Применение 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами pseudomonas aeruginosa, и способ подавления этой инфекции

Применение 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами pseudomonas aeruginosa, и способ подавления этой инфекции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa.

Предшествующий уровень

Pseudomonas aeruginosa или синегнойная палочка вызывает до 30%, а в некоторых отделениях до 50% всех внутрибольничных инфекций. Она является причиной внутрибольничных пневмоний, первичных бактериемий, инфекций мочеполовой системы и гнойных хирургических инфекций в высоком проценте случаев, особенно в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) у пациентов с искусственной вентиляцией легких и другими инвазивными процедурами такими, как катетеризация мочевого пузыря или проведение длительной инфузионной терапии. Часто инфекции развиваются молниеносно и сопровождаются высокой летальностью, показатели которой остаются стабильно высокими (34-48%). Такая угрожающая ситуация вызвана чрезвычайно высоким уровнем множественной устойчивости к большинству, а иногда и ко всем антибиотикам у клинических штаммов синегнойной палочки. P. aeruginosa лидирует среди антибиотикорезистентных грамотрицательных бактерий, вызывающих инфекции у госпитализированных больных. Внутрибольничные инфекции, вызванные синегнойной палочкой, практически не поддаются стандартному антибактериальному лечению вследствие множественной устойчивости к антибиотикам клинических штаммов. Кроме того, уже во время лечения развивается резистентность к новым препаратам. Поэтому приходится использовать комбинацию из нескольких антибиотиков, в том числе высокотоксичных. А смертность связана с тем, что бактериемии, вызванные псевдоманадами, развиваются так обвально, что даже не хватает времени поставить антибиотикограмму и подобрать нужный антибиотик. Например, по данным зарубежных исследований при бактериальном сепсисе выживаемость при адекватно назначенной стартовой антибактериальной терапии составляет 52,0%, при неадекватном стартовом назначении антибиотиков - 10,3%, то есть приводит к 5-кратному снижению выживаемости.

Борьба с внутрибольничными инфекциями требует значительных затрат, связанных с контролем и своевременной диагностикой инфекции, подбором эффективной терапии, необходимостью использования отделений интенсивной терапии, длительностью нахождения в стационаре, тяжелыми вплоть до летальных последствий данных заболеваний. Очевидно, что разработка новых подходов в создании антибактериальных препаратов с иными, чем у антибиотиков, механизмами действия, является чрезвычайно актуальной задачей.

Известно лечение бактериальных инфекций, вызванных Р. aeruginosa, с помощью синтетических антибактериальных препаратов.

Однако антибиотикорезистентность патогенных микроорганизмов, в том числе множественная, широко распространена и является важнейшим фактором снижения эффективности лечения инфекционных болезней практически во всех регионах мира.

По данным исследований, проведенных НИИ антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии и исследовательской группой РОСНЕТ в ОРИТ российских стационаров до 2003 г., частота устойчивости P.aeruginosa к меропенему составила в среднем 3%, к имипенему - 22,9%. Из других бета-лактамных антибиотиков устойчивость к цефтазидиму была 12,2%, к пиперациллину-тазобактаму - 37,7%, к пиперациллину - 56,5%. По данным исследования той же группы в 2008 г. устойчивыми к меропенему были уже 41,4% выделенных штаммов синегнойной палочки, к имипенему - 39,0%, к цефтазидиму - 47,9%, к цефоперазону - 72,6%, к цефоперазону-сульбактаму - 60,7%, к цефепиму - 58,6%, к пиперациллину - 52,9%, к пиперациллину-тазобактаму - 42,4%. Аналогичные результаты были получены в исследованиях в рамках программы «РЕЗОРТ» в ОРИТ 31 ЛПУ РФ в 2002-2004 гг. - доля устойчивых штаммов составляла: к имипенему и меропенему - 39% и 41%; к амикацину - 42%; к цефтазидиму - 48%; к остальным цефалоспоринам - 58-72%. Была выявлена высокая частота встречаемости устойчивости к ципрофлоксацину - 65% и гентамицину - 75%. На основе данных микробиологического мониторинга в ГБУ "Санкт-Петербургский НИИ скорой помощи им И.И. Джанелидзе» с 2009 по 2012 гг. только к колистину не было выявлено устойчивых штаммов синегнойной палочки. Фактически для лечения синегнойных инфекций, вызванных множественноустойчивыми к антибиотикам штаммами, препаратом выбора остается только полимиксин Е (колистин), который редко применяется вследствие токсического воздействия на почки и слизистую кишечника больных.

