радикалы, которые могут давать ковалентные связи с терапевтическими или иными полезными соединениями или конъюгированными молекулами, содержащими сильные нуклеофилы, например с тиол-содержащими молекулами. Примеры таких реакционно-способных радикалов включают радикалы, выбранные из группы, состоящей из:

; ; и .

Как вариант, R² может представлять собой радикал, который уже присоединен к конъюгированному фрагменту, такому как терапевтическое или другое полезное соединение, белок или олигонуклеотид (R³). В частности, R² может представлять радикал формулы:

где R³ представляет собой конъюгированный фрагмент, а X представляет собой либо серу, либо соединение формулы:

.

В некоторых воплощениях R³ представляет собой олигонуклеотид. В частных воплощениях R³ представляет собой 5ʹ-конец смысловой цепи молекулы РНК, который может существовать в виде одинарной цепи или в дуплексе, например молекула миРНК. Такие молекулы миРНК, известные также как агенты РНКи, ингибируют экспрессию целевого гена в клетке. В частных воплощениях R³ представляет собой молекулу миРНК, которая состоит по существу из олигорибонуклеотидной цепи длиной от 15 до 30 нуклеотидов, в которой 5ʹ-конец смысловой олигорибонуклеотидной цепи присоединен к R², как показано в выше приведенных структурах, и комплементарен по меньшей мере одной части иРНК, соответствующей целевому гену. В других воплощениях R³ представляет собой олигонуклеотид ДНК, присоединенный по своему 5ʹ-концу. Такая дериватизированная ДНК может существовать в виде одинарной цепи или одной цепи, гибридизованной с комплементарной цепью другого олигонуклеотида. Олигонуклеотидные цепи могут быть как немодифицированными, так и модифицированными в целях метаболической стабильности. Подобные модификации включают, без ограничения, замещения в конкретных положениях по фосфатной группе (например, фосфоротиоат) и 2ʹ-гидроксигруппе (например, 2ʹ-O-метил и 2ʹ-фтор).

В некоторых воплощениях R² формулы I представляет собой -X-S-CH₂-R³, при этом R³ включает смысловую цепь РНК, как показано ниже в формуле 5 (на основе формулы I):

5

где R¹, n и X таковы, как определено в формуле I.

В других частных воплощениях смысловая цепь может быть связана с антисмысловой цепью.

В других частных воплощениях R² представляет собой -X-S-CH₂-R³, при этом R³ представляет собой низкомолекулярное соединение или белок, образуя таким образом ковалентно связанную, специфически нацеленную молекулу формулы I.

В более частных воплощениях R² представляет собой -X-S-CH₂-R³, при этом R³ представляет собой терапевтические низкомолекулярное соединение или белок.

В других частных воплощениях R² представляет собой -X-S-CH₂-R³, при этом R³ представляет собой флюоресцирующий радикал, полезный в целях визуализации указанных связей интегринового рецептора с применением технологий клеточной микроскопии.

В других частных воплощениях R² представляет собой -X-S-CH₂-R³, при этом R³ представляет собой полимер, содержащий первичные реакционно-способные сульфидные группы. Более конкретно, R³ может представлять собой катионный полимер, полезный для комплексирования и доставки миРНК к поверхностям клеток и цитоплазматическим доменам клеток.

В более частных воплощениях настоящее изобретение относится к соединениям формулы I, где R³ представляет собой один из структурных изомеров флуоресцеин изотиоцианата (FITC), показанных ниже:

.

В других более конкретных воплощениях настоящее изобретение относится к соединениям формулы I, где R³ представляет собой один из структурных изомеров FITC-14, показанный ниже:

В других воплощениях настоящее изобретение относится к соединению формулы I, где n равно от 9 до 13, предпочтительно 12.

