Система индикации на основе полноразмерного антитела для эукариотических клеток и ее применение

Система индикации на основе полноразмерного антитела для эукариотических клеток и ее применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к области моноклональных антител, в основном к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие антитела. Изобретение относится к способам создания и отбора эукариотической клетки, экспрессирующей и представляющей на своей поверхности антитело, в основном полноразмерное моноклональное антитело, в основном биспецифическое моноклональное антитело, которое способно специфически связываться с одним или более чем одним антигеном, представляющим интерес.

Уровень техники

Известными способами выделения рекомбинантных антител являются фаговый дисплей (Hogenboom, Methods Mol. Biol. 178 (2002) 1-37), рибосомный/мРНК дисплей (Lipovsek and Plueckthun, J. Immunol. Method 290 (2004) 51-67) и дисплей микробных клеток (Boder and Wittrup, Nat. Biotechnol. 15 (1997) 553-557).

Система скрининга на основе опосредованной вирусом коровьей оспы экспрессии целых антител в клетках млекопитающих представлена в US 2002/0123057. Другая система скрининга основана на экспрессии антител на клеточной поверхности клеток млекопитающих (Но, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 9637-9642).

Фаговый дисплей позволяет провести скрининг от 10¹² до 10¹³ клонов в одном раунде пэннинга (Barbas III, et al., (eds.), Phage Display-Α Laboratory manual, Cold Spring Habour Press, (2001)), в то время как пропускная способность процедуры скрининга млекопитающих в формате «одно антитело на клетку» ограничивается сопутствующим анализом примерно от 10⁶ до 10⁷ клонов.

Клеточный дисплей описан в Higuchi et al. в клетках COS (J. Immunol. Meth. 202 (1997) 193-204). Beerli et al. сообщали о дисплейной библиотеке scFv на клеточной поверхности на основе вируса Синдбис, полученной из антигенспецифических В-клеток в ВНК-клетках (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 (2008) 14336-14341). Но и Pastan сообщали о способах с клетками HEK293 (scFv) (Methods Mol. Biol. 562 (2009) 99-113). Лимфоцитарный дисплей описан в Alonso-Camino et al. (PLoS One. 4 (2009) e7174). Zhou et al. сообщают о способах, использующих клетки HEK293 (Acta Biochim. Biophys. Sin. 42 (2010) 575-584). Zhou et al. сообщают о системе Flp-ln (MAbs. 2 (2010) 508-518).

Taube, R., et al. сообщают (PLOS One 3 (2008) e3181) о стабильной экспрессии человеческих антител на поверхности человеческих клеток и лентивирусных частиц.

В WO 2007/047578 описан клеточный дисплей библиотек антител.

Сущность изобретения

Обнаружили, что полноразмерные антитела могут быть экспрессированы и представлены на эукариотических клетках с использованием лентивирусной частицы, содержащей бицистронную экспрессионную кассету. Экспрессия полноразмерных антител на эукариотических клетках с использованием лентивирусной частицы, о которой сообщается в данном документе, возможна с помощью элемента IRES (внутреннего сайта посадки рибосомы) EV71, который связывает либо экспрессионные кассеты легкой цепи антитела и тяжелой цепи антитела, либо экспрессионные кассеты двух тяжелых цепей антитела.

В случае присутствия экспрессионной кассеты с легкой цепью антитела и экспрессионной кассеты с тяжелой цепью антитела в лентивирусном векторе экспрессионная кассета с тяжелой цепью антитела может содержать после экзона, кодирующего С-концевой домен антитела, неконститутивный сайт сплайсинга, обеспечивающий, помимо экспрессии растворимой тяжелой цепи антитела, также экспрессию мембраносвязанной тяжелой цепи антитела, приводя к презентации мембраносвязанного полноразмерного антитела.

В случае присутствия двух экспрессионных кассет с тяжелой цепью антитела в лентивирусном векторе либо обе, либо только вторая экспрессионная кассета с тяжелой цепью антитела может содержать после экзона, кодирующего С-концевой домен антитела, экзон, кодирующий трансмембранный домен, приводя к презентации мембраносвязанного полноразмерного антитела.

