Катионные эмульсии "масло-в-воде"

Катионные эмульсии "масло-в-воде"

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 61/361892, поданной 6 июля 2010 года, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Терапевтические средства на основе нуклеиновых кислот перспективны для лечения заболеваний в диапазоне от наследственных нарушений до приобретенных состояний, таких как рак, инфекционные нарушения (СПИД), заболевания сердца, артрит и нейродегенеративные нарушения (например, болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера). Функциональные гены можно доставлять не только для восстановления генетического дефекта или индукции экспрессии продуктов экзогенных генов, но также нуклеиновую кислоту можно доставлять для ингибирования экспрессии эндогенного гена для получения терапевтического эффекта. Ингибирование экспрессии гена может быть опосредовано, например, антисмысловыми олигонуклеотидами, двухцепочечными РНК (например, миРНК, мкРНК) или рибозимами.

Ключевым этапом для такой терапии является доставка молекул нуклеиновой кислоты в клетки in vivo. Однако доставка молекул нуклеиновой кислоты in vivo, в частности, молекул РНК, имеет ряд технических затруднений. Во-первых, в результате действия клеточных и сывороточных нуклеаз время полужизни РНК, вводимой in vivo, составляет всего приблизительно 70 секунд (см., например, Kurreck, Eur. J. Bioch. 270: 1628-44 (2003)). Осуществляли попытки повышать стабильность вводимой РНК с помощью химических модификаций; однако существует несколько примеров, когда химические изменения приводят к повышению цитотоксических эффектов или потере или снижению функции. В одном конкретном примере клетки не переносили дозы дуплекса РНКи, в которой каждый второй фосфат заменяли фосфотиоатом (Harborth, et al., Antisense Nucleic Acid Drug Rev. 13(2): 83-105 (2003)). В связи с этим существует необходимость разработки систем доставки, с помощью которых можно доставлять достаточные количества молекул нуклеиновой кислоты (в частности, молекул РНК) in vivo для индукции терапевтического ответа, но они не являются токсичными для хозяина.

Привлекательным подходом вакцинации являются вакцины на основе нуклеиновых кислот. Например, внутримышечная (IM) иммунизация плазмидной ДНК, кодирующей антиген, может вызывать клеточный и гуморальный иммунные ответы и защищать от заражения. ДНК-вакцины представляют определенные преимущества по сравнению с традиционными вакцинами с использованием белковых антигенов или ослабленных патогенов. Например, по сравнению с белковыми вакцинами, ДНК-вакцины могут являться более эффективными в отношении продукции правильно свернутого антигена в его нативной конформации и в стимуляции клеточного иммунного ответа. Кроме того, ДНК-вакцины не имеют некоторых проблем с безопасностью, связанных с убитыми или ослабленными патогенами. Например, препарат убитого вируса может содержать остаточные живые вирусы, и ослабленный вирус может мутировать и возвращаться к патогенному фенотипу.

Другим ограничением вакцин на основе нуклеиновых кислот являются большие дозы нуклеиновых кислот, как правило, необходимые для получения сильных иммунных ответов у не являющихся человеком приматов и людей. Таким образом, системы доставки и адъюванты необходимы для усиления активности вакцин на основе нуклеиновых кислот. Разработаны различные способы встраивания молекул нуклеиновой кислоты в клетки, такие как трансфекция с использованием фосфата кальция, трансфекция с использованием полипрена, слияние протопластов, электропорация, микроинъекция и липофекция.

Катионные липиды общепринято составляют в виде липосом для доставки генов в клетки. Однако даже небольшое количество сыворотки (~10%) может значительно снижать активность трансфекции комплексов липосома/ДНК, т.к. сыворотка содержит анионные материалы. В последнее время разрабатывают катионные липидные эмульсии для доставки молекул ДНК в клетки. См., например, Kim, et al., International Journal of Pharmaceutics, 295, 35-45 (2005).