В ряде зарубежных аналитических работ описывается современное положение дел в области эффективности лечения различными антибиотиками инфекций, вызванных P.aeruginosa. Например, в работе Somayeh Moazami Goudarzi et al представлены данные, полученные в результате обследования пациентов двух госпиталей в Тегеране (Иран) в 2011 г (1) (S. Moazami Goudarzi and F. Eftekhar, 2015). Было показано, что выявленные клинические штаммы обладали резистентностью к большинству тестируемых (как синтетическим, так и полусинтетическим и природным) антибиотикам таким как тетрациклин (80% устойчивых штаммов), карбенициллин (82%), пиперациллин (72%), азтреонам (76%), тобрамецин (78%), цефепим (77%), меропенем (71%), амикацин (78%), ципрофлоксацин (78%), котримоксазол (94%), имипенем (70%), цефтазидим (20%).

Отсутствуют опубликованные данные, оценивающие различие эффективности комбинированной и монотерапии инфекций, вызванных P. aeruginosa. Отсутствуют рандомизированные исследования, а не рандомизированные исследования по этой проблеме единичны и показывают противоречивые результаты. Большинство авторов, в том числе российских, считают комбинированную терапию инфекций, вызванных синегнойной палочкой, предпочтительнее монотерапии. Как правило, рекомендуют назначать различные комбинации цефалоспоринов, фторхинолонов, аминогликозидов и карбапенемов, чтобы повысить вероятность эффективного терапевтического воздействия и снизить риск возникновения антибиотикорезистентности (2-6) (Burgess D.S., Nathisuwan S. 2002; Bodey G.P., et al. 1985; Hilf M, et al. 1989; Leibovici L, et al. 1997; Siegman-lgra Y., et al. 1998).

Таким образом, антибиотикорезистентные клинические штаммы синегнойной палочки широко распространены и вызывают серьезные проблемы при выборе схемы лечения, вызванных ими инфекций. Возникает необходимость использования высокотоксичных антибиотиков, что приводит к возникновению опасных побочных эффектов у пациентов, нарушающих нормальное функционирование жизненно важных органов.

Вследствие этого многие фармацевтические компании замедлили или прекратили программы по разработке новых антибиотиков, поскольку новые антибиотики стало сложнее коммерциализовывать из-за их низкой эффективности в условиях высокого распространения антибиотико-резистентных штаммов бактерий.

Несмотря на то, что изучение патогенов на молекулярно-генетическом уровне позволяет идентифицировать новые мишени для разработки антибактериальных средств, не основанных на бактерицидном или бактериостатическом действии, в настоящее время на рынке фармпрепаратов такие препараты отсутствуют.

Очевидно, что необходимо разрабатывать принципиально новые подходы и препараты для лечения бактериальных инфекций, которые могут применяться как самостоятельно, так и при комбинированной терапии. Фундаментальные исследования последних 10 лет позволили изменить стратегию борьбы с инфекциями. В частности, в качестве мишеней для поиска антибактериальных препаратов выбирают факторы патогенности бактерий. Такие препараты должны не убивать микробы, а подавлять вирулентность, не создавая условий для селективного отбора, что принципиально снижает риск развития генетически детерминированной резистентности к применяемому препарату. Таким образом, увеличение доли антибиотикорезистентных бактериальных инфекций требует поиска не только новых антибиотиков, но и эффективных ингибиторов факторов вирулентности, подавляющих инфекцию по иному механизму.

Важнейшим фактором реализации бактериями патогенных свойств является транспорт белковых факторов вирулентности в клетку макроорганизма. Процесс осуществляется путем секреции и экспорта эффекторных молекул через мембраны, либо непосредственно в цитоплазму клетки-хозяина, что приводит к изменению ее нормального физиологического состояния и способствует инвазии и внутриклеточному размножению патогена. В настоящее время известно семь систем секреции, различающихся по структуре секреторного аппарата и специфической направленностью действия эффекторных молекул.

Перспективной мишенью для разработки новых антибактериальных препаратов является система секреции III типа (ССТТ) грамотрицательных бактерий, осуществляющая перенос белков - факторов патогенности из бактериальной клетки непосредственно в цитоплазму эукариотической клетки. ССТТ присутствует только у патогенных бактерий; именно благодаря ее функционированию широкий спектр бактерий с различным типом паразитирования (экзо- и эндопаразиты) реализуют свои патогенные свойства. Мутации, приводящие к нарушению функций ССТТ, вызывают снижение или потерю вирулентности (7) (А.С. McShan, R.N. De Guzman, 2015).

