Цитохром p450 и его применение для энзиматического окисления терпенов

Цитохром p450 и его применение для энзиматического окисления терпенов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение обеспечивает последовательности нуклеиновых кислоты и аминокислотные последовательности цитохрома Р450, способного окислять молекулы терпенов. Оно также обеспечивает способ окисления молекул терпенов, включающий взаимодействие цитохрома Р450 изобретения с молекулой терпена, предназначенной для окисления. В частности, указанный способ может быть осуществлен in vitro или in vivo для получения окисленных молекул терпенов, которые могут быть применены в различных областях техники, таких, например, как парфюмерия и получение ароматических веществ. Настоящее изобретение также обеспечивает вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту. Организм-хозяин или клетка-хозяин, не представляющие собой организм или клетку человека, трансформированные нуклеиновой кислотой, также представляют собой объект изобретения.

Уровень техники

Терпены были обнаружены в большинстве организмов (микроорганизмы, животные и растения). Данные соединения состоят из пяти углеродных единиц, называемых звеньями изопрена, и их классифицируют по числу данных звеньев, присутствующих в их структурах. Таким образом, монотерпены, сесквитерпены и дитерпены представляют собой терпены, содержащие 10, 15 и 20 атомов углерода, соответственно. Дитерпены, например, широко распространены в царстве растений, и было описано свыше 2500 дитерпеновых структур (Connolly and Hill, Dictionary of terpenoids, 1991, Chapman & Hall, London). Молекулы терпенов и их окисленные производные вызывали интерес в течение тысяч лет, из-за их вкусовых и ароматических свойств и их косметических, лекарственных и противомикробных эффектов. Растительные экстракты, полученные с помощью различных подходов, таких как перегонка с водяным паром или экстракция растворителем, применяли в качестве источника окисленных производных молекул терпенов. Альтернативно, молекулы терпенов, обнаруженные в растительных экстрактах или полученные с помощью биосинтетических способов, окисляли, применяя химические и энзиматические способы.

В процесс энзиматического окисления терпенов часто вовлечены ферменты, называемые цитохромы Р450 (Р450), которые, как правило, способны катализировать превращение гидрофобного субстрата, такого как молекула терпена, в более гидрофильную молекулу. Ферменты цитохром Р450 образуют суперсемейство гемопротеинов, которое обнаруживают у бактерий, архей и эукариот. В одной из наиболее распространенных активностей цитохром Р450 действует как монооксигеназа, вставляя один атом кислорода молекулярного кислорода в молекулу субстрата, тогда как другой атом кислорода восстанавливается до воды.

Для протекания этой каталитической реакции необходимо два электрона для активации молекулярного кислорода. Р450 из эукариот используют NADPH в качестве внешнего восстановителя и источника электронов. Два электрона переносятся поочередно к активному центру цитохрома Р450, и для этого переноса необходима цитохром Р450 редуктаза (CPR), представляющая собой белок-донор электронов. Одна CPR не специфична для одного цитохрома Р450. CPR представляет собой белок-донор электронов для нескольких Р450 в данном организме. Кроме того, CPR из одного организма может действовать как белок-донор электронов для Р450 из других организмов. В некоторых случаях Р450 также может быть сопряжен с белком цитохром b5, который может действовать как белок-донор электронов или может улучшать эффективность переноса электронов от CPR к Р450. В эукариотических клетках и, в особенности, в растениях, Р450 и CPR обычно представляют собой мембранно-связанные белки, которые ассоциированы с эндоплазматическим ретикулумом. Данные белки заякорены в мембране с помощью N-концевой трансмембранной спирали.

Многие из Р450 имеют низкую субстратную специфичность и, следовательно, способны катализировать окисление многих разнообразных структур, таких, например, как различные молекулы терпенов. Большинство из данных ферментов имеют определенную регио- и стереоселективность для данного субстрата, но они часто продуцируют смесь из нескольких продуктов из определенного субстрата. Такие Р450 обычно вовлечены в процессы распада и детоксикации таких молекул, как ксенобиотики, и их обычно обнаруживают в бактериях и у животных. С другой стороны, Р450, вовлеченные в биосинтетические пути, обычно демонстрируют специфичность для субстратов определенных типов и регио- и стереоселективность. Это справедливо для большинства растительных Р450.