В патентах США №№ 6753015 и 6855492 описывают способ доставки молекул нуклеиновой кислоты позвоночному с использованием катионных микрочастиц. Микрочастицы содержат полимер, такой как поли(α-гидроксикислота), полигидроксимасляная кислота, поликапролактон, полиортоэфир, полиангидрид и т.п., и образованы с использованием катионных поверхностно-активных веществ. Молекулы нуклеиновой кислоты адсорбируются на поверхностях микрочастиц.

Kim et al. (Pharmaceutical Research, vol. 18, pages 54-60, 2001) и Chung et al. (Journal of Controlled Release, volume 71, pages 339-350, 2001) описывают различные составы эмульсии "масло-в-воде", применяемые для повышения эффективности трансфекции молекул ДНК in vitro и in vivo.

Ott et al. (Journal of Controlled Release, volume 79, pages 1-5, 2002) описывают подход, включающий катионную сверхтонкую эмульсию в качестве системы доставки/адъюванта для ДНК. Подход с использованием сверхтонкой эмульсии основан на MF59, активном сквалене в водном адъюванте, производимом в крупном масштабе и применяемом в коммерческом одобренном продукте (Fluad®). Для облегчения внутриклеточной доставки плазмидной ДНК использовали 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP).

Хотя вакцины на основе ДНК открывают огромные перспективы для профилактики и лечения заболеваний, возникают сильные сомнения относительно их безопасности. Вводимые молекулы ДНК потенциально могут встраиваться в геном хозяина или, в результате их распределения в различных тканях, могут приводить к нежелательной длительной экспрессии антигенов. Кроме того, конкретные ДНК-вирусы также используют в качестве средства для доставки молекул ДНК. Из-за своих инфекционных свойств, такие вирусы достигают очень высокого коэффициента трансфекции. Используемые вирусы генетически модифицированы таким образом, что в трансфицированной клетке не образуются функциональные инфекционные частицы. Однако, несмотря на эти меры предосторожности, невозможно исключить риск неконтролируемой репродукции встраиваемого гена и вирусных генов, например, в результате потенциальных рекомбинационных событий. Это также влечет за собой риск встраивания ДНК в интактный ген в геноме клетки-хозяина, например, посредством рекомбинации, в результате этот ген может мутировать и, таким образом, полностью или частично инактивироваться или может приводить к неправильной передаче информации. Другими словами, синтез продукта гена, жизненно важного для клетки, можно полностью супрессировать, или, альтернативно, экспрессируется модифицированный или неправильный продукт гена. Кроме того, как правило, трудно расширять производство и очистку подходящих для клинического применения вирусных векторов.

Один конкретный риск возникает, если ДНК встраивают в ген, участвующий в регуляции роста клетки. В этом случае клетка-хозяин может дегенерировать и приводить к раку или образованию опухоли. Кроме того, если ДНК, встраиваемая в клетку, подлежит экспрессии, соответствующий ДНК-носительо должен содержать сильный промотор, такой как вирусный промотор CMV. Встраивание таких промоторов в геном подвергаемой обработке клетки может приводить к нежелательным изменениям регуляции экспрессии гена в клетке. Другим риском использования ДНК в качестве средства для стимуляции иммунного ответа (например, в качестве вакцины) является индукция патогенных антител против ДНК у пациента, которому вводили чужеродную ДНК, таким образом, вызывающая нежелательный иммунный ответ.

Молекулы РНК, кодирующие антиген или его производное, также можно использовать в качестве вакцин. РНК-вакцины обладают определенными преимуществами по сравнению с ДНК-вакцинами. Во-первых, РНК не может встраиваться в геном хозяина, таким образом, отсутствует риск развития злокачественных новообразований. Во-вторых, в результате быстрой деградации РНК, экспрессия чужеродного трансгена часто является кратковременной, позволяя избегать неконтролируемой длительной экспрессии антигена. В-третьих, для экспрессии кодируемого антигена молекулам РНК необходима только доставка в цитоплазму, в то время как молекулы ДНК должны проникать через ядерную мембрану.