У P.aeruginosa белки, секретируемые посредством третьей транспортной системы, являются токсинами, вызывающими гибель клеток путем апоптоза или некроза. Основное их действие направлено на подавление иммунного ответа: они ингибируют миграцию и фагоцитоз макрофагов и нейтрофилов, рекрутируемых к очагу инфекции, вызывают гибель иммунных клеток. Так, при пневмонии, белки ССТТ создают иммуносупрессию в тканях легкого, что позволяет не только синегнойной палочке персистировать в легких, но и способствует развитию суперинфекции при заражении другими патогенами.

В целом, секретируемые белки псевдомонад участвуют в установлении инфекции и диссеминации патогена при острой инфекции, и ответственны за персистенцию при хронической инфекции. Элиминация P.aeruginosa у больного косвенно способствует его сопротивляемости к другим инфекциям, за счет повышения защитных свойств организма хозяина, подавленных в результате действия ССТТ P.aeruginosa.

К настоящему времени идентифицировано 4 эффекторных белка ССТТ P.aeruginosa, ExoU, ExoS, ЕхоТ, ExoY. Фактически все штаммы псевдомонад имеют гены, кодирующие секреторный аппарат, однако большинство штаммов не содержат полный набор генов, детерминирующих эффекторные белки. Клинические штаммы P.aeruginosa характеризуются различными генотипами и фенотипами, что влияет на тяжесть заболевания и клинический прогноз. Изучение частоты смертельных исходов, бактериальной персистенции в легких, диссеминации бактерий показало, что секреция токсина ExoU вносит наибольший вклад в вирулентность, в то время как секреция белка ExoS белка связана с меньшей вирулентностью, а белок ЕхоТ имеет минимальный эффект на проявление вирулентных свойств патогена. Патогенез поражения легких связан с активностью ExoU, который индуцирует прокоагулянтные процессы в эпителиальных клетках, гиперпроницаемость сосудов, активацию тромбоцитов и образование тромбов при псевдомонадной пневмонии и сепсисе. Токсическое действие ExoU направлено против фагоцитов, а также на преодоление эпителиального барьера, что способствует бактериальной диссеминации и персистенции (8) (B.J. Berube et al. 2016).

Поиски ингибиторов ССТТ активно продолжаются в настоящее время, т.к. терапия такими препаратами имеет ряд преимуществ по сравнению с антибиотиками:

- ингибиторы ССТТ не способствуют отбору устойчивых форм микроорганизмов, поскольку не вызывают гибель и не подавляет размножение патогенов, а только ингибируют их вирулентность. Эрадикация возбудителя, утратившего вирулентные свойства, происходит в результате действия иммунных защитных сил организма-хозяина.

- ингибиторы ССТТ перспективны для лечения инфекций, вызванных патогенами, устойчивыми к антибиотикам, т.к. эти ингибиторы действуют на возбудителя вне зависимости от приобретенной резистентности к антибиотикам.

- поскольку ингибиторы ССТТ оказывают воздействие только на патогенные микроорганизмы, терапия этими препаратами не будет вызывать гибель нормальной микрофлоры человека и развития дисбактериозов.

- потеря вирулентности возбудителем под воздействием ингибитора значительно снизит вред, наносимый патогеном организму хозяину.

В настоящее время в научных публикациях и в патентах описан целый ряд ингибиторов ССТТ P.aeruginosa, имеющих различную химическую структуру, принадлежащих к различным классам низкомолекулярных соединений, а также специфические антитела к белку кончика иглы инжектосомы (9) (A. Ahalieyah et al. 2016). Наиболее изучены два основных класса низкомолекулярных соединений, гидразоны салицилового альдегида (salicylidene acylhydrazides) (10, 11) Slepenkin A., et al. 2011; A. Anantharajah, et al. 2012) и тиазолидиноны (thiazolidinones) (12, 13) (Felise H.B., et al. 2008;. Kline Т., et al. 2009). Для нескольких ингибиторов были выявлены конкретные мишени в ССТТ, но большинство мишеней для ингибиторов ССТТ еще предстоит идентифицировать или охарактеризовать. Большинство ингибиторов ССТТ являются соединениями, отобранными в результате скрининга синтетических химических библиотек, но также есть ингибиторы природного происхождения - ауродокс, каминозид, гуадиномин, (-)-хопеафенол, цитрусовые флавоноиды, пиерисидин, псевдокерамин, салицилиденеанилид, лактоферрин, альгинат, муцин и др. Помимо низкомолекулярных соединений ингибирующие действие на ССТТ показано для некоторых высокомолекулярных веществ, которые представлены полимерами, белками, полипептидами-миметиками, полисахаридами (9) (A. Ahalieyah et al. 2016).