Кроме того, в данном описании приведены способы создания и отбора эукариотической клетки, экспрессирующей и представляющей на своей поверхности антитело, в основном моноклональное полноразмерное антитело.

Одним из аспектов, о которых сообщается в данном документе, является лентивирусный вектор, содержащий бицистронную экспрессионную кассету, которая включает в направлении от 5'- к 3'-

- промотор,

- первую нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь полноразмерного антитела,

- EV71-IRES,

- вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь полноразмерного антитела,

- интрон с возможностью сплайсинга, и

- трансмембранный домен или GPI-якорь.

Этот лентивирусный вектор, о котором сообщается в данном документе, представляет собой экспрессионный вектор, который содержит бицистронную экспрессионную кассету для экспрессии легкой цепи полноразмерного антитела и тяжелой цепи полноразмерного антитела, где IRES, разделяющий две экспрессионные кассеты, представляет собой EV71-IRES.

Было обнаружено, что только EV71-IRES может быть использован для экспрессии полноразмерного антитела в бицистронной экспрессионной кассете в лентивирусной экспрессионной системе.

В связи с предоставлением интрона с возможностью слайсинга растворимая форма тяжелой цепи антитела, а также мембраносвязанная форма тяжелой цепи антитела может быть экспрессирована из экспрессионного вектора, о котором сообщается в данном документе.

При экспрессии растворимой формы и мембраносвязанной формы тяжелой цепи антитела клетка, с одной стороны, секретирует полноразмерное антитело, которое может быть проверено, например, в ELISA, и в то же время представляет на своей поверхности мембраносвязанную форму полноразмерного антитела, которая может быть использована для селекции клеток, например, с помощью FACS, позволяющего выделять отдельный клон клеток.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является лентивирусный вектор, содержащий бицистронную экспрессионную кассету, которая включает в направлении от 5'- к 3'-

- промотор,

- первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь полноразмерного антитела,

- EV71-IRES,

- вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь полноразмерного антитела, и

- трансмембранный домен или GPI-якорь.

Этот лентивирусный вектор, о котором сообщается в данном документе, представляет собой экспрессионный вектор, который содержит бицистронную экспрессионную кассету для экспрессии двух различных тяжелых цепей полноразмерного антитела, где IRES, разделяющий две экспрессионные кассеты, представляет собой EV71-IRES.

При экспрессии мембраносвязанной формы тяжелой цепи антитела клетка представляет на своей поверхности связанную с мембраной форму полноразмерного антитела, которая может быть использована для отбора клетки, например, с помощью FACS, позволяющего выделять отдельный клон клеток.

В одном воплощении антитело представляет собой антитело, которое специфически связывается с антигеном. Таким образом, в одном воплощении антитело или кодирующая антитело нуклеиновая кислота, соответственно, получены из В-клетки, которая была выбрана по такому специфическому связыванию с антигеном.

В одном воплощении антитело представляет собой двухвалентное моноспецифическое антитело. В одном воплощении антитело специфически связывается с антигеном.

В одном воплощении антитело представляет собой двухвалентное биспецифическое антитело. В одном воплощении антитело специфически связывается с двумя различными антигенами или с двумя эпитопами на одном и том же антигене.

В одном воплощении антитело представляет собой четырехвалентное биспецифическое антитело. В одном воплощении антитело специфически связывается с двумя различными антигенами или с двумя эпитопами на одном и том же антигене.

В одном воплощении экспрессионный вектор представляет собой лентивирусный (экспрессионный) вектор.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является библиотека лентивирусного вектора, содержащая две или более двух лентивирусных частиц, каждая из которых содержит экспрессионный вектор, о котором сообщается в данном документе, где антитела, кодируемые каждым вектором, отличаются друг от друга по меньшей мере на одну аминокислоту.

В одном воплощении библиотека вектора содержит от 1000 до 1000000 различных экспрессионных векторов.

В одном воплощении антитела, кодируемые векторами из библиотеки вектора, различаются по меньшей мере на один аминокислотный остаток в вариабельных доменах антитела.