Тем не менее, по сравнению с вакцинами на основе ДНК, вакцинам на основе РНК уделяют относительно мало внимания. РНК и олигонуклеотиды являются гидрофильными, отрицательно заряженными молекулами, очень восприимчивыми к деградации нуклеазами при введении в качестве терапевтического средства или вакцины. Дополнительно, РНК и олигонуклеотиды не транспортируются активно в клетки. См., например, Vajdy, M., et al., Mucosal adjuvants and delivery systems for protein-, DNA- и RNA-based vaccines, Immunol Cell Biol, 2004. 82(6): p. 617-27.

Ying et al. (Nature Medicine, vol. 5, pages 823-827, 1999) описывают самореплицирующуюся РНК-вакцину, в которой доставляют лишенную оболочки РНК, кодирующую β-галактозидазу, и сообщают об индукции CD8+-клеток.

Montana et al. (Bioconjugate Chem. 2007, 18, pages 302-308) описывают использование катионных твердофазных липидных наночастиц в качестве носителей РНК для переноса гена. Показывали, что твердофазные липидные наночастицы защищали молекулу РНК от деградации, и после микроинъекции комплекса РНК-частица в яйца морского ежа определяли экспрессию репортерного белка (флуоресцеин).

В WO 2010/009277 описывают липидно-пептидные наночастицы (NLPP), содержащие (a) амфипатический пептид, (b) липид и (c) по меньшей мере одну иммуногенную молекулу. В определенных вариантах осуществления NLPP также включают положительно заряженное "средство захвата", такое как катионный липид. Средство захвата используют для заякоривания отрицательно заряженной иммуногенной молекулы (например, молекулы ДНК или молекулы РНК). Для получения NLPP необходимы амфипатические пептиды, используемые для солюбилизации липидного компонента и для образования наночастиц.

Таким образом, существует необходимость предоставления систем доставки молекул нуклеиновой кислоты или других отрицательно заряженных молекул. Системы доставки применимы для вакцин на основе нуклеиновых кислот, в частности, вакцин на основе РНК.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, главным образом, относится к катионным эмульсиям "масло-в-воде", которые можно использовать для доставки в клетки отрицательно заряженных молекул, таких как молекула РНК. Частицы эмульсии содержат масляное ядро и катионный липид. Катионный липид может взаимодействовать с отрицательно заряженной молекулой, таким образом, заякоривая молекулу в частицах эмульсии. Катионные эмульсии, представленные в настоящем описании, в частности, подходят для доставки молекул нуклеиновой кислоты (таких как молекула РНК, кодирующая антиген) в клетки и составления вакцин на основе нуклеиновых кислот.

В одном из аспектов изобретение относится к композиции, содержащей молекулу РНК в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где частица содержит (a) масляное ядро, находящееся в жидкой фазе при 25°C, и (b) катионный липид. Предпочтительно, частица катионной эмульсии "масло-в-воде" не является липидно-пептидной наночастицей (NLPP). Предпочтительно, масляное ядро находится в жидкой фазе при 4°C. Необязательно, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, эмульсию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, эмульсия дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать эмульсию изотонической.

В определенных вариантах осуществления катионная эмульсия "масло-в-воде" дополнительно содержит поверхностно-активное вещество, такое как неионное поверхностно-активное вещество. Примеры неионных поверхностно-активных веществ включают, например, SPAN85 (триолеат сорбитана), Tween 80 (полисорбат 80; моноолеат полиоксиэтиленсорбитана) или их комбинацию. Катионная эмульсия "масло-в-воде" может содержать от приблизительно 0,01% до приблизительно 2,5% (об./об.) поверхностно-активного вещества. Например, катионная эмульсия "масло-в-воде" может содержать приблизительно 0,08% (об./об.) Tween 80 или, альтернативно, приблизительно 0,5% (об./об.) Tween 80 и приблизительно 0,5% (об./об.) SPAN85. Также можно использовать полиэтиленгликоль (PEG) или PEG-липид, такой как PEG₂₀₀₀PE, PEG₅₀₀₀PE, PEG₁₀₀₀DMG, PEG₂₀₀₀DMG, PEG₃₀₀₀DMG или их комбинация.

