Бактериальный штамм, способный метаболизировать оксалаты

Бактериальный штамм, способный метаболизировать оксалаты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к селекции штаммов лактобактерий и бифидобактерий, обитающих в кишечнике человека, способных метаболизировать щавелевую кислоту и/или ее соли (оксалаты). Более того, настоящее изобретение относится к пищевой композиции, или пищевой добавке, или медицинскому устройству, или фармацевтической композиции, содержащим указанные бактериальные штаммы.

Оксалат (соль щавелевой кислоты) является повсеместно распространенным соединением в растительном мире, широко представленным во всех видах пищи человека. Суточное потребление находится в пределах от 70 до 920 мг (в среднем 495 мг, приблизительно 5,6 мМ), но эти значения слегка превышены в пищевых рационах вегетарианцев.

Щавелевая кислота (дикарбоновая кислота) является одним из наиболее высокоокисленных органических соединений и, таким образом, действует как мощный хелатирующий агент для катионов, в частности, иона Са²⁺. Из-за этого свойства соли щавелевой кислоты (оксалаты) имеют очень незначительное применение в катаболических процессах и выработке энергии. Более того, щавелевая кислота является токсичной для большинства живых существ, и в частности для млекопитающих.

По этой причине накопление щавелевой кислоты и оксалатов в организме человека может инициировать и ухудшать ряд патологических состояний, среди которых следует упомянуть гипероксалурию, мочекаменную болезнь, почечную недостаточность, кардиомиопатии и другие расстройства сердечной деятельности. В частности, щавелевая кислота связывается с кальцием с образованием соответствующего оксалата кальция, нерастворимой соли, которая является причиной более 70% случаев диагностированных почечных камней. Более того, щавелевая кислота является мощным воспалительным агентом, повреждающим слизистую оболочку кишечника. Таким образом, избыточное присутствие этой кислоты в просвете может негативно сказаться на естественной защитной функции эпителия, изменяя его проницаемость и, следовательно, вызывая повышенную абсорбцию оксалата. В частности, толстая кишка является основным участком абсорбции оксалата, при потреблении 3-5% в нормальных физиологических условиях. Снижение уровня оксалата в просвете кишечника может, следовательно, способствовать снижению абсорбции. Это в свою очередь приведет к уменьшению концентрации оксалатов в плазме и в моче, тем самым снизив их вредоносность.

Более того, высокие уровни оксалатов в крови могут приводить к дивертикулезу или дивертикулиту. Дивертикулез, также известный как «дивертикулярная болезнь», является медицинским состоянием, характеризующимся дивертикулами в толстой кишке; они представляют собой выпячивания слизистой оболочки и подслизистого слоя толстой кишки через участки относительной слабости мышечного слоя в стенке толстой кишки. Дивертикулы определенно наиболее распространены в сигмовидной кишке, которая является частью кишечника, характеризующейся большим давлением, фактором, способствующим образованию дивертикул. Дивертикулез является патологией пищеварительного тракта, характеризующейся воспалением одной или более дивертикул. В большинстве случаев дивертикулит локализуется в толстой кишке (в частности, в нисходящей и сигмовидной кишке).

Поэтому, важно иметь возможность снижать количество оксалатов в просвете кишечника, плазме и моче так, чтобы избежать осложнений, связанных с высокими значениями оксалатов, таких как, например, гипероксалурия, мочекаменная болезнь, почечная недостаточность, кардиомиопатии и другие расстройства сердечной деятельности, камни в почках, дивертикулез и дивертикулит.

В частности, желательно иметь возможность снижать уровни оксалатов в моче двух типов субъектов:

- субъекты с гипероксалурией, которые не придерживаются питания с высоким содержанием оксалатов;

- субъекты с нормальными показателями оксалурии, которые придерживаются питания с высоким содержанием оксалатов.

Заявитель предложил решение проблемы вышеупомянутых потребностей после интенсивного научного исследования, в конце которого из весьма обширной группы штаммов был проведен отбор бактериальных штаммов, принадлежащих к родам Lactobacillus и Bifidobacterium; указанные штаммы проявляют заметную способность количественно разлагать оксалаты. Отобранные штаммы демонстрируют способность использовать оксалат в качестве источника энергии, удаляя его из среды, в которой указанный оксалат изначально находился. Таким образом, отобранные штаммы способны разлагать оксалаты.

Объект настоящего изобретения относится к бактериальным штаммам, принадлежащим к родам Lactobacillus и Bifidobacterium, и обладающим способностью разлагать оксалаты, как раскрыто в прилагаемой независимой формуле изобретения.