Большое число Р450 может быть обнаружено в природе и, в особенности, в растениях. Один растительный геном может содержать несколько сотен генов, кодирующих Р450. Многие растительные Р450 охарактеризованы, но считается, что множество функций очень большого числа присутствующих в растения Р450, остаются неизвестными.

Следовательно, целесообразно проводить поиск новых Р450, способных катализировать новые энзиматические реакции, с тем, чтобы обеспечить энзиматическую продукцию новых оксигенированных соединений или для получения оксигенированных соединений в реакциях различных типов, например, из различные субстратов, которые могут оказаться более легко доступными.

Некоторые из Р450 уже охарактеризованы. Сообщалось, что в особенности, цитохромы Р450, обладающие определенным процентом идентичности последовательности с цитохромом Р450 настоящего изобретения, используют молекулы терпенов в качестве субстратов.

Цитохромы Р450, наиболее близкие к Р450 настоящего изобретения, представляют собой Р450 из Sorghum bicolor, среди них наиболее близкая последовательность обладает 67% идентичностью с аминокислотными последовательностями, описанными в настоящем документе (номер доступа EER94164).

Некоторые из оксигенированных терпенов, продуцируемых цитохромом Р450 настоящего изобретения, очень полезны в областях производства парфюмерных изделий и ароматизаторов. В особенности кусимол, который получают путем гидроксилирования зизаена, представляет собой один из ключевых компонентов масла ветивера и сам по себе служит ценным ароматизирующим ингредиентом. Окисление зизаена с применением цитохрома Р450 настоящего изобретения обеспечивает выгодную альтернативу выделению кусимола из масла ветивера, представляющему собой трудный и дорогостоящий способ. Насколько нам известно, энзиматический способ производства кусимола не известен. Некоторые другие ценные парфюмерные и ароматизирующие ингредиенты, для которых в настоящее время не известен энзиматический синтез, могут быть получены с применением цитохрома Р450 настоящего изобретения как будет описано ниже.

Другие оксигенированные терпены, продуцируемые цитохромом Р450 настоящего изобретения, полезны для других целей, таких как производство лекарственных препаратов или агрохимических продуктов. Цитохром Р450 настоящего изобретения, следовательно, открывает новый биосинтетический путь к разнообразным молекулам, обладающим интересными свойствами, полезным в различных областях промышленности и которые трудно или даже невозможно изолировать из природных материалов и трудно или невозможно получить с помощью органического синтеза.

Цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способов получения оксигенированных терпенов, в особенности, кусимола, экономичным способом. Соответственно, цель настоящего изобретения заключается в производстве оксигенированных терпенов, сопровождающемся образованием небольшого количества отходов, более энерго- и ресурсосберегающим способом и при одновременном снижении зависимости от ископаемых видов топлива. Дополнительная цель заключается в обеспечении ферментов, способных окислять молекулы терпенов, окисленные таким способом продукты полезны в качестве ингредиентов при производстве парфюмерии и/или ароматических веществ.

Примененные сокращения

по	пара оснований
DMAPP	диметилаллил дифосфат
ДНК	дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК	комплементарная ДНК
CPR	цитохром Р450-редуктаза
дНТФ	дезоксинуклеотидтрифосфат
DTT	дитиотреитол
EDTA	этилендиаминтетрауксусная кислота
FAD	флавинаденозиндинуклеотид
FMN	флавинмононуклеотид
FPP	фарнезилпирофосфат
GC	газовый хроматограф
IPP	изопентенилдифосфат
IPTG	изопропил-D-тиогалакто-пиранозид
ЛБ	лизогенный бульон
MS	масс-спектрометр
mvaK1	мевалонаткиназа
mvaK2	мевалонатдифосфаткиназа
NADP	никотинамидадениндинуклеотид фосфат
NADPH	никотинамидадениндинуклеотид фосфат, восстановленная форма
Р450	цитохром Р450
ПЦР	полимеразная цепная реакция
3'-/5'-RACE	быстрая амплификация 3'- и 5'-концов кДНК
RMCE	опосредуемый рекомбиназой обмен экспрессионными кассетами
ОТ-ПЦР	полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
РНК	рибонуклеиновая кислота
мРНК	информационная рибонуклеиновая кислота
RBS	участок связывания рибосомы

Описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает способ энзиматического окисления терпенов экономически выгодным, надежным и воспроизводимым образом.

Как предполагается в настоящей заявке, все соединения, приведенные в настоящей заявке, определяют по их формулам, как показано на фигуре 1.

Термины «цитохром Р450» или «полипептид, обладающий активностью цитохрома Р450» предназначен для целей настоящей заявки в качестве полипептида, способного катализировать окисление молекулы терпена с образованием оксигенированного соединения, такого как спирт, альдегид, кетон или карбоновая кислота. В соответствии с предпочтительным воплощением, цитохром Р450 действует как монооксигеназа путем добавления только одного атома кислорода соединению терпена. Способность полипептида катализировать окисление определенного терпена может быть просто подтверждена путем осуществления ферментного анализа, подробно описанного в примере 8.

В соответствии с настоящим изобретением, термин «полипептиды» также подразумевает включение усеченных полипептидов при условии, что они сохраняют свою цитохром Р450 активность, как определена в любом из воплощений изобретения, и что они обладают, по меньшей мере, определенным процентом идентичности с соответствующим фрагментом последовательностей SEQ ID NO: 1 или 2.

Процент идентичности между двумя пептидными или нуклеотидными последовательностями представляет собой функцию от числа остатков аминокислот или нуклеиновых кислот, которые идентичны в двух последовательностях, после выравнивания данных двух последовательностей. Идентичные остатки определяют как остатки, одинаковые в двух последовательностях в данном положении выравнивания. Процент идентичности последовательности, как применен в настоящем документе, рассчитывают из оптимального выравнивания, деля число остатков, идентичных между двумя последовательностями, на общее число остатков в самой короткой последовательности и умножая полученное значение на 100. Оптимальное выравнивание представляет собой выравнивание, в котором процент идентичности представляет собой максимально возможный. Для получения оптимального выравнивания в одну или в обе последовательности, в одном или в нескольких положениях выравнивания могут быть введены пробелы. Данные пробелы затем учитывают как неидентичные остатки для расчета процента идентичности последовательности.

Выравнивание с целью определения процента идентичности последовательности аминокислот или последовательности нуклеиновой кислоты может быть достигнуто разными путями с помощью компьютерных программ и, например, с помощью публично доступных компьютерных программ, доступных во всемирной сети. Предпочтительно, для получения оптимального выравнивания пептидной или нуклеотидной последовательности и для расчета процента идентичности последовательности может быть применена программа BLAST (Tatiana et al., FEMS Microbiol Lett., 1999, 174: 247-250, 1999) с установленными по умолчанию параметрами, доступная в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi.

Одним из объектов настоящего изобретения является полипептид, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 70% идентичную последовательностям SEQ ID NO: 1 или 2, и обладающий активностью цитохрома Р450.

В предпочтительном воплощении назначение полипептида, обладающего активностью цитохрома Р450, заключается в способности катализировать окисление, по меньшей мере, одного соединения терпена, которое выбирают из моно- или полициклических монотерпенов и сесквитерпенов. В предпочтительном воплощении, указанный сесквитерпен или монотерпен включает, по меньшей мере, одну метильную группу в качестве заместителя в циклической части молекулы. В соответствии с более предпочтительным воплощением, цитохром Р450 изобретения окисляет указанный метильный заместитель для обеспечения первичного спирта.