Композиция, содержащая молекулу РНК в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", может содержать от приблизительно 0,005% до приблизительно 1,25% (об./об.) поверхностно-активного вещества. Например, композиция, содержащая комплекс РНК-эмульсия, может содержать приблизительно 0,04% (об./об.) Tween 80 (полисорбата 80; моноолеата полиоксиэтиленсорбитана) или, альтернативно, приблизительно 0,25% (об./об.) Tween 80 и приблизительно 0,25% (об./об.) SPAN85 (триолеата сорбитана).

В определенных вариантах осуществления катионная эмульсия "масло-в-воде" дополнительно содержит фосфолипид. Примеры фосфолипида включают 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин (DOPE), 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DPyPE) или фосфатидилхолин яйца (PC яйца). Например, катионная эмульсия "масло-в-воде" может содержать от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл (предпочтительн от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл) DOPE или, альтернативно, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл (предпочтительно от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл) DPyPE или, альтернативно, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл (предпочтительно от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл) PC яйца.

Композиция, содержащая молекулу РНК в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", может содержать от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл (предпочтительно от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 5 мг/мл) DOPE или, альтернативно, от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл (предпочтительно от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 5 мг/мл) DPyPE или, альтернативно, от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл (предпочтительно от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 5 мг/мл) PC яйца.

В определенных вариантах осуществления катионная эмульсия "масло-в-воде" дополнительно содержит полимер или поверхностно-активное вещество в водной фазе эмульсии. Примеры полимеров включают полоксамеры, такие как Pluronic® F127 (блок-сополимер этиленоксид/пропиленоксид: H(OCH₂CH₂)_x(OCH₃CH(CH₃))_y(OCH₂CH₂)_zOH). Например, катионная эмульсия "масло-в-воде" может содержать от приблизительно 0,05% до приблизительно 20% (масс./об.) полимера или от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (масс./об.) полимера, например, 0,5% (масс./об.) или 1% (масс./об.) Pluronic® F127. Композиция, содержащая молекулу РНК в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", может содержать от приблизительно 0,025% до приблизительно 10% (об./об.) полимера или от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (об./об.) полимера, например, 0,25% (масс./об.) или 0,5% (масс./об.) Pluronic® F127.

Эмульсии могут содержать компоненты, которые могут усиливать образование частиц, улучшать образование комплексов между отрицательно заряженными молекулами и катионными частицами, способствовать правильной деформации комплексов/высвобождению отрицательно заряженных молекул (таких как молекула РНК), повышать стабильность отрицательно заряженной молекулы (например, для предотвращения деградации молекулы РНК) или предотвращать агрегацию частиц эмульсии.

В определенных вариантах осуществления масляное ядро может содержать масло, выбранное из следующих: касторовое масло, кокосовое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло энотеры, рыбий жир, масло жожоба, лярд, льняное масло, оливковое масло, арахисовое масло, сафлоровое масло, сезамовое масло, соевое масло, сквален, подсолнечное масло, масло пшеничных зародышей, минеральное масло или их комбинация. Предпочтительно, масло является соевым маслом, подсолнечным маслом, оливковым маслом, скваленом или их комбинацией. Катионная эмульсия "масло-в-воде" может содержать от приблизительно 0,2% до приблизительно 20% (об./об.) масла, предпочтительно от приблизительно 0,08% до приблизительно 5% масла, приблизительно 0,08% масла, от приблизительно от 4% до приблизительно 5% масла, приблизительно 4% масла, приблизительно 4,3% масла или приблизительно 5% масла. Композиция, содержащая молекулу РНК в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", может содержать от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (об./об.) масла, предпочтительно от приблизительно 2% до приблизительно 2,5% (об./об.) масла.