Объект настоящего изобретения также относится к пищевой композиции, или пищевой добавке, или медицинскому устройству, или фармацевтической композиции, содержащим указанные бактериальные штаммы, как раскрыто в прилагаемой независимой формуле изобретения.

Предпочтительные воплощения настоящего изобретения будут проиллюстрированы в подробном описании, которое следует далее.

На фиг.1 показано сравнение между хроматограммой культуральной среды, содержащей 5 мМ оксалата, до (А) и после (Б) очистки посредством ТФЭ (твердофазной экстракции).

На фиг.2 показана хроматограмма культуральной среды, содержащей 5 мМ оксалата (положительный эталон).

На фиг.3 показана хроматограмма бактериального штамма В. breve BR03 DSM 16604.

На фиг.4 показана хроматограмма бактериального штамма L paracasei spp.paracasei LPC09 DSM 24243.

На фиг.5 показаны кривые окисления (величина рН), полученные как функция времени (Т=0, 3, 6, 8 и 10 часов), когда штамм L. paracasei spp.рэгвсвзв! LPC 09 DSM 24243 выращивали в культуральной среде MRS (deMann-Rogosa-Sharpe, среда де Манн-Рогоза-Шарпа), не содержащей сахара (источник углерода), к которой соответственно были добавлены другие источники углерода (волокна).

Заявитель разработал способ, обеспечивающий идентификацию и количественное определение способности к разложению оксалатов у культур штаммов, принадлежащих к родам Lactobacillus и Bifidobacterium.

Заявитель установил, что следующие бактериальные штаммы обладают подтвержденной способностью использовать оксалаты в качестве источника энергии:

1) L. paracasei spp.paracasei LPC 09, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 23.11.2010, с депозитным номером DSM 24243.

2) L. gasseri LGS 01, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 24.05.2006, с депозитным номером DSM 18299.

3) L gasseri LGS 02, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 24.05.2006, с депозитным номером DSM 18300.

4) L. acidophilus LA 07, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 23.11.2010, с депозитным номером DSM 24303.

5) L. acidophilus LA 02, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 06.08.2008, с депозитным номером DSM 21717.

6) L. plantarum LP 01, депонированный компанией Mofin Sri, Новара (Италия), в институте депонирования BCCM-LMG (Бельгийская координированная коллекция микроорганизмов) (Бельгия) 16.10.2001, с депозитным номером LMG-P-21021.

7) L. reuteri LRE 03, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 05.08.2010, с депозитным номером DSM 23879.

8) L. reuteri LRE 02, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 05.08.2010, с депозитным номером DSM 23878.

9) В. breve BR 03, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 16.07.2004, с депозитным номером DSM 16604.

10) В. longum BL 03, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 20.07.2004, с депозитным номером DSM 16603.

11) L. rhamnosus GG, АТСС 53103, имеющийся в общественной коллекции АТСС (Американская коллекция типовых культур).

12) L. reuteri LRE 04, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 05.08.2010, с депозитным номером DSM 23880.

13) L. rhamnosus LR 06, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 14.11.2008, с депозитным номером DSM 21981.

14) В. lactis BA 05, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 15.06.2006, с депозитным номером DSM 18352.

15) L. casei spp.rhamnosus LR 04, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 20.07.2004, с депозитным номером DSM 16605.

В предпочтительном воплощении композиция содержит или, альтернативно, состоит из по меньшей мере одного штамма, выбранного из указанных выше штаммов с (1) по (15); предпочтительно штаммы выбраны из указанных выше штаммов с (1) по (8).

В контексте настоящего изобретения «бактериальный штамм» означает живые и/или убитые клетки, и/или их части, компоненты/производные, и/или ферменты.

Отобранные бактериальные штаммы принадлежат к роду Lactobacillus и обладают способностью разлагать и использовать оксалат в качестве источника энергии в количестве более чем 50%. Преимущественно, указанная способность составляет более чем 60%. Преимущественно, указанная способность составляет более чем 70%.

Отобранные бактериальные штаммы принадлежат к виду Lactobacillus paracasei. Предпочтительный штамм представляет собой L. paracasei spp.paracasei LPC 09 DSM 24243.

Отобранные бактериальные штаммы принадлежат к виду Lactobacillus gasseri. Несколько предпочтительных штаммов выбраны из группы, содержащей или, альтернативно, состоящей из L. gasseri LGS 01 DSM 18299 и L gasseri LGS 02 DSM 18300.

Отобранные бактериальные штаммы принадлежат к виду Lactobacillus acidophilus. Несколько предпочтительных штаммов выбраны из группы, содержащей или, альтернативно, состоящей из L. acidophilus LA02 DSM 21717 и L. acidophilus LA 07 DSM 24303.