В частных воплощениях настоящее изобретение относится к соединению формулы I, выбранному из группы, состоящей из одного из следующих соединений (или его фармацевтически приемлемой соли или эфира):

αVβ3 Лиганд - Реагент 1: полуамид (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]-пропиониламино]пропокси]-фенил]-3-[2-[3-(гуанидино)-бензоиламино]-ацетиламино]-янтарной кислоты;

αVβ3 Лиганд - Реагент 2: полуамид (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино]-пропокси]фенил]-3-[2-[3-(гуанидино)бензоиламино]ацетиламино]-янтарной кислоты;

αVβ3 Лиганд - Реагент 3: полуамид (S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-ацетил-сульфанилэтокси)-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-1-оксопропил]-амино]пропокси]-фенил]-3-[2-[3-[гуанидино]бензоиламино]ацетиламино]-янтарной кислоты, трифторацетатная соль;

αVβ3 Лиганд - Реагент 4: полуамид (S)-N-[[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-ацетил-ульфанилтокси)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-1-оксопропил]-амино]пропокси]фенил]3-[2-[3-(тетрагидропиримидин-2-илиденамино)-бензоиламино]ацетиламино]-янтарной кислоты;

αVβ3 Лиганд - Реагент 5: полуамид (S)-N-[[4-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-ацетилсульфанилэтокси)этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]пропиониламино]метил]фенил]3-[2-[[2-(3-бензилуреидо)-тиазол-4-карбонил]амино]ацетиламино]-янтарной кислоты;

αVβ3 Лиганд - Реагент 6: полуамид (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]пропиониламино]пропокси]фенил]3-[2-[[2-(3-бензилуреидо)-тиазол-4-карбонил]амино]ацетиламино]-янтарной кислоты;

αVβ3 Лиганд - Реагент 7: полуамид (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропиониламино]этокси]этокси]этокси]этокси]-этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]пропиониламино]этокси]-фенил]-3-[2-[[2-(3-бензил-уреидо)тиазол-4-карбонил]амино]ацетиламино]-янтарной кислоты;

αVβ3 Лиганд - Реагент 8: полуамид (S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-ацетилсульфанилэтокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]этокси]-пропиониламино]пропокси]фенил]3-[2-[[2-(3-бензил-уреидо)тиазол-4-карбонил]-амино]-ацетиламино]-янтарной кислоты;

αVβ3 Лиганд - Реагент 9: (R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-(2-{2-[2-(2-ацетилсульфанил-этокси}-этокси)этокси]этокси}-пропиониламино)пропокси]бензил}-уреидо]-тиазол-4-карбонил)амино}-ацетиламино]фенил-3-ил-пропионовая кислота;

αVβ3 Лиганд - Реагент 10: 3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-Ацетилсульфанилэтокси)этокси]этокси}-этокси)этокси]этокси}-этокси)этокси]-этокси}этокси)этокси]этокси}-пропиониламино)пропокси]бензил}-уреидо]-тиазол-4-карбонил)амино}-ацетиламино]фенил-3-ил-пропионовая кислота;

αVβ3 Лиганд - Реагент 11: (R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-(2-{2-[2-(2-ацетилсульфанил-этокси}-этокси)этокси]этокси}-пропиониламино)пропокси]бензил}-уреидо]-тиазол-4-карбонил)амино}-ацетиламино]-3-пиридин-3-ил-пропионовая кислота;

αVβ3 Лиганд - Реагент 12: (R)-3-[2-{(2-[3-{2-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-ацетилсульфанилэтокси)этокси]этокси}-этокси)этокси]этокси}-этокси)этокси]-этокси}этокси)этокси]этокси}-пропиониламино)пропокси]бензил}-уреидо]-тиазол-4-карбонил)амино}-ацетиламино]-3-пиридин-3-ил-пропионовая кислота;

Кроме того, настоящее изобретение относится к новым композициям и лекарственным формам, содержащим соединения формулы I, для получения наночастиц путем комбинирования с миРНК, что обеспечивает улучшенную доставку нуклеиновых кислот, таких как миРНК, в цитоплазму клеток-мишеней, экспрессирующих димеры αVβ3. В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к композиции миРНК, включающей: (1) соединение формулы I, в котором R² включает 5ʹ-миРНК олигонуклеотид; и (2) поликатионный агент для трансфекции.