По направлению воздействия на ССТТ ингибиторы могут быть разделены на следующие группы:

- действующие на генетическую регуляцию СССТ (растительные фенольные соединения, N-гидрокси-бензимидазолы, салицилиден ацилразиды);

- действующие на функционирование аппарата ССТТ (гидроксихинолины, тиазолидиноны, фенилацетамиды, PcrV-антитела (КВ001; V2L2MD), PcrV/Psl-антитела MEDI3902);

- действующие на эффекторные белки ССТТ (экзоцин, арильные сульфаниламиды, псевдолипаза А);

- ингибиторы неопределенного действия (С20, С22, С24, С34 и С38, (-)-hopeaphenol, галлий (III) - салицилиден ацилгидразиды) (9) (A. Ahalieyah et al. 2016).

Таким образом, к настоящему времени известен целый ряд технических решений, связанных с получением ингибиторов ССТТ псевдомонад. Среди них низкомолекулярные соединения различных классов, а также специфические антитела к структурному белку ССТТ.

Для всех полученных ингибиторов показана активность в отношении подавления секреторной функции патогена в условиях in vitro. При этом для большинства ингибиторов не идентифицирована конкретная мишень действия и не изучен молекулярный механизм ингибирования. Следовательно, полученные к настоящему времени ингибиторы ССТТ могут обладать различной активностью, подавляя секрецию, как специфически, так и опосредовано через иные молекулярные мишени патогена.

При разработке эффективных лекарственных препаратов на основе ингибиторов ССТТ для лечения инфекционных заболеваний ключевой задачей является доказательство антибактериального действия полученных ингибиторов на моделях инфекционного процесса у животных. Это обусловлено тем, что подавление секреторной функции патогена снижает его вирулентность, но не влияет на жизнеспособность, т.е. напрямую не связано с подавлением инфекции. Тем самым, для ингибиторов ССТТ требуется экспериментально подтвердить концепцию о том, что снижение вирулентности приведет к блокированию инфекции в организме хозяина. Кроме того, потенциальные лекарственные препараты должны характеризоваться отсутствием токсического эффекта на организм хозяина и на нормальную микрофлору.

Среди известных ингибиторов терапевтический эффект в виде подавления синегнойной инфекции в моделях in vivo был показан для специфических антител к компонентам иглы ССТТ-PcrV-антитела (КВ001; V2L2MD) (16, 17) (Francois, В. et al. 2012; Warrener, P. et al. 2014) и PcrV/Psl-антитела (MEDI3902) (18) (DiGiandomenico, A. et al. 2014). Однако эту группу препаратов на основе антител следует рассматривать отдельно в связи с тем, что они относятся к группе иммунобиологических лекарственных препаратов. Также терапевтический эффект в виде подавления синегнойной инфекции в моделях in vivo был показан для низкомолекулярного соединения INP1855, принадлежащего к классу гидроксихинолинов (14, 15) (А. Anantharajah, Е. Faure, J.М. Buyck, et al. 2016; Enquist, P.A., et al. 2012). Данное решение, как наиболее близкое к заявляемому по назначению - как ингибитор, терапевтический эффект которого выражается в виде подавления синегнойной инфекции, было принято авторами за прототип.

Химическая структура ингибитора ССТТ P. aeruginosa, выбранного в качестве прототипа

По прототипу данного изобретения, сущность которого отражена в работе по изучению подавляющего инфекцию действия ингибитора ССТТ, относящегося к классу гидроксихинолинов, в отношении острой легочной инфекции у мышей, вызванной синегнойной палочкой, показано, что однократное интраназальное введение препарата INP1855 в дозе 4,5 мкг сразу после заражения летальной дозой P.aeruginosa повышало процент выживших животных с 38% (в контроле) до 88% через 48 час после заражения, т.е. наблюдали подавление гибели животных в 5 раз. У мышей, получавших INP1855, наблюдали снижение на 2-3% патологических изменений в легких и примерно в 30 раз снижение количества бактерий в легких. Был также показан дозозависимый эффект INP1855 при внутрибрюшинном введении через 4 ч. после заражения псевдомонадами (14) (A. Anantharajah, Е. Faure, J.М. Buyck, et al. 2016).

Эта работа является единственной опубликованной, показывающей эффективность низкомолекулярного ингибитора ССТТ на модели in vivo, но имеет ряд недостатков в отношении активности и изученности полученного ингибитора.