Композиция по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один бактериальный штамм для применения в лечении гипероксалурии, мочекаменной болезни, почечной недостаточности, кардиопатий, камней в почках, дивертикулеза и дивертикулита.

Композиция может представлять собой пищевую композицию, или пищевую добавку, или медицинское устройство, или фармацевтическую композицию.

Композиция для применения в лечении гипероксалурии, мочекаменной болезни, почечной недостаточности, кардиопатий, камней в почках, дивертикулеза и дивертикулита содержит или, альтернативно, состоит из по меньшей мере двух штаммов, выбранных из указанных выше штаммов с (1) по (15), предпочтительно штаммы выбраны из указанных выше штаммов с (1) по (8).

Композиция для применения в лечении гипероксалурии, мочекаменной болезни, почечной недостаточности, кардиопатий, камней в почках, дивертикулеза и дивертикулита содержит или, альтернативно, состоит из по меньшей мере двух штаммов, выбранных из указанных выше штаммов с (1) по (5).

Композиция для применения в лечении гипероксалурии, мочекаменной болезни, почечной недостаточности, кардиопатий, камней в почках, дивертикулеза и дивертикулита содержит или, альтернативно, состоит из:

а) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 - DSM 24243; или

б) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 - DSM 24243 и L. gasseri LGS 01 - DSM 18299; или

в) L paracasei spp. paracasei LPC 09 - DSM 24243 и L. gasseri LGS 02 - DSM 18300; или

г) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 - DSM 24243, L. gasseri LGS 01 -DSM 18299 и L gasseri LGS 02 - DSM 18300; или

д) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 - DSM 24243, L. gasseri LGS 01 - DSM 18299, L gasseri LGS 02 - DSM 18300 и L. acidophilus LA 07 -DSM 24303; или

е) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243, L. gasseri LGS 01 - DSM 18299, L. gasseri LGS 02 - DSM 18300 и L. acidophilus LA 02 - DSM 21717; или

ж) L. paracasei spp. paracesei LPC 09 - DSM 24243, L. gasseri LGS 01 - DSM 18299, L. gasseri LGS 02 - DSM 18300, L. acidophilus LA 07 - DSM 24303 и L. acidophilus LA 02 - DSM 21717.

Все из вышеописанных композиций и, в частности, перечисленные выше композиции с (а) по (ж), могут дополнительно содержать фруктоолигосахариды (FOS) и/или инулин. Фруктоолигосахариды (FOS) и/или инулин включены в количестве, составляющем от 1 до 30% по массе относительно массы композиции, предпочтительно от 3 до 15%, даже более предпочтительно от 5 до 10% по массе.

Объект настоящего изобретения относится к бактериальному штамму, принадлежащему к виду Lactobacillus paracasei или Lactobacillus gasseri и способному разлагать щавелевую кислоту и/или ее соли в количестве более чем 60%. Указанный штамм способен разлагать щавелевую кислоту и/или ее соли в количестве более чем 70%. Указанный штамм, принадлежащий к виду Lactobacillus paracasei, представляет собой L paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243. Указанный штамм, принадлежащий к виду Lactobacillus gasseri, выбран из группы, содержащей штамм L. gasseri LGS 01 DSM 18299 и штамм L. gasseri LGS 02 DSM 18300. Указанный штамм, принадлежащий к виду Lactobacillus gasseri, выбран из группы, состоящей из штамма L. gasseri LGS 01 DSM 18299 и штамма L. gasseri LGS 02 DSM 18300.

Объект настоящего изобретения относится к пищевой композиции, или пищевой добавке, или медицинскому устройству, или фармацевтической композиции, содержащим бактериальную композицию; где указанная бактериальная композиция содержит по меньшей мере один бактериальный штамм, как описано выше, для применения в профилактическом или терапевтическом лечении гипероксалурии, мочекаменной болезни, почечной недостаточности, кардиопатий, камней в почках, дивертикулеза и дивертикулита. Указанная бактериальная композиция содержит штамм L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243. Указанная бактериальная композиция содержит штамм L. gasseri LGS 01 DSM 18299 и штамм L. gasseri LGS 02 DSM 18300. Указанная бактериальная композиция дополнительно содержит штамм L. acidophilus LA02 DSM 21717 и штамм L. acidophilus LA 07 DSM 24303. Указанная бактериальная композиция состоит из L. paracasei spp. paracasei LPC- 09 DSM 24243, L. acidophilus LA02 DSM 21717 и/или L. acidophilus LA 07 DSM 24303. Указанная композиция дополнительно содержит фруктоолигосахариды и/или инулин.