В одном воплощении антитела, кодируемые векторами из библиотеки вектора, различаются по меньшей мере на один аминокислотный остаток в одном из CDR антитела. В одном воплощении CDR представляет собой CDR3 тяжелой цепи.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является эукариотическая клетка, содержащая бицистронную экспрессионную кассету, о которой сообщается в данном документе. В одном воплощении бицистронная экспрессионная кассета была трансдуцирована в клетку.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является библиотека эукариотических клеток, содержащая две или более двух эукариотических клеток, каждая из которых содержит бицистронную экспрессионную кассету или вектор, о котором сообщается в данном документе, где антитела, экспрессированные каждой клеткой, отличаются друг от друга по меньшей мере на одну аминокислоту.

В одном воплощении библиотека эукариотических клеток содержит от 1000 до 1000000 отличающихся клеток млекопитающего.

В одном воплощении антитела, экспрессированные клетками из библиотеки эукариотических клеток, различаются по меньшей мере на один аминокислотный остаток в вариабельных доменах антитела.

В одном воплощении антитела, кодируемые эукариотическими клетками из библиотеки эукариотических клеток, различаются по меньшей мере на один аминокислотный остаток в одном из CDR антитела. В одном воплощении CDR представляет собой CDR3 тяжелой цепи.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является библиотека эукариотических клеток, содержащая библиотеку вектора, о которой сообщается в данном документе.

В одном воплощении эукариотические клетки из библиотеки эукариотических клеток экспрессируют и представляют одно антитело.

В одном воплощении эукариотические клетки из библиотеки эукариотических клеток представляют одно антитело.

В одном воплощении библиотека эукариотических клеток представляет собой популяцию эукариотических клеток, экспрессирующих библиотеку антител, где кодирующая нуклеиновая кислота получена из В-клеток иммунизированного животного. В одном воплощении В-клетки предварительно выбраны по их специфичности к представляющему интерес антигену.

В одном воплощении библиотека эукариотических клеток представляет собой популяцию эукариотических клеток, где каждая клетка содержит первую экспрессионную кассету, кодирующую полноразмерное антитело, которое специфически связывается с первым антигеном, и вторую экспрессионную кассету, кодирующую полноразмерное антитело, которое специфически связывается со вторым антигеном.

В одном воплощении библиотека эукариотических клеток представляет собой популяцию эукариотических клеток, где каждая клетка содержит первую экспрессионную кассету, кодирующую первую легкую цепь полноразмерного антитела и первую тяжелую цепь полноразмерного антитела, связывающего первый антиген, и вторую экспрессионную кассету, кодирующую вторую легкую цепь полноразмерного антитела и вторую тяжелую цепь полноразмерного антитела, специфически связывающего второй антиген.

В одном воплощении библиотека эукариотических клеток представляет собой популяцию эукариотических клеток, где каждая клетка содержит экспрессионную кассету, кодирующую первую тяжелую цепь полноразмерного антитела, специфически связывающего первый антиген, и вторую тяжелую цепь полноразмерного антитела, специфически связывающего второй антиген, где эукариотическая клетка экспрессирует общую легкую цепь.

В одном воплощении первая тяжелая цепь полноразмерного антитела содержит мутацию типа «замок», а вторая тяжелая цепь антитела содержит мутацию типа «ключ».

В одном воплощении первая легкая цепь полноразмерного антитела содержит в качестве константного домена СН1-домен, а первая тяжелая цепь полноразмерного антитела содержит в качестве первого константного домена CL-домен, или вторая легкая цепь полноразмерного антитела содержит в качестве константного домена СН1-домен, а вторая тяжелая цепь полноразмерного антитела содержит в качестве первого константного домена CL-домен.

В одном воплощении библиотеку экспрессионного вектора получают путем рандомизации одного или более аминокислотного остатка в одной или более CDR родительского экспрессионного вектора.

В одном воплощении библиотеку экспрессионного вектора получают путем комбинации двух различных полуантител.

Один из аспектов, о котором сообщается в данном описании, относится к способу выделения или отбора антитела, которое специфически связывается с одним или более, в основном с двумя антигенами, представляющими интерес.