В соответствии с предпочтительным воплощением, соединение терпена представляет собой соединение, которое выбирают из группы, состоящей из зизаена, альфа-цедрена, альфа-лонгипинена, альфа-фунебрена, туйопсена, валенсена, бета-чамигрена, аллоаромадендрена, альфа-неокловенена, изосативена, ледена, s-лимонена, альфа-гумулена, альфа-гурюнена, альфа-пинена, бета-фунебрена, R-лимонена и бета-пинена. Более предпочтительно указанное соединение терпена представляет собой терпен, который выбирают из зизаена, альфа-цедрена, альфа-фунебрена, валенсена и туйопсена. Наиболее предпочтительно, указанное соединение терпена представляет собой зизаен.

В предпочтительном воплощении, один атом кислорода добавляют к метильной группе так, чтобы обеспечить первичный спирт, альдегид и/или карбоновую кислоту. В наиболее предпочтительном воплощении, зизаен окисляется до кусимола, зизаналя и/или зизановой кислоты.

В случае если формируется альдегид и/или карбоновая кислота, указанный альдегид и/или карбоновая кислота формируется путем дальнейшего окисления первичного спирта или под действием Р450 изобретения, или под действием одного или нескольких ферментов из других семейств, таких, например, как алкогольдегидрогеназы, альдегидредуктазы, альдегид оксидазы. Последние ферменты, например, присутствуют в любом организме-хозяине или в клетке-хозяине, в которых полипептид изобретения может быть экспрессирован.

В соответствии с предпочтительным воплощением, полипептид включает аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 75%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно, по меньшей мере, на 85%, предпочтительно, по меньшей мере, на 89%, предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 98% идентичную последовательностям SEQ ID NO: 1 или 2. В соответствии с более предпочтительным воплощением, полипептид включает SEQ ID NO: 1 или 2. Еще более предпочтительно, он состоит из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 2.

В предпочтительном воплощении изобретения последовательность также включает последовательность мембранного якоря. Последовательность, представленная последовательностями SEQ ID NO: 1 или 2, или их производными, и имеющая необходимый процент идентичности представляет собой часть полипептида, который обеспечивает Р450 активность. Последовательность мембранного якоря не вовлечена в каталитическую активность фермента. Якорная последовательность делает возможным связывание с мембраной. Подходящие якорные последовательности зависят от организма, в котором экспрессируется полипептид, и последовательности, сконструированные для распространенных типов организмов-хозяев, известны специалисту в этой области техники. Любые подходящие якорные последовательности могут быть применены в комбинации с полипептидом настоящего изобретения. Следовательно, в соответствии с одним из предпочтительных воплощений, полипептид включает последовательности SEQ ID NO: 1 или 2, скомбинированные с последовательностью мембранного якоря.

Более предпочтительно, полипептид изобретения состоит из последовательностей SEQ ID NO: 1 или 2, необязательно скомбинированных с последовательностью мембранного якоря.

Если полипептид не скомбинирован с якорной последовательностью, такой полипептид не связывается с клеточной мембраной. В этом случае, полипептидные последовательности SEQ ID NO: 1 или 2 предпочтительно могут быть модифицированы для того, чтобы улучшить его растворимость в цитоплазме.

В соответствии с другим предпочтительным воплощением, полипептид включает аминокислотную последовательность, которая представляет собой вариант последовательностей SEQ ID NO: 1 или 2, полученных с помощью генной инженерии. В других терминах, указанный полипептид включает аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая была получена с помощью модификации последовательностей SEQ ID NO: 3, 4 или их комплементарной цепи. В соответствии с более предпочтительным воплощением, полипептид, обладающий активностью цитохрома Р450, состоит из аминокислотной последовательности, которая представляет собой вариант последовательностей SEQ ID NO: 1 или 2, полученный с помощью генной инженерии, т.е. аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая была получена с помощью модификации любой из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4 или их комплементарной цепи.