Экспериментальная часть

1. Анализируемые бактериальные штаммы

Было исследовано примерно 70 штаммов, принадлежащих к родам Bifidobacterium и Lactobacillus; они поступили из внутренней коллекции штаммов компании Probiotical SpA в Новаре и международных коллекций, таких как, например, DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур) - Германия, или были найдены в литературных источниках. Отобранные штаммы показаны в таблице 1, в которой продемонстрирован процент разложения оксалата исследуемыми бактериальными штаммами. Эксперимент проводили при использовании культуральной среды, содержащей 5 мМ оксалата аммония.

Таблица 1
Депозитный номер	Вид/штамм	% разложения
DSM 24243	L. paracasei LPC 09	73,50
DSM 18299	L. gasseri LGS 01	73,40
DSM 18300	L. gasseri LGS 02	71,20
DSM 24303	L. acidophilus LA 07	59,25
DSM 21717	L acidophilus LA 02	56,35
LMG Р-21021	L. plantarum LP 01	40,31
DSM 23879	L. reuteri LRE 03	33,86
DSM 23878	L reuteri LRE 02	31,42
DSM 16604	B. breve BR 03	28,16
DSM 16603	B. longum BL 03	25,29
АТСС 53103	L. rhamnosus GG	23,59
DSM 23880	L. reuteri LRE 04	16,79
DSM 21981	L. rhamnosus LR 06	15,70
DSM 18352	B. lactis BA 05	15,45
DSM 16605	L. rhamnosus LR 04	12,89

Бактериальные штаммы с (1) по (5), с (7) по (10) и с (12) по (15), перечисленные в таблице 1, были депонированы компанией Probiotica! SpA, Новара (Италия). Штамм (6) был депонирован компанией Mofin Sri, Новара (Италия). Штамм (11) получен из коллекции АТСС. Все штаммы имеются в наличии и являются общедоступными согласно условиям, установленным Будапештским договором.

2. Принятые условия культивирования

Получение штаммов, которые должны быть подвергнуты анализу, заключалось в серии из трех последовательных пересевов в MRS-бульоне (с добавлением 1% цистеин-HCl, в анаэробных условиях, для бифидобактерий), инкубируемом при 37°C, до достижения достаточного роста. Эта стратегия культивирования делает возможной полную активацию штамма. Штаммы затем инокулировали при одинаковом процентном соотношении посевного материала (2%) в экспериментальную среду, специально созданную для обеспечения максимального роста молочнокислых бактерий и бифидобактерий, дополненную 5 мМ оксалата аммония (количество, равное среднесуточному потреблению щавелевой кислоты). Полученные таким образом культуры инкубировали в течение 24 часов при 37°C.

3. Очистка образцов посредством ТФЭ (твердофазной экстракции)

В конце периода инкубации бульонные культуры центрифугировали, и надосадочную жидкость фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) ввод образцов выявил неясный хроматографический профиль. В частности, оказалось, что хроматографический пик щавелевой кислоты перекрывает пик глюкозы, присутствующей в образцах. Для того чтобы устранить вышеупомянутую проблему, образцы очищали при использовании колонок для ТФЭ (твердофазная экстракция), специфичных для органических кислот.

Протокол очистки с помощью колонок для ТФЭ требовал стадии оптимизации для получения лучшего конечного выхода. В частности использовали различные реагенты применительно к стадии кондиционирования колонки и конечной элюции аналита. Эта очистка путем твердофазной экстракции сделала возможным получение совершенно четкого хроматографического пика щавелевой кислоты, как можно увидеть на фиг.1А-Б. Использованный протокол был следующим:

Тип колонки для ТФЭ: Phenomenex Strata-XA

Активация: 1 мл метанола

Кондиционирование: 2 мл формиата натрия, 20 мМ

Загрузка пробы: 1 мл образца

Смывание примесей: 1 мл ацетата аммония, 25 мМ плюс 1 мл метанола

Элюция: 2×500 мкл HCl, 1 М плюс 2×500 мкл HCl, 3 М

4. ВЭЖХ-анализ (высокоэффективная жидкостная хроматография)

Количество оксалата, разлагаемого каждым отдельным штаммом, анализировали посредством ВЭЖХ, вычисляя разницу между концентрацией оксалата, присутствующего в культуральной среде (5 мМ) в момент времени ТО (до ферментации), и остаточной концентрацией после роста микроорганизма. Результаты для отдельных штаммов выражают в процентах, принимая концентрацию оксалата в момент времени ТО за 100. Например, результат для штамма L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243, равный примерно 70%, показывает, что последний способен использовать количество оксалата, равное примерно 3,5 мМ оксалата (70% 5 мМ). Использованный протокол ВЭЖХ был следующим:

Тип колонки: Phenomenex Hydro-RP 250×4,6 мм

Тип детектора: УФ и видимая область спектра со считыванием при 220 нм

Скорость потока при элюции: 0,7 мл/мин

Объем вводимой пробы: 20 мкл

Температура колонки: 30°C

Тип элюции: изократическая

Подвижная фаза: 20 мМ фосфат калия, рН 2,0

Бактериальные штаммы, принадлежащие к роду Lactobacillus, которые демонстрировали высокую активность разложения в отношении щавелевой кислоты, являются указанными выше штаммами с (1) по (5).