1. Эксперименты на животных были проведены с одним штаммом Pseudomonas aeruginosa, который характеризуется exoU⁺ генотипом, при этом оппозитный генотип exoS⁺, являясь инвазивным, вызывает генерализованные инфекции и сепсис, а также является преобладающим среди всех клинических штаммов, от 85 до 75%.

2. Не была разработана полная схема лечения.

3. Не было показано полное подавление накопления возбудителя в тканях легкого. Количество высеваемых из легкого псевдомонад после лечения ингибитором сохранялось в значительном числе, более чем, 10⁵ КОЕ/легкое. При этом известно, что не долеченная инфекция может приводить к развитию хронических состояний и рецидивов на фоне ослабления иммунного статуса.

4. Не проведена характеристика токсичности полученного ингибитора для экспериментальных животных.

5. Не изучено влияние полученного ингибитора на нормальную микрофлору.

Таким образом, существует необходимость проведения дальнейших исследований с целью расширения арсенала ингибиторов системы секреции III типа P.aeruginosa, изучения их эффективности на моделях инфекционного процесса у животных, испытаний их возможной токсичности для организма хозяина и микрофлоры. Такие исследования направлены на разработку нового поколения антибактериальных препаратов с отличным от антибиотиков механизмом действия и эффективными в отношении антибиотикорезистентных штаммов синегнойной палочки.

Раскрытие изобретения

Технической задачей, решаемой данным изобретением, является:

- подавление инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa с различным генотипом по генам эффекторных белков ССТТ и различным профилем антибиотикорезистентности.

- подавление инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa у зараженного организма на модели in vivo, вне зависимости от приобретенной антибиотикорезистентности.

- отсутствие ингибирующего действия на нормальную микрофлору макроорганизма при применении 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa.

Указанная задача решается путем

применения 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa в живом организме, а также способом подавления инфекции вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa заключающимся в воздействии на штаммы Pseudomonas aeruginosa эффективным количеством этого соединения.

Термины и определения

«Инфекция» - совокупность биологических процессов, возникающих и развивающихся в организме хозяина при внедрении и размножении в нем патогенных микробов.

«Подавление инфекции» - процесс ограничения проявления факторов, развивающихся в организме хозяина после внедрения и размножения патогенов

«Накопление патогена в тканях» - процесс, характеризующийся размножением бактерий

«Подавление бактерий» - блокирование жизнеспособности бактерий в результате негативного действия на метаболизм и/или на размножение

«Факторы патогенности» - механизмы, обеспечивающие колонизацию микробов, их устойчивость к микробицидным факторам организма, инвазивность и токсигенность, а также способность к длительному персистированию

«Подавление факторов патогенности» - ингибирование процессов колонизации, устойчивости к микробицидным факторам организма, инвазивности, токсигенности и персистирования

«Генотип» - совокупность генов данного организма.

«Система секреции III типа бактерий» - аппарат бактериальной клетки, обеспечивающий одноэтапный транспорт эффекторных молекул патогенности из цитоплазмы бактерии в цитозоль эукариотической клетки макроорганизма. Рассматривается как один из основных факторов патогенности грамотрицательных бактерий, реализующих инвазию, токсигенность и диссеминацию патогена в инфицированном организме (далее ССТТ).

«Профиль антибиотикорезистентности» - отсутствие чувствительности бактерий к конкретным антимикробным препаратам

«Формирование антибиотикорезистентности» - свойство отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции. Формирование резистентности обусловлено генетически: приобретением новой генетической информации или изменением уровня экспрессии собственных генов. Резистентные штаммы выживают и распространяются в условиях селективного действия антибиотиков.

«In vitro» - технология выполнения экспериментов, когда опыты проводятся «в пробирке» - вне живого организма на культуре живых клеток или в бесклеточной модели.

«In vivo» - технология выполнения экспериментов на живом организме, на человеке или на животной модели.

«Облигатные внутриклеточные бактерии» - бактерии, размножающиеся только внутри эукариотических клеток, ввиду энергетической зависимости от макроэргических молекул клетки хозяина. Культивируются in vitro только в клеточных культурах. Инфекцию в макроорганизме вызывают в результате внутриклеточной колонизации и воздействия на метаболизм клетки хозяина.

«Внеклеточные патогенные бактерии» - бактерии, размножающиеся в организме хозяина вне клеток и вызывающие инфекцию в результате действия факторов патогенности.