Полипептиды, кодируемые нуклеиновой кислотой, полученной с помощью природной или искусственной мутации нуклеиновой кислоты изобретения, как будет описано в дальнейшем, также охвачены изобретением.

Варианты полипептидов, полученные в результате слияния дополнительных пептидных последовательностей на амино- и на карбокси-терминальных концах, также охвачены полипептидами изобретения. В особенности, такое слияние может усилить экспрессию полипептидов, полезно при очистке белка, улучшает путь, с помощью которого полипептид может быть заякорен в мембране или улучшает энзиматическую активность полипептида в желаемом окружении или в системе экспрессии. Такие дополнительные пептидные последовательности могут представлять собой, например, сигнальный пептид. Соответственно, настоящее изобретение охватывает варианты полипептидов изобретения, такие как полипептиды, полученные с помощью слияния с другими олиго- или полипептидами, и/или такие как полипептиды, соединенные с сигнальными пептидами. Полипептиды, полученные в результате слияния с другим функциональным белком, таким как белок пути биосинтеза терпенов, предпочтительно, терпен-синтазой, также охвачены полипептидами изобретения. Один особенно предпочтительный пример полипептида изобретения, представляющий собой вариант, полученный в результате слияния с пептидной последовательностью, - это слитый полипептид, включающий как полипептид изобретения (обладающий активностью цитохрома Р450), так и CPR.

В соответствии с другим воплощением, полипептид выделяют из Vetiveria zizanioides (L.) Nash.

Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид в соответствии с любым из вышеописанных воплощений, также представляет собой цель настоящего изобретения.

В соответствии с предпочтительным воплощением, нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 75%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно, по меньшей мере, на 85%, предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, предпочтительно, по меньшей мере, на 93%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 98% идентичную последовательностям SEQ ID NO: 3, 4 или их комплементарной цепи. В соответствии с более предпочтительным воплощением, нуклеиновая кислота включает SEQ ID NO: 3, 4 или их комплементарные цепи. В соответствии с еще более предпочтительным воплощением, нуклеиновая кислота состоит из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4 или их комплементарных цепей, необязательно вместе с нуклеотидной последовательностью, кодирующей последовательность мембранного якоря.

В соответствии с другим воплощением, нуклеиновую кислоту выделяют из Vetiveria zizanioides (L.) Nash.

Нуклеиновая кислота изобретения может быть определена как включающая дезоксирибонуклеотидные или рибонуклеотидные полимеры как в одно- или в двухцепочечной форме (ДНК и/или РНК). Термины «нуклеотидная последовательность» также следует понимать как включающие молекулу полинуклеотида или молекулу олигонуклеотида в форме отдельного фрагмента или как составную часть более крупной нуклеиновой кислоты. Нуклеиновые кислоты изобретения также включают определенные изолированные нуклеотидные последовательности, включающие последовательности, которые практически не загрязнены эндогенным материалом. Нуклеиновая кислота изобретения может быть усеченной, при условии, что она кодирует полипептид, охваченный настоящим изобретением, как описано выше.

В соответствии с более предпочтительным воплощением, по меньшей мере, одна нуклеиновая кислота в соответствии с любым описанным выше воплощением включает нуклеотидную последовательность, которая была получена с помощью модификации SEQ ID NO: 3, 4 или их комплементарной цепи. Предпочтительно, указанная нуклеиновая кислота состоит из нуклеотидной последовательности, которая была получена с помощью модификации SEQ ID NO: 3, 4 или их комплементарной цепи.