Было обнаружено, что способ скрининга, о котором сообщается в данном документе, может быть выполнен в формате «одно антитело на клетку», который является предпочтительным, так как он позволяет завершать скрининг за один раунд отбора.

В данном документе сообщается о способе получения, выбора и/или выделения клетки, экспрессирующей антитело, которое специфически связывается с антигеном.

В одном воплощении антитело представляет собой моноклональное полноразмерное антитело. В одном воплощении антитело представляет собой биспецифическое моноклональное полноразмерное антитело.

Способы, о которых сообщается в данном документе, позволяют клонировать вариабельные области антитела или целое антитело из выбранной клетки.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является способ рекомбинантной продукции антител, отобранных с помощью способа, о котором сообщается в данном документе.

В одном воплощении полноразмерное антитело содержит константную область человеческого происхождения, в частности человеческого антитела класса IgG1, IgG2 или IgG4.

Способы, о которых сообщается в данном документе, позволяют рекомбинантно производить антитела с желаемой специфичностью в полностью видоспецифической форме, в основном полностью человеческие антитела.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является способ отбора клетки, экспрессирующей антитело, которое специфически связывается с представляющим интерес антигеном, включающий следующие этапы:

(a) возможно, отбор из популяции В-клеток субпопуляции В-клеток или отдельной В-клетки или клональной популяции В-клеток, секретирующих антитело, которое специфически связывается с одним или более чем одним антигеном,

(b) создание лентивирусной экспрессионной библиотеки, где каждый представитель лентивирусной экспрессионной библиотеки кодирует вариант антитела или антител, которые специфически связываются с одним или более чем одним антигеном, путем

(i) создания множества молекул ДНК, где создание включает этап амплификации пула молекул ДНК из субпопуляции В-клеток или этап получения библиотеки молекул ДНК из ДНК, кодирующей одно антитело, которое специфически связывается с одним или двумя антигенами, представляющими интерес, путем рандомизации кодирующей нуклеиновокислотной последовательности, и

(ii) клонирования множества молекул ДНК в лентивирусный экспрессионный вектор, содержащий EV71-IRES-связанную бицистронную экспрессионную кассету для экспрессии легкой цепи полноразмерного антитела и тяжелой цепи полноразмерного антитела как в растворимой, так и в мембраносвязанной форме;

(c) трансдукция популяции эукариотических клеток популяцией лентивирусных частиц, каждая из которых содержит представителя лентивирусной экспрессионной библиотеки;

(d) представление антител, кодируемых лентивирусной экспрессионной библиотекой, на поверхности эукариотических клеток млекопитающих; и

(e) выделение из популяции эукариотических клеток клетки, где клетка выбрана по способности антитела, представленного на ее поверхности, специфически связываться с антигеном или антигенами, представляющими интерес, или с их фрагментами или антигенными детерминантами.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является способ отбора клетки, экспрессирующей биспецифическое антитело (которое специфически связывается с двумя антигенами, представляющими интерес), включающий следующие этапы:

(a) создание лентивирусной экспрессионной библиотеки, где каждый представитель лентивирусной экспрессионной библиотеки кодирует вариант биспецифического антитела, путем

(i) создания множества молекул ДНК из ДНК, кодирующей одно биспецифическое антитело, путем рандомизации кодирующей нуклеиновокислотной последовательности, и

(ii) клонирования множества молекул ДНК в лентивирусный экспрессионный вектор, содержащий EV71-IRES-связанную бицистронную экспрессионную кассету для экспрессии полноразмерного биспецифического антитела в мембраносвязанной форме;

(b) трансдукция популяции эукариотических клеток популяцией лентивирусных частиц, каждая из которых содержит представителя лентивирусной экспрессионной библиотеки;

(c) представление антител, кодируемых лентивирусной экспрессионной библиотекой, на поверхности эукариотических клеток млекопитающего; и

(d) выделение из популяции эукариотических клеток клетки, где клетка выбрана по способности антитела, представленного на ее поверхности, специфически связываться с антигенами, представляющими интерес, или с их фрагментами или антигенными детерминантами.