Настоящее изобретение относится также к способам получения и применения таких соединений и композиций. Соединения формулы I полезны как компоненты композиций или лекарственных форм, улучшающих доставку лекарственных веществ, нуклеиновых кислот или других терапевтических соединений к тканям или клеткам, экспрессирующим димеры αVβ3. В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к композициям, содержащим соединения формулы I, которые полезны для доставки миРНК в цитоплазму клеток-мишеней, экспрессирующих димеры αVβ3, с целью ингибирования экспрессии конкретных белков за счет РНК-интерференции. В более частных воплощениях настоящее изобретение относится к соединениям формулы I и композициям, содержащим такие соединения, которые могут эффективно доставлять миРНК к опухолевым клеткам и клеткам других типов, экспрессирующим димеры αVβ3, для лечения раковых или воспалительных заболеваний. Такие соединения и композиции более эффективны и демонстрируют улучшенную выключающую способность, по сравнению с такими же композициями, не содержащими соединения формулы I.

ОБЩИЙ СПОСОБ СИНТЕЗА СОЕДИНЕНИЙ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Подходящие способы для синтеза соединений формулы I представлены в примерах. В целом, соединения формулы I можно получить в соответствии со схемами, приведенными ниже. Если не указано иное, переменные n, R¹ и R² в приведенных ниже схемах имеют такое же определение, как и в представленной ранее родовой формулы I.

Общий синтез конъюгирующих агентов малеимид-(ПЭГ)n-антагонистов интегрина

Соединения структуры 26 на схеме 1 с различной длиной ПЭГ коммерчески доступны (например, в Pierce Bioscience). Такие соединения можно также получать ацилированием амино-концов ПЭГ-аминокислот с помощью 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)-пропионовой кислоты в условиях для образования амидной связи, с последующим образованием реакционно-способных N-гидроксисукциновых эфиров в ходе реакции N-гидроксиянтарной кислоты в условиях для образования эфира. Как показано на схеме 1, введение в реакцию соединений 26 с соединениями, содержащими первичную или вторичную аминогруппу, такими как соединения 27, проводят в апротонных или протонных растворителях в присутствии основных аминов, таких как DIEA (диизопропилэтиламин), при комнатной температуре, с образованием ПЭГ-илированных промежуточных продуктов 28.

Соединения структуры 29 на схеме 2, где R⁴ представляет собой тиоацетил или 2-дитиопиридил, содержащие ПЭГ-группы различной длины, также имеются в продаже (например, в Pierce Bioscience). Реакцию соединений структуры 29 с соединениями, содержащими первичные или вторичные аминогруппы, такими как соединения 27, проводят в апротонных или протонных растворителях в присутствии основных аминов, таких как DIEA (диизопропилэтиламин), при комнатной температуре, с получением ПЭГ-илированных промежуточных продуктов 30.

В качестве частного, не налагающего ограничений примера настоящего изобретения, промежуточное соединение 26 вводят в реакцию с соединением 31 с получением промежуточного малеимида 32, как показано на схеме 3.

Аналогичным образом, промежуточное соединение 26 можно вводить в реакцию с соединением 33 с получением промежуточного малеимида 34, как показано на схеме 4.

Аналогичным образом, промежуточное соединение 29 можно вводить в реакцию с соединением 35 с получением промежуточного соединения 36, как показано на схеме 5, на которой R⁴ представляет собой либо тиоацетил, либо 2-дитиопиридил.

Аналогичным образом, промежуточное соединение 29 можно вводить в реакцию с соединением 37 с получением промежуточного соединения 38, как показано на схеме 6, где R⁴ представляет собой либо тиоацетил, либо 2-дитиопиридил.

Для соединений общей структуры 26 или 29 коммерчески доступны ПЭГ различной длины, или их легко может получить специалист в данной области техники; предпочтительно n равно от 8 до 24. По данной теме имеется много статей и обзоров (например: Chemistry for peptide and protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews Volume 54, Issue 4, 17 June 2002, Pages 459-476).

Промежуточное соединение 31 можно синтезировать таким же способом, как уже сообщалось в литературе (например, Sidduri, A. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2002, 12, 2475-2478), как показано на схеме 7.