Авторами были синтезированы и запатентованы биологически активные вещества, подавляющие патогенные бактерии, представляющие собой замещенные производные 1,3,4-тиадиазолинов (I), тиадиазинонов (II) и тиадиазепинонов (III), полученные на основе тиогидразидов оксаминовых кислот (патент РФ №2447066). Полученные активные низкомолекулярные соединения являются ингибиторами системы секреции III типа у патогенных бактерий. Для полученных соединений было показано подавление размножения патогенных бактерий в культуре клеток в условиях in vitro на примере хламидий. Хламидии являются представителями облигатных внутриклеточных паразитов, у которых система секреции III типа обеспечивает контакт с клеткой хозяина, а ее ингибирование блокирует размножение бактерий. Специфичность ингибиторов в отношении системы секреции III типа была продемонстрирована при детекции эффекторного белка хламидий, секретируемого с помощью ССТТ, в мембрану хламидийной фагосомы. В этом патенте не было исследовано и экспериментально показано, что полученные низкомолекулярные ингибиторы подавляют секрецию эффекторных белков ССТТ у внеклеточных патогенов. При этом механизм взаимодействия внутриклеточных и внеклеточных патогенов с организмом хозяина принципиально различен, а система секреции III типа у этих двух групп бактерий выполняет различные функции. У внутриклеточных патогенов ССТТ обеспечивает возможность внутриклеточного выживания, а у внеклеточных - развитие инфекции в результате токсического действия молекул эффекторов в отношении иммунных и барьерных клеток. В патенте не была экспериментально продемонстрирована возможность подавления инфекции в организме животного при действии полученных ингибиторов ССТТ. Кроме того, не было изучено влияние выбранных ингибиторов ССТТ на секреторный аппарат P.aeruginosa и на развитие инфекционного процесса у лабораторных животных.

Поэтому разработка применения 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида и способа подавления инфекции, вызванной антибиотикорезистентными штаммами Pseudomonas aeruginosa, на модели инфекции у животных с помощью низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа, представленного в настоящем изобретении, обладает «новизной» и изобретательским уровнем.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена схема синтеза 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида VIII (соединение CL-55).

На фиг. 2 показана реакция препаратов секретируемых белков P. aeruginosa с антителами к эффектору ЕхоТ. Красным цветом отмечена сильная реакция. Название штаммов P. aeruginosa отмечены сверху рисунка.

На фиг. 3 показано подавление активности ССТТ клинических штаммов 1625/36/2015 с exoU+ генотипом (А) и КБ6 с exoS+ генотипом (Б) P.aeruginosa (после индукции ССТТ 5 мМ EGTA и действии разных концентраций CL-55 при постановке метода иммуноблота с сывороткой к ЕхоТ белку (53 кДа), обозначен стрелками.

Примеры

1. Получение низкомолекулярного ингибитора ССТТ на основе синтеза 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида

2. Исследование механизма действия 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на клинических штаммах Pseudomonas aeruginosa с различным профилем резистентности к антибиотикам.

3. Изучение токсичности 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для животных.

4. Влияние 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на жизнеспособность бактерий in vitro и in vivo.

5. Определение эффективной ингибирующей дозы 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида на лабораторных животных.

6. Изучение терапевтической эффективности ингибитора ССТТ на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов.

7. Изучение профилактической эффективности ингибитора ССТТ на модели экспериментальной инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa двух разных ССТТ генотипов.

Пример 1:

Получение низкомолекулярного ингибитора ССТТ на основе синтеза 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида

Действующим веществом антибактериального лекарственного средства на основе низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа в заявленном изобретении является 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид VIII (соединение CL-55), который получается циклизацией хлоруксусной кислотой тиогидразида оксаминовой кислоты VII и процесс его синтеза включает в себя получение и последующее взаимодействие хлорацетамида III с предварительно приготовленным раствором элементной серы с морфолином, последующее взаимодействие монотиооксамидов IV с гидразин-гидратом, реакцию полученного гидразида V с 3-этокси-4-гидрокси-бензальдегидом и восстановление полученного гидразона VI боргидридом натрия в метаноле.

Общий подход с синтезу 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид VIII (соединение CL-55) представлен на фигуре 1.

Синтез 2-хлор-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (III). К раствору 130 гр (1 моль) 2,4-дифторанилина (I) в 1000 мл ДМФА добавляют при охлаждении 87,5 мл (1,1 моль) хлорацетилхлорида (II), следя за тем, чтобы температура реакционной смеси не превышала 20°C. После окончания прибавления раствора хлорида (II) перемешивают при комнатной температуре раствор еще 2 часа. Затем выливают реакционную смесь в 2000 мл холодной воды и отфильтровывают осадок. Промывают его на фильтре многократно водой и сушат в вакуум-эксикаторе. Выход ацетамида (III) - 179 гр (87%). Т. пл. 101-102°C. ЯМР ¹Н CDCl₃ (δ, м.д., J, Гц): 4,20 (с, 2Н, ArCH₂Cl); 7,10-7,25 (м, 2Н, Ar); 7,53 (м, 1Н, Ar); 10,25 (с, 1Н, Ar-NH-СО). Найдено (%): С 46.62, Н 2.99, N 6.84. Вычислено (%): С 46.74, Н 2.94, N 6.81. Масс-спектр, m/z: 205.