Нуклеиновые кислоты, включающие последовательность, полученную с помощью мутации последовательности SEQ ID NO: 3, 4 или их комплементарной цепи, охвачены изобретением, при условии, что последовательности, которые они включают, обладают, по меньшей мере, определенным процентом идентичности с соответствующими фрагментами последовательности SEQ ID NO: 3, 4 или их комплементарной цепи, и при условии, что они кодируют полипептид, обладающий активностью цитохрома Р450, как определено любым из вышеописанных воплощений. Мутации могут представлять собой любой тип мутаций данных нуклеиновых кислот, такие как точечные мутации, делеционные мутации, вставочные мутации и/или мутации сдвига рамки считывания. Вариант нуклеиновой кислоты может быть получен с целью адаптации ее нуклеотидной последовательности к специфической системе экспрессии. Например, известно, что бактериальные системы экспрессии более эффективно экспрессируют полипептиды, если аминокислоты кодируются предпочтительным кодоном. Благодаря вырожденности генетического кода, в котором более чем один кодон может кодировать одну и ту же аминокислоту, множество последовательностей ДНК могут кодировать один и тот же полипептид, все данные последовательности ДНК охвачены изобретением.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ окисления, по меньшей мере, одного соединения терпена, включающий

a) взаимодействие указанного соединения терпена, по меньшей мере, с одним полипептидом изобретения в присутствии цитохрома Р450 редуктаза (CPR);

b) необязательно, выделение окисленного терпена, полученного на стадии а).

Соединение терпена, окисленное полипептидом изобретения, и сам полипептид изобретения, представляют собой такое соединение терпена и такой полипептид как определено по любому из вышеописанных воплощений.

Способ может быть осуществлен как in vitro, так и in vivo, как будет объяснено подробно далее.

Если способ осуществляют in vitro, то полипептид изобретения, предназначенный для взаимодействия с соединением терпена и CPR, может быть получен с помощью экстракции из любого экспрессирующего его организма с помощью стандартных методик экстракции белков или ферментов. Если организм-хозяин представляет собой одноклеточный организм или клетку, высвобождающий полипептид изобретения в культуральную среду, например, если отсутствуют мембранные якори, то полипептид может быть просто собран из культуральной среды, например, центрифугированием, необязательно, с последующими стадиями промывки и повторного суспендирования в подходящих буферных растворах. Если организм или клетка накапливают полипептид внутри своих клеток, то полипептид может быть получен с помощью разрушения или лизиса клеток и последующей экстракции полипептида из клеточного лизата. Если Р450 и CPR, такие как природные Р450 и CPR в растениях, включают последовательность мембранного якоря, то они ассоциированы с мембранами и, следовательно, локализованы в мембранной фракции клеточных лизатов. Мембранная фракция (микросомы) может быть легко отделена от других белковых фракций с помощью различных методик центрифугирования грубого клеточного лизата известными способами.

Для способа in vitro полипептид изобретения и CPR могут быть обеспечены независимо в изолированной форме или как часть белкового экстракта и суспендированы в буферном растворе при оптимальном pH. Если необходимо, то для оптимизации ферментативной активности могут быть добавлены соли, DTT, NADPH, NADH, FAD, FMN и другие вид энзиматических кофакторов. Подходящие условия будут описаны более подробно в приведенных далее примерах.

Соединение терпена затем добавляют к суспензии или к раствору, которые затем инкубируют при оптимальной температуре, например, от 15 до 40°C, предпочтительно, от 25 до 35°C, более предпочтительно, при 30°C. После инкубации, полученный окисленный терпен может быть изолирован из инкубируемого раствора с помощью стандартных процедур выделения, таких как экстракция растворителем и перегонка, необязательно, после удаления полипептидов из раствора.

При взаимодействии Р450 и соединения терпена должна присутствовать CPR.

В соответствии с другим предпочтительным воплощением, способ окисления соединения терпена осуществляют in vivo. В этом случае, стадия а) описанного выше способа включает культивирование организма-хозяина или клетки-хозяина, не представляющих собой организм или клетку человека, трансформированных для экспрессии, по меньшей мере, одного полипептида изобретения в присутствии соединения терпена для окисления в условиях, способствующих окислению соединения терпена, указанный организм или клетка дополнительно экспрессирующие CPR.

Соединение терпена и полипептид представляют собой такие соединение терпена и полипептид как определено в любом из воплощений настоящего изобретения.