В определенных вариантах осуществления катионный липид выбран из одного из следующих: 1,2-диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропан (DOTAP), 3β-[Ν-(Ν’,Ν’-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерол (DC холестерол), диметилдиоктадециламмоний (DDA), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропан (DMTAP), дипальмитоил(C_16:0)триметиламмоний-пропан (DPTAP), дистеароилтриметиламмоний-пропан (DSTAP), липиды E0001-E0118 или E0119-E0180, как описано в таблице 6 (стр. 112-139) WO 2011/076807 (включенного в настоящее описание посредством ссылки), или их комбинации. Особенно предпочтительные катионные липиды включают DOTAP, DC холестерол и DDA.

В определенных вариантах осуществления катионный липид выбран из одного из следующих: 1,2-диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропан (DOTAP), 3β-[Ν-(Ν’,Ν’-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерол (DC холестерол), диметилдиоктадециламмоний (DDA), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропан (DMTAP), дипальмитоил(C_16:0)триметиламмоний-пропан (DPTAP), дистеароилтриметиламмоний-пропан (DSTAP), липиды E0001-E0118 или E0119-E0180, как описано в таблице 6 (стр. 112-139) WO 2011/076807 (включенного в настоящее описание посредством ссылки), N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний хлорид (DOTMA), N,N-диолеоил-N,N-диметиламмония хлорид (DODAC), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (DOEPC), 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропан (DODAP), 1,2-дилинолеилокси-3-диметиламинопропан (DLinDMA) или их комбинации. Особенно предпочтительные катионные липиды включают DOTAP, DC холестерол, DDA, DOTMA, DOEPC, DSTAP, DODAC, DODAP и DLinDMA.

В определенных вариантах осуществления катионная эмульсия "масло-в-воде" содержит от приблизительно 0,8 мг/мл до приблизительно 3 мг/мл, предпочтительно от приблизительно 0,8 мг/мл до приблизительно 1,6 мг/мл DOTAP.

Композиция, содержащая молекулу РНК в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", может содержать от приблизительно 0,4 мг/мл до приблизительно 1,5 мг/мл, предпочтительно от приблизительно 0,4 мг/мл до приблизительно 0,8 мг/мл DOTAP. Необязательно, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0 и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В определенных вариантах осуществления катионная эмульсия "масло-в-воде" содержит от приблизительно 0,62 мг/мл до приблизительно 4,92 мг/мл DC холестерола.

Композиция, содержащая молекулу РНК в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", может содержать от приблизительно 0,31 мг/мл до приблизительно 2,46 мг/мл DC холестерола. Необязательно, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В определенных вариантах осуществления катионная эмульсия "масло-в-воде" содержит от приблизительно 0,73 мг/мл до приблизительно 1,45 мг/мл DDA.

Композиция, содержащая молекулу РНК в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", может содержать от приблизительно 0,365 мг/мл до приблизительно 0,725 мг/мл DDA. Необязательно, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0; предпочтительно - от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В определенных вариантах осуществления катионная эмульсия "масло-в-воде" содержит от приблизительно 0,8 мг/мл до приблизительно 3 мг/мл, предпочтительно от приблизительно 0,8 мг/мл до приблизительно 1,6 мг/мл DOTMA.

Композиция, содержащая молекулу РНК в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", может содержать от приблизительно 0,4 мг/мл до приблизительно 1,5 мг/мл, предпочтительно от приблизительно 0,4 мг/мл до приблизительно 0,8 мг/мл DOTMA. Необязательно, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0; предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В определенных вариантах осуществления катионная эмульсия "масло-в-воде" содержит от приблизительно 0,8 мг/мл до приблизительно 3 мг/мл, предпочтительно от приблизительно 0,8 мг/мл до приблизительно 1,8 мг/мл DOEPC.

Композиция, содержащая молекулу РНК в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", может содержать от приблизительно 0,4 мг/мл до приблизительно 1,5 мг/мл, предпочтительно от приблизительно 0,4 мг/мл до приблизительно 0,9 мг/мл DOEPC. Необязательно, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0; предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В определенных вариантах осуществления катионная эмульсия "масло-в-воде" содержит от приблизительно 0,73 мг/мл до приблизительно 1,45 мг/мл DODAC.