Синтез 2-морфолин-4-ил-2-тиоксо-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (IV). Предварительно приготавливают раствор 2,6 моль элементной серы в 800 мл ДМФА и добавляют одной порцией 2,6 моль морфолина. Полученную смесь перемешивают в течение 30 минут и добавляют к образовавшейся коричнево-красной суспензии раствор 179 гр (0,87 моль) хлорацетамида (III) в в 200 мл ДМФА, при охлаждении, следя за тем, чтобы температура не превышала 10°C. Полученную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 12 часов. После окончания реакции (контроль по ТСХ), реакционную смесь выливают в воду, подкисляют реакционную смесь до рН 4-5, затем отфильтровывают выпавшие бледно-желтые кристаллы и промывают их на фильтре многократно водой. Затем растворяют их в ацетоне, отфильтровывают непрореагировавшую серу. Затем упаривают ацетон, остаток перекристаллизовывают из этанола и получают 189 гр бледно-желтых кристаллов морфолида (IV). Выход - 76%.

Синтез 2-гидразино-2-тиоксо-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (V). Полученный морфолид (IV) растворяют в 500 мл изопропанола и добавляют 40 мл (0,79 моль) гидразин-гидрата и кипятят в течение 30 минут. Затем выливают в воду и подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 7. Отфильтровывают осадок и сушат его в вакуум-эксикаторе. Выход: (V) - 101,2 гр, (73%). Т. пл. 154-156°C. ЯМР ¹Н CDCl₃ (δ, м.д., J, Гц): 7,10-7,26 (м, 2Н, Ar); 7,50 (м, 1Н, Ar); 10,30 (с, 1Н, Ar-NH-СО). Найдено (%): С 41.40, Н 3.18, N 18.25. Вычислено (%): С 41.56, Н 3.05, N 18.17. Масс-спектр, m/z: 231.

Синтез 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (VI). К 101 гр (0,44 моль) 2-гидразино-2-тиоксо-N-(2,4-дифтор-фенил)-ацетамида (V) в 500 мл этанола добавляют 0,44 моль 3-этокси-4-гидрокси-бензальдегида и кипятят при перемешивании в течение 5 минут. Охлаждают реакционную смесь и отфильтровывают 113,7 гр (68%) выпавших желтых кристаллов 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифторфенил)-ацетамида (VI), промывают их на фильтре холодным этанолом и используют далее без дополнительной очистки.

Синтез 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензил)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифтор-фенил)-ацетамида (VII). При охлаждении льдом (0-5°C) и перемешивании добавляют 17 гр (0,45 ммоль) боргидрида натрия к суспензии 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензилиден)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифтор-фенил)-ацетамида небольшими порциями. Реакционную смесь оставляют на 2 часа при охлаждении и перемешивании, затем добавляют 25 мл воды и нейтрализовывают разбавленной соляной кислотой до рН 7. Выпавший светло-желтый осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из изопропанола. Выход (VII) - 91,4 гр, (75%). Т. пл. 119-121°C. ЯМР ¹Н CDCl₃ (δ, м.д., J, Гц): 1.35 (т, 3H, -O-СН₂СН₃, J=7,22); 3,96 (кд, 2Н, -О-СН₂СН₃, J=7,00 (13,90)); 4,32 (с, 1Н, -NH-CH₂-Ar); 6,98-7,62 (м, 6Н, Ar); 9,02 (с, 1Н, ArOH); 10,12 (с, 1Н, Ar-NH-СО). Найдено (%): С 53.45, Н 4.58, N 10.94. Вычислено (%): С 53.54, Н 4.49, N 11.02. Масс-спектр, m/z: 381.