Применение лентивирусной экспрессионной библиотеки в сочетании с лентивирусным экспрессионным вектором, содержащим EV71-IRES-связанную бицистронную экспрессионную кассету, для экспрессии легкой цепи полноразмерного антитела и тяжелой цепи полноразмерного антитела как в растворимой, так и в мембраносвязанной форме, позволяет достичь высокой эффективности скрининга.

В одном воплощении способ включает создание множества молекул ДНК, кодирующих антитела, которое включает следующие этапы:

(1) амплификация из субпопуляции В-клеток первого пула молекул ДНК, кодирующих вариабельные области тяжелой цепи (HCVR); и

(2) амплификация из субпопуляции В-клеток второго пула молекул ДНК, кодирующих вариабельные области легкой цепи (LCVR);

(3) клонирование комбинации множества молекул ДНК, кодирующих LCVR, и множества молекул ДНК, кодирующих HCVR, в лентивирусный экспрессионный вектор, содержащий EV71-IRES-связанную бицистронную экспрессионную кассету, для экспрессии легкой цепи полноразмерного антитела и тяжелой цепи полноразмерного антитела одновременно как в растворимой, так и в мембраносвязанной форме.

В одном воплощении способ включает создание множества молекул ДНК, кодирующих антитела, которые специфически связываются с одним или двумя антигенами, представляющими интерес, при этом создание множества молекул ДНК включает следующие этапы:

(1) амплификация из отдельной В-клетки или клональной популяции В-клеток молекулы ДНК, кодирующей HCVR, и молекулы ДНК, кодирующей LCVR, и

(2) рандомизация молекулы ДНК, кодирующей HCVR, и/или молекулы ДНК, кодирующей LCVR, путем рандомизации по меньшей мере одного кодона и тем самым создание множества молекул ДНК, кодирующих HCVR, и множества молекул ДНК, кодирующих LCVR;

(3) клонирование комбинации рандомизированного множества молекул ДНК, кодирующих LCVR, и множества молекул ДНК, кодирующих HCVR, в лентивирусный экспрессионный вектор, содержащий EV71-IRES-связанную бицистронную экспрессионную кассету, для экспрессии легкой цепи полноразмерного антитела и тяжелой цепи полноразмерного антитела одновременно как в растворимой, так и в мембраносвязанной форме.

В одном воплощении способ включает создание лентивирусной экспрессионной библиотеки, которое включает следующие этапы:

(i) создание множества молекул ДНК, кодирующих антитела, включающееэтапы:

(1) выделения мРНК из субпопуляции В-клеток;

(2) транскрипции мРНК в кДНК;

(3) амплификации из кДНК первого пула молекул ДНК с помощью первой смеси олигонуклеотидов, содержащей по меньшей мере два олигонуклеотида, способных амплифицировать кодирующие области HCVR; и

(4) амплификации из кДНК второго пула молекул ДНК с помощью второй смеси олигонуклеотидов, содержащей по меньшей мере два олигонуклеотида, способных амплифицировать кодирующие области LCVR;

(ii) клонирование пары молекул ДНК из первого и второго пула молекул ДНК в лентивирусный экспрессионный вектор, содержащий EV71-IRES-связанную бицистронную экспрессионную кассету, для экспрессии легкой цепи полноразмерного антитела и тяжелой цепи полноразмерного антитела одновременно как в растворимой, так и в мембраносвязанной форме.

В одном воплощении способ включает создание лентивирусной экспрессионной библиотеки, включающее следующие этапы:

(i) создание множества молекул ДНК, кодирующих антитела, которые специфически связываются с одним или двумя антигенами, при этом создание включает этапы:

(1) выделения мРНК из отдельной В-клетки или клональной популяции В-клеток;

(2) транскрипции мРНК в кДНК;

(3) амплификации из кДНК первой молекулы ДНК с помощью первой смеси олигонуклеотидов, содержащей по меньшей мере два олигонуклеотида, способных амплифицировать кодирующие области HCVR; и

(4) амплификации из кДНК второй молекулы ДНК с помощью второй смеси олигонуклеотидов, содержащей по меньшей мере два олигонуклеотида, способных амплифицировать кодирующие области LCVR;

(5) рандомизации первой и/или второй молекулы ДНК и тем самым создания первого пула молекул ДНК и второго пула молекул ДНК,