А. Определение кривых окисления для штамма L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243.

Штамм LPC09 реактивировали перед экспериментом посредством пересева в среду MRS и инкубировали в аэробных условиях при 37°C. Стадии реактивации повторяли три раза перед экспериментом при инкубировании в течение ночи. В конце третьей стадии реактивации клетки осаждали посредством центрифугирования, промывали стерильной водой и ресуспендировали перед инокулированием в культуральные среды, обогащенные волокном. Используемые среды готовили на основе среды MRS, не содержащей сахара (источники углерода), обогащенной соответственно:

- Глюкозой (раствор, стерилизованный тепловой обработкой, 121°C, 15 мин), контрольная среда.

- Фруктоолигосахаридами - FOS (раствор, стерилизованный фильтрацией, фильтр 0,20 мкл).

- GOS-Glu - галактоолигосахариды с остатком глюкозы (раствор, стерилизованный фильтрацией, фильтр 0,20 мкл).

- GOS-Gal - галактоолигосахариды с остатком галактозы (раствор, стерилизованный фильтрацией, фильтр 0,20 мкл).

- XOS - ксилоолигосахариды (раствор, стерилизованный фильтрацией, фильтр 0,20 мкл).

- Ларексом (Lar) - волокно лиственницы (раствор, стерилизованный тепловой обработкой, 121°C, 15 мин).

- Инулином (Inu) (раствор, стерилизованный тепловой обработкой, 121°С, 15 мин).

Конечная концентрация источников углерода для всех сред составляла 20 г/л.

Составленные таким образом среды затем инокулировали штаммом LPC09 в процентном отношении 4% и инкубировали при 37°С в аэробных условиях.

В нулевой момент времени и через 3, 6, 8 и 10 часов проводили измерения значений рН, чтобы построить кривые окисления, показанные на графике фиг.5.

В таблице 2 показаны кривые окисления (значения рН), полученные как функция времени (Т=0, 3, 6, 8 и 10 часов), когда штамм L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243 выращивали в культуральной среде, как описано выше.

Таблица 2

1. Бактериальный штамм Lactobacillus paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243, разлагающий щавелевую кислоту и/или ее соли в количестве более чем 60%.

2. Штамм по п.1, разлагающий щавелевую кислоту и/или ее соли в количестве более чем 70%.

3. Применение фармацевтической композиции для профилактического или терапевтического лечения гипероксалурии, мочекаменной болезни, почечной недостаточности, кардиопатий, камней в почках, дивертикулеза и дивертикулита, где фармацевтическая композиция содержит бактериальную композицию и отличается тем, что указанная бактериальная композиция содержит совокупность клеток по меньшей мере одного бактериального штамма, где указанный по меньшей мере один бактериальный штамм представляет собой Lactobacillus paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243.

4. Применение по п.3, где указанная бактериальная композиция дополнительно содержит штамм L. acidophilus LA02 DSM 21717 и штамм L. acidophilus LA 07 DSM 24303.

5. Применение по п.3, где указанная бактериальная композиция состоит из L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243, L. acidophilus LA02 DSM 21717 и L. acidophilus LA 07 DSM 24303.

6. Применение по п.3, где указанная композиция дополнительно содержит фруктоолигосахариды и инулин.

7. Пищевая композиция, содержащая бактериальную композицию, отличающаяся тем, что указанная бактериальная композиция содержит совокупность клеток по меньшей мере одного бактериального штамма, где указанный по меньшей мере один бактериальный штамм представляет собой Lactobacillus paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243.

8. Композиция по п.7, где указанная пищевая композиция дополнительно содержит штамм L. acidophilus LA02 DSM 21717 и штамм L. acidophilus LA 07 DSM 24303.

9. Композиция по п.7, где указанная пищевая композиция состоит из L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243, L. acidophilus LA02 DSM 21717 и L. acidophilus LA 07 DSM 24303.

10. Композиция по п.7, где указанная композиция дополнительно содержит фруктоолигосахариды и инулин.