Синтез 4-(3-этокси-4-гидрокси-бензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-карбокси-(2,4-дифторфенил)амида (соединение CL-55) (VIII). 91 гр (0,24 моль) 2-[N’-(3-этокси-4-гидрокси-бензил)-гидразино]-2-тиоксо-N-(2,4-дифтор-фенил)-ацетамида (VII) добавляют к раствору 0,29 моль хлоруксусной кислоты в 5 мл изопропанола. Добавляют к реакционной смеси каталитическое количество ацетата аммония и кипятят 4 часа (контроль по ТСХ). После окончания реакции реакционную смесь охлаждают, отфильтровывают выпавшие кристаллы и промывают их на фильтре водой и холодным этанолом. Остаток четырехкратно перекристаллизовывают из этанола. Выход (VIII) - 75,7 гр, (75%). Т. пл. 129-130°C. ЯМР ¹Н (400 MHz, DMSO-d6): 1.33 (т, 3H, -О-СН₂СН₃); 3,71 (с, 2Н, S-CH₂-CO); 4,01 (кд, 2Н, -O-СН₂СН₃); 4,92 (с, 2Н, -NH-CH₂-Ar); 6,75-6,81 (м, 2Н, Ar); 6,98 (с, 1Н, Ar); 7,12-7,17 (м, 1Н, Ar); 7,36-7,42 (м, 1Н, Ar); 7,59-7,65 (м, 1Н, Ar); 8,90 (с, 1Н, -NH-СН₂-Ar); 10,06 (с, 1Н, ArOH). ЯМР ¹³С (100 MHz, DMSO-d6): 15.16, 25.48, 53.56, 64.29, 104.95, 111.98, 114.23, 115.88, 121.49, 128.02, 128.31, 141.16, 146.90, 154.93, 157.41, 158.00, 159.06, 159.75, 161.49; Найдено (%): С 56.50 Н 4.62, N 10.31. Вычислено (%): С 56.57 Н 4.50, N 10.42. Масс-спектр, m/z: 421.

Пример 2.

Исследование механизма действия 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) на штаммах клинического происхождения Pseudomonas aeruginosa с различным профилем резистентности к антибиотикам.

Механизм действия низкомолекулярного ингибитора ССТТ - CL-55: ингибирование транспорта в эукариотическую клетку факторов патогенности, эффекторных белков ССТТ, ExoS, ЕхоТ, ExoY и ExoU, в результате специфического подавления ССТТ патогена.

С целью изучения действия ингибитора ССТТ - CL-55 на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa с разным профилем резистентности к антибиотикам были проведены следующие исследования:

1. Изучена роль ССТТ у клинических антибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa на основе изучения наличие генов, кодирующих эффекторные белки ССТТ, и активности секреторного аппарата у этих штаммов в условиях in vitro.

2. Охарактеризовано ингибирующее действие 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (CL-55) на функциональную активность ССТТ клинических антибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa.

Изучение роли ССТТ у клинических антибиотикорезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa

Исследование проводили на 77 штаммах синегнойной палочки, выделенных из образцов клинического материала в стационарах Москвы. Штаммы были выделены из отделяемого дыхательных путей, из крови и отделяемого открытых инфицированных ран. 96% (74 штамма) были устойчивыми хотя бы к одному антибиотику, 62% характеризовались множественной резистентностью.

Изучение частоты встречаемости генов, кодирующих белки - эффекторы ССТТ псевдомонад, у полученных госпитальных штаммов проводили с помощью ПЦР с ДНК штаммов. При отработке условий проведения реакции были использованы референс-штаммы P.aeruginosa с известным ССТТ генотипом, РАО (exoS+exoT+exoY+exoU-) и РА103 (exoS-ехоТ+exoY+exoU+). В таблице 1 представлена последовательность праймеров, выбранных для определения наличия генов ССТТ P.aeruginosa.

Среди всех проанализированных штаммов exoU+ генотип встречался в 13,8%, полученных из отделений интенсивной терапии ("ОРИТ"), и в несколько большем проценте - 22,7% у штаммов из других отделений ("не-ОРИТ"). exoS+ генотип был выявлен у анализируемых госпитальных штаммов в значительно большем проценте, чем exoU+ генотип, что соответствует известным опубликованным данным. Так, в группе штаммов, полученных из "ОРИТ", exoS+ генотип был детектирован в 86,2%, а в группе "не-ОРИТ" - в 79,5%. В таблице 2 представлены результаты ССТТ генотипирования клинических штаммов P.aeruginosa при определении генов эффекторных белков методом ПЦР и результаты характеристики функциональной активности ССТТ при определении секреции ЕхоТ белка методом иммуноблота.

С целью изучения активности ССТТ у клинических штаммов псевдомонад в условиях in vitro использовали модель индукции функциональной активности транспортной системы при снижении концентрации кальция в среде культивирования бактерий. Для этого к активно делящейся культуре псевдомонад добавляли хелатор кальция, EGTA, и тестировали присутствие секреторного белка ЕхоТ в культуральной среде с помощью специфических антител методом иммуноблота. Ночную