(ii) клонирование пары молекул ДНК первого и второго пулов молекул ДНК в лентивирусный экспрессионный вектор, содержащий EV71-IRES-связанную бицистронную экспрессионную кассету, для экспрессии легкой цепи полноразмерного антитела и тяжелой цепи полноразмерного антитела одновременно как в растворимой, так и в мембраносвязанной форме.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является способ отбора клетки, экспрессирующей биспецифическое антитело (которое специфически связывается с двумя антигенами, представляющими интерес), включающий следующие этапы:

(a) создание лентивирусной экспрессионной библиотеки, где каждый представитель лентивирусной экспрессионной библиотеки кодирует варианты тяжелых цепей биспецифического антитела, путем

(i) создания множества молекул ДНК из ДНК, кодирующей тяжелые цепи одного биспецифического антитела, путем рандомизации кодирующей нуклеиновокислотной последовательности, и

(ii) клонирования множества молекул ДНК в лентивирусный экспрессионный вектор, содержащий EV71-IRES-связанную бицистронную экспрессионную кассету, для экспрессии двух тяжелых цепей биспецифического антитела, где нуклеиновая кислота ниже EV71-IRES кодирует тяжелую цепь антитела с C-концевым трансмембранным доменом;

(b) трансдукция популяции эукариотических клеток, экспрессирующих легкую цепь антитела, которая может формировать антигенсвязывающий сайт с любой из тяжелых цепей антитела, популяцией лентивирусных частиц, каждая из которых содержит представителя лентивирусной экспрессионной библиотеки;

(c) представление антител, кодируемых лентивирусной экспрессионной библиотекой, на поверхности эукариотических клеток млекопитающего; и

(d) выделение из популяции эукариотических клеток клетки, где клетка выбрана по способности антитела, представленного на ее поверхности, специфически связываться с антигенами, представляющими интерес, или с их фрагментами или антигенными детерминантами.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является лентивирусный экспрессионный вектор для представления полноразмерного антитела на поверхности эукариотической клетки.

В одном воплощении экспрессионный вектор содержит элементы ДНК, кодирующие сигнальный пептид, EV71-IRES, трансмембранную область и, возможно, метку для обнаружения.

В одном воплощении экспрессионный вектор содержит сайт рестрикции, позволяющий клонирование, особенно клонирование в определенной ориентации, молекул ДНК, кодирующих тяжелую цепь полноразмерного антитела и легкую цепь полноразмерного антитела в экспрессионный вектор.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является экспрессионная библиотека, содержащая экспрессионный вектор, о котором сообщается в данном документе.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является эукариотическая клетка, содержащая экспрессионный вектор, о котором сообщается в данном документе, или содержащая по меньшей мере один представитель экспрессионной библиотеки, о которой сообщается в данном документе.

Моноклональные антитела, полученные способом, о котором сообщается в данном документе, могут быть использованы в исследовательских целях, диагностических целях или для лечения заболеваний.

В одном воплощении эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего или дрожжевой клеткой. В одном воплощении клетка млекопитающего является клеткой CHO или клеткой HEK.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является способ отбора клетки, экспрессирующей антитело, включающий следующие этапы:

(a) получение популяции эукариотических клеток путем трансдукции популяцией лентивирусных вирусных частиц, в результате чего каждая клетка в популяции клеток представляет мембраносвязанное полноразмерное антитело, которое закодировано лентивирусной нуклеиновой кислотой и которое специфически связывается с одним или более антигеном или одним или более эпитопом на одном и том же антигене, и

(b) выбор из популяции эукариотических клеток клетки в зависимости от свойств представленного мембраносвязанного полноразмерного антитела,

при этом каждая лентивирусная частица из популяции лентивирусных частиц включает бицистронную экспрессионную кассету, содержащую EV71-IRES, для экспрессии мембраносвязанного антитела.

В одном воплощении каждая бицистронная экспрессионная кассета в лентивирусной частице из популяции лентивирусных частиц кодирует другой вариант родительского антитела, который специфически связывается с одним или более чем одним антигеном или одним или более чем одним эпитопом на одном и том же антигене.