В одном из воплощений такого способа, соединение терпена, предназначенное для окисления, продуцируется в организме-хозяине или в клетке-хозяине, которые экспрессируют полипептид изобретения. В этом случае, соединение терпена продуцируется в организме-хозяине или в клетке-хозяине под действием терпен-синтазы, способной катализировать образование указанного соединения терпена из нециклического предшественника терпена. Указанная терпен-синтаза может быть или образована естественным образом организмом-хозяином или клеткой-хозяином, или если организм-хозяин или клетка-хозяин не экспрессируют такой терпен-синтазы естественным образом, то они могут быть трансформированы так, чтобы они могли делать это.

В альтернативном воплощении, в случае, если применяют клетку-хозяина или если организм-хозяин представляет собой микроорганизм, то соединение терпена, предназначенное для окисления, могут добавлять к культуральной среде указанной клетки или микроорганизма. Соединение терпена будет проникать через мембрану клетки или микроорганизма, и таким образом, получать возможность вступать в реакцию с полипептидом изобретения, экспрессируемым указанной клеткой-хозяином или микроорганизмом.

В соответствии с более предпочтительным воплощением, способ дополнительно включает, перед стадией а), трансформирование организма или клетки, не представляющих собой организм или клетку человека, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислотой изобретения, так чтобы указанный организм или клетка экспрессировали, по меньшей мере, один полипептид изобретения. Полипептид и нуклеиновая кислота были такими, как определено в любом из вышеописанных воплощений.

Особенно выгодно осуществлять способ in vivo, поскольку возможно осуществлять способ без предварительного выделения полипептида. Реакция протекает непосредственно внутри организма или клетки, трансформированных для экспрессии полипептида.

Для проявления каталитической активности Р450 должен быть применен в комбинации с Р450-редуктазой (CPR), которая способна переносить электроны от NADPH (никотинамидадениндинуклеотид фосфат, восстановленная форма) к активному центру Р450, таким образом, чтобы реконструировать активность Р450. CPR должна присутствовать для осуществления как способа in vitro, так и способа in vivo. Если способ осуществляют in vivo, CPR может либо присутствовать естественным образом в организме-хозяине или клетке-хозяине, или такие организм или клетка могут быть трансформированы для экспрессии CPR перед трансформацией, одновременно с трансформацией или после трансформации, проведенной для экспрессии полипептида изобретения. В предпочтительном воплощении изобретения клетку-хозяина или организм трансформируют слитым полипептидом, включающим как полипептид изобретения, так и CPR.

В другом предпочтительном воплощении CPR представляет собой растительную CPR. Наиболее предпочтительно ее получают из CPR из Arabidopsis thaliana.

Организм или клетка, не относящиеся к человеку, могут быть успешно дополнительно трансформированы, по меньшей мере, одним геном, кодирующим полипептид, вовлеченный в метаболизм, приводящий к образованию ациклических предшественников терпенов, таких как геранилпирофосфат, фарнезилпирофосфат или геранилгеранилпирофосфат. Такие полипептиды включают, например, ферменты МЕР-пути, MVA-пути и/или пренилтрансферазы.

Трансформирование организма или клетки, не представляющих собой организм или клетку человека, полипептидом, обладающим активностью цитохрома Р450, и трансформирование CPR, или трансформирование слитым полипептидом, включающим оба полипептида, в присутствии предназначенного для окисления соединения терпена, как описано в любом из воплощений изобретения, достаточно для того, чтобы произошло окисление терпена. Тем не менее, дополнительная трансформация, по меньшей мере, одним ферментом, вовлеченным в продукцию ациклического предшественника терпена и/или изопентенилдифосфата (IPP) или диметилаллилдифосфата (DMAPP), имеет то преимущество, что увеличивает количество доступного для окисления соединения терпена.