В частности, как показано на схеме 7, промежуточное соединение 41 получали из коммерчески доступной (S)-3-[4-нитрофенил]-2-трет-бутоксикарбонил-аминопропионовой кислоты 40. Нитрогруппу коммерчески доступного исходного вещества 40 в метанольном растворе восстанавливали цинковой пылью в присутствии хлорида аммония при комнатной температуре в течение нескольких часов с получением анилина 41. Другие способы для восстановления нитрогруппы известны специалистам в данной области техники. Анилин 41 ацилировали производными бензоилгалида, такими как 2,6-дихлорбензоилхлорид 42, в апротонном растворителе, таком как дихлорметан, в присутствии основания, такого как диизопропилэтиламин, при комнатной температуре. Таким образом получали амид 43. Трет-бутилкарбонильную (Boc) аминопротекторную группу удаляли стандартными способами, известными специалистам в данной области техники, например путем обработки раствором HCl в диоксане при комнатной температуре; в результате этого получали гидрохлорид 44. Гидрохлорид 44 обрабатывали в условиях образования амидной связи (также хорошо известных специалистам в данной области техники) в присутствии хорошо известной 1-(2-азидоэтил)-циклопентанкарбоновой кислоты 45 с получением диамида 46. Азидную группу в промежуточном соединении 46 восстанавливали путем обработки триалкилфосфином в апротонном растворителе, таком как тетрагидрофуран, при комнатной температуре. Затем полученный метиловый эфир омыляли путем обработки гидроксидом натрия в смеси растворителей, таких как этанол и тетрагидрофуран, при повышенной температуре, например при 50°С, в течение 15 ч. В результате этого получали промежуточное соединение 31, которое может также существовать в виде цвиттер-иона.

Присоединение ПЭГ-фрагмента возможно также с помощью промежуточного соединения 39, которое синтезируют, как показано на схеме 8. В частности, 3,5-дихлорфенол 47 защищают три-изопропилсилилхлоридом в присутствии основания, такого как имидазол, в полярном апротонном растворителе, таком как DMF, после чего проводят реакцию с сильным основанием, таким как бутиллитий, в безводном тетрагидрофуране при низкой температуре, например при -78°С. Получаемый комплекс лития гасят диоксидом углерода, который добавляют в форме сухого льда, с получением промежуточного соединения 48, производного бензойной кислоты. Промежуточное соединение 48 затем хлорируют с образованием ацилхлорида, путем обработки сульфонилхлоридом (SOCl₂) в апротонном растворителе, таком как толуол. Полученный ацилхлорид далее вводят в реакцию с гидрохлоридом амина 49 в присутствии основания, такого как диизопропилэтиламин (DIPEA), в апротонном растворителе, таком как дихлорметан (DCM), получая при этом промежуточное соединение 50. Силильную защитную группу в промежуточном соединении 50 удаляют путем обработки фторидом тетрабутиламмония (TBAF) в протонном растворителе, таком как тетрагидрофуран, при комнатной температуре. Это фенольное промежуточное соединение вводят в реакцию в присутствии основания, такого как карбонат калия (K₂CO₃), в апротонном растворителе, таком как диметилформамид (DMF), с 3-N-трет-бутилкарбомат-1-бромпропаном. Таким образом получают промежуточное соединение 52, которое при снятии защиты с помощью трифторуксусной кислоты (TFA) и последующем гидролизе с помощью основания, такого как гидроксид натрия, в протонном растворителе, таком как этанол, образует промежуточное соединение 39:

Синтез дериватизирующих агентов - антагонистов αVβ3

Промежуточное соединение 117, αVβ3-нацеливающий модуль, можно синтезировать, как показано ниже на Схеме 15. Вкратце, мета-аминобензойную кислоту 110 вводят в реакцию с Ν,Ν-ди-Boc-метилтиомочевиной 111 в DMF, дихлорметаном и пиридином в присутствии ацетата ртути. На данном этапе глицин, защищенный бензиловым эфиром, конденсируют с карбоновой кислотой продукта выше описанной реакции в стандартных условиях для образования пептидной связи. Бензиловый эфир удаляют в условиях гидрогенолиза, получая при этом свободную кислоту 112. В отдельной последовательности реакций пара-нитрофенол 11