В одном воплощении каждая бицистронная экспрессионная кассета включает в направлении от 5'- к 3'-

- промотор,

- первую нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь полноразмерного антитела,

- EV71-IRES,

- вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь полноразмерного антитела,

- интрон с возможностью сплайсинга, и

- трансмембранный домен или GPI-якорь.

В одном воплощении каждая клетка из популяции эукариотических клеток представляет мембраносвязанное полноразмерное антитело и секретирует полноразмерное антитело.

В одном воплощении каждая клетка из популяции эукариотических клеток представляет и секретирует одно полноразмерное антитело.

В одном воплощении антитело представляет собой биспецифическое антитело.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является лентивирусный вектор, содержащий бицистронную экспрессионную кассету, которая включает в направлении от 5'- к 3'-

- промотор,

- первую нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь полноразмерного антитела,

- EV71-IRES,

- вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь полноразмерного антитела,

- интрон с возможностью альтернативного сплайсинга для одновременной продукции мембраносвязанного антитела и секретируемого антитела, и

- трансмембранный домен или GPI-якорь.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является лентивирусный вектор, содержащий бицистронную экспрессионную кассету, которая включает в направлении от 5'- к 3'-

- промотор,

- первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь полноразмерного антитела,

- EV71-IRES,

- вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую в направлении от 5'- к 3'-вторую тяжелую цепь полноразмерного антитела и трансмембранный домен или GPI-якорь.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является применение лентивирусного вектора в соответствии с предыдущими аспектами для создания популяции эукариотических клеток, представляющих и секретирующих или представляющих полноразмерное антитело.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является способ отбора клетки, экспрессирующей биспецифическое антитело, включающий следующие этапы:

(a) создание популяции эукариотических клеток путем трансдукции популяцией лентивирусных частиц, где каждая лентивирусная частица содержит бицистронную экспрессионную кассету, которая содержит первую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи в локусе «замок» или «ключ», которая располагается выше EV71-IRES, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, в соответствующем другом локусе, который располагается ниже EV71-IRES, при этом первый вариабельный домен тяжелой цепи связывается с первым антигеном, а второй вариабельный домен связывается со вторым антигеном, где первый антиген и второй антиген могут быть одинаковыми или различными, где эукариотическая клетка экспрессирует общую легкую цепь, где одна или обе тяжелые цепи также содержат трансмембранный домен на их С-конце, и

(b) выбор из популяции эукариотических клеток клетки в зависимости от свойств представленного мембраносвязанного полноразмерного биспецифического антитела.

В одном воплощении только тяжелая цепь ниже EV71-IRES содержит трансмембранный домен на своем С-конце.

Одним из аспектов, о котором сообщается в данном документе, является способ отбора клетки, секретирующей биспецифическое антитело, включающий следующие этапы:

(а) создание популяции эукариотических клеток путем трансдукции популяцией лентивирусных частиц, где каждая лентивирусная частица содержит бицистронную экспрессионную кассету, кодирующую секретируемое биспецифическое антитело, которая содержит первую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи в локусе «замок» или «ключ» выше EV71-IRES, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен тяжелой цепи, в соответствующем другом локусе ниже EV71-IRES, при этом первый вариабельный домен тяжелой цепи связывается с первым антигеном, а второй вариабельный домен связывается со вторым антигеном, где первый антиген и второй антиген могут быть одинаковыми или различными, где эукариотическая клетка экспрессирует общую легкую цепь, и

(b) выбор из популяции эукариотических клеток клетки в зависимости от свойств секретируемого полноразмерного биспецифического антитела.

В одном воплощении способ включает в качестве первого этапа:

- иммунизацию трансгенного животного представляющим интерес антигеном, где В-клетки экспериментального животного экспрессируют одну и ту же легкую цепь.

В одном воплощении способ включает этап:

- отбора В-клеток иммунизированного экспериментального животного с помощью общей сортировки путем FACS.

В одном воплощении способ включает этап:

- получения нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь, из каждой В-клетки путем отдельной ПЦР-амплификации в двух отдельных/последовательных полимеразных цепных реакциях, внедряющих уникальные сайты рестрикции для направленного клонирования в шаттл-вектор/лентивирусный экспрессионный вектор.