Организм или клетка предназначены для «экспрессии» полипептида, при условии, что организм или клетка трансформируют для несения нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный полипептид, данная нуклеиновая кислота транскрибируется в мРНК и полипептид обнаруживают в организме-хозяине или в клетке-хозяине. Термин «экспрессируют» охватывает термины «гетерологично экспрессируют» и «сверх-экспрессируют», последнее относится к уровням мРНК, полипептида и/или ферментативной активности превышающим таковые, измеренные в нетрансформированных организме или клетке. Более подробное описание подходящих способов трансформации организма-хозяина или клетки-хозяина, не представляющих собой организм или клетку человека, будет описано в дальнейшем в той части описания, которая посвящена таким трансформированным организмам-хозяевам или клеткам-хозяевам, не представляющим собой организм или клетки человека, как специфическим целям настоящего изобретения, и в примерах.

Способы трансформации организмов, например, микроорганизмов, такие чтобы они экспрессировали терпен-синтазу, также известны в этой области техники. Такие способы, например, могут быть найдены в WO 2010/134004, в которой описана трансформация различных организмов-хозяев и клеток-хозяев зизаен-синтазой, т.е. ферментом, способным катализировать образование зизаена из фарнезилпирофосфата.

Для осуществления изобретения in vivo, организм-хозяин или клетку-хозяин культивируют в условиях, способствующих продукции окисленного терпена. Такие условия представляют собой любые условия, приводящие к росту организма-хозяина или клетки-хозяина. Предпочтительно, такие условия разрабатывают для оптимального роста организма-хозяина или клетки-хозяина. Соответственно, если хозяин представляет собой трансгенное растение, то обеспечивают условия оптимального роста, такие как, например, оптимальный свет, воду и условия питания. Если хозяин представляет собой одноклеточный организм, то условия, способствующие продукции окисленного терпена, могут включать добавление к культуральной среде хозяина подходящих кофакторов. Кроме того, культуральная среда может быть выбрана так, чтобы сделать окисление терпена максимальным. Оптимальные условия культивирования известны специалисту в этой области техники и не представляют собой специфические условия настоящего изобретения. Примеры подходящих условий описаны более подробно в следующих далее примерах.

Организмы-хозяева, не представляющие собой организм человека, подходящие для осуществления способа изобретения in vivo могут представлять собой любые многоклеточные или одноклеточные организмы, не представляющие собой организм человека. В предпочтительном воплощении, организм-хозяин, не представляющий собой организм человека, применяемый для осуществления изобретения in vivo, представляет собой растение, прокариота или гриб. Любое растение, прокариот или гриб могут быть применены. В особенности, полезны те растения, которые в природе продуцируют большие количества терпенов. В более предпочтительном воплощении, растение выбирают из семейств Solanaceae, Poaceae, Brassicaceae, Fabaceae, Malvaceae, Asteraceae или Lamiaceae. Например, растение выбирают из родов Nicotiana, Solanum, Sorghum, Arabidopsis, Brassica (рапс), Medicago (люцерна), Gossypium (хлопок), Artemisia, Salvia и Mentha. Предпочтительно, растение принадлежит к виду Nicotiana tabacum.

В более предпочтительном воплощении организм-хозяин, не представляющий собой человека, применяемый для осуществления способа изобретения in vivo, представляет собой микроорганизм. Может быть применен любой микроорганизм, но в соответствии с еще более предпочтительным воплощением указанный микроорганизм представляет собой бактерию или гриб. Предпочтительно указанный гриб представляет собой дрожжи. Наиболее предпочтительно, указанная бактерия представляет собой Е. coli и указанные дрожжи представляют собой Saccharomyces cerevisiae.

Некоторые из данных организмов не производят терпен подвергаемый окислению естественным образом. Для того чтобы подходить для осуществления способа изобретения, данные организмы должны быть трансформированы с целью продуцировать указанный терпен. Они могут быть трансформированы таким образом или перед трансформацией, одновременно с трансформацией или после трансформации нуклеиновой кислотой, описанной в соответствии с любым из описанных выше воплощений, как объяснено выше.

Также вместо полных организмов в качестве хозяев для осуществления способа изобретения in vivo, могут быть применены изолированные клетки высших эукариот. Подходящие эукариот