В одном воплощении способ включает этап:

- выполнения ПЦР нуклеиновой кислоты, кодирующей полную первую тяжелую цепь, и нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен второй тяжелой цепи (2,2 т.п.о.), включая EV71-IRES, и клонирования во второй шаттл-вектор без трансмембранного домена с удалением трансмембранного домена первой тяжелой цепи путем рестрикции и повторного лигирования вектора.

Все воплощения, о которых сообщалось в данном документе, относятся ко всем аспектам данного изобретения и могут быть объединены в любой возможной комбинации.

Подробное описание изобретения

В данном документе сообщается о способе отбора с помощью экспрессии полноразмерных антител в их естественной среде, т.е. секреторном пути клеток млекопитающих, который гарантирует, что все клеточные компоненты, обычно участвующие в синтезе и процессинге антител (сворачивании, формировании дисульфидных связей, гликозилировании и т.д.) доступны в физиологической форме и концентрации.

Общие аспекты

Как известно специалистам в данной области, для производства многочисленных производных нуклеиновой кислоты и/или полипептида можно использовать технологии рекомбинантной ДНК. Такие производные могут, например, быть изменены в одной отдельной или нескольких позициях путем замещения, изменения, замены, удаления или вставки. Такое изменение или образование производного может быть осуществлено, например, путем сайт-направленного мутагенеза. Такое изменение может быть легко проведено специалистом в данной области (смотри, например, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA (1999)). Применение рекомбинантной технологии позволяет специалисту в данной области трансформировать различные клетки-хозяева гетерологичной нуклеиновой кислотой (кислотами). Хотя в разных клетках в технике транскрипции и трансляции, т.е. экспрессии, используются одни и те же элементы, клетки, принадлежащие разным видам, могут помимо прочего иметь различную так называемую частоту использования кодонов. Таким образом, идентичные полипептиды (в отношении аминокислотной последовательности) могут быть закодированы различными нуклеиновыми кислотами. Кроме того, различные нуклеиновые кислоты могут кодировать один и тот же полипептид вследствие вырожденности генетического кода.

Применение технологии рекомбинантной ДНК позволяет получать многочисленные производные нуклеиновой кислоты и/или полипептида. Такие производные могут, например, быть изменены в одной отдельной или нескольких позициях путем замещения, изменения, замены, удаления или вставки. Такое изменение или образование производного может быть осуществлено, например, путем сайт-направленного мутагенеза. Такие изменения могут быть легко проведены специалистом в данной области (см., например, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA (1999); Hames, B.D., and Higgins, S.J., Nucleic acid hybridization - a practical approach, IRL Press, Oxford, England (1985)).

Применение рекомбинантной технологии позволяет специалисту в данной области трансформировать различные клетки-хозяева гетерологичной нуклеиновой кислотой (кислотами). Хотя в разных клетках в технике транскрипции и трансляции, т.е. экспрессии, используются одни и те же элементы, клетки, принадлежащие разным видам, могут помимо прочего иметь различную так называемую частоту использования кодонов. Таким образом, идентичные полипептиды (в отношении аминокислотной последовательности) могут быть закодированы различными нуклеиновыми кислотами. Кроме того, различные нуклеиновые кислоты могут кодировать один и тот же полипептид вследствие вырожденности генетического кода.

Определения

Понятие антитела с «созревшей аффинностью» относится к антителу с одним или более изменением в одной или более гипервариабельной области (hypervariable region, HVR) по сравнению с родительским антителом, которое не обладает такими изменениями, причем такие изменения приводят к повышению аффинности антитела к антигену.

Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком его смысле и охватывает различные структуры антитела, в том числе, но не ограничиваясь ими, моноклональные антитела, поликлональные антитела и полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела).

Термин «химерное антитело» относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из конкретного источника или вида, в то время как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи получена из другого источника или вида.

Понятие «класса» антитела относится к типу константного домена или константной области, принадлежащей его тяжелой цепи. Существуют пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы (изотипы), например, Ig