Композиция, содержащая молекулу РНК в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", может содержать от приблизительно 0,365 мг/мл до приблизительно 0,725 мг/мл DODAC. Необязательно, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0; предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В одном примере изобретение относится к композиции, содержащей отрицательно заряженную молекулу в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где катионная эмульсия "масло-в-воде" содержит (a) приблизительно 0,5% (об./об.) масла и (b) катионный липид.

В одном примере изобретение относится к композиции, содержащей отрицательно заряженную молекулу в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где композиция содержит (a) приблизительно 0,25% (об./об.) масла и (b) катионный липид.

В другом примере изобретение относится к композиции, содержащей отрицательно заряженную молекулу в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где частица содержит (a) масляное ядро, (b) катионный липид и (c) фосфолипид. Предпочтительные фосфолипиды включают, например, DPyPE, DOPE и PC яйца. Предпочтительно, композиция (комплекс отрицательно заряженная молекула-эмульсия) содержит от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл (более предпочтительно от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 5 мг/мл) DOPE или, альтернативно, от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл (более предпочтительно от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 5 мг/мл) DPyPE или, альтернативно, от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл (более предпочтительно от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 5 мг/мл) PC яйца.

В другом примере изобретение относится к композиции, содержащей отрицательно заряженную молекулу в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где частица содержит (a) масляное ядро и (b) DOTAP, и где эмульсия "масло-в-воде" содержит от приблизительно 0,8 мг/мл до приблизительно 3,0 мг/мл DOTAP, предпочтительно от приблизительно 0,8 мг/мл до приблизительно 1,6 мг/мл DOTAP. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженная молекула представляет собой РНК, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0 и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В другом примере изобретение относится к композиции, содержащей отрицательно заряженную молекулу в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где частица содержит (a) масляное ядро и (b) DOTAP, и где композиция содержит от приблизительно 0,4 мг/мл до приблизительно 1,5 мг/мл DOTAP, например, 0,4 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,7 мг/мл, 0,8 мг/мл и т.д. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженная молекула представляет собой РНК, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0 предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В другом примере изобретение относится к композиции, содержащей отрицательно заряженную молекулу в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где частица содержит (a) масляное ядро и (b) DC холестерол, и где эмульсия "масло-в-воде" содержит от приблизительно 2,46 мг/мл до приблизительно 4,92 мг/мл DC холестерола. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженная молекула представляет собой РНК, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В другом примере изобретение относится к композиции, содержащей отрицательно заряженную молекулу в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где частица содержит (a) масляное ядро и (b) DC холестерол, и где композиция содержит от приблизительно 1,23 мг/мл до приблизительно 2,46 мг/мл DC холестерола, например, 1,23 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженная молекула представляет собой РНК, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В другом примере изобретение относится к композиции, содержащей отрицательно заряженную молекулу в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где частица содержит (a) масляное ядро и (b) DDA, и где эмульсия "масло-в-воде" содержит от приблизительно 0,73 мг/мл до приблизительно 1,45 мг/мл DDA. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженная молекула представляет собой РНК, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В другом примере изобретение относится к композиции, содержащей отрицательно заряженную молекулу в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где частица содержит (a) масляное ядро и (b) DDA, и где композиция содержит от приблизительно 0,365 мг/мл до приблизительно 0,725 мг/мл DDA, например, 0,725 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженная молекула представляет собой РНК, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В другом примере изобретение относится к композиции, содержащей отрицательно заряженную молекулу в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где частица содержит (a) масляное ядро и (b) DOTMA, и где композиция содержит от приблизительно 0,4 мг/мл до приблизительно 1,5 мг/мл, предпочтительно от приблизительно 0,4 мг/мл до приблизительно 0,8 мг/мл DOTMA. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженная молекула представляет собой РНК, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В другом примере изобретение относится к композиции, содержащей отрицательно заряженную молекулу в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где частица содержит (a) масляное ядро и (b) DOEPC, и где композиция содержит от приблизительно 0,4 мг/мл до приблизительно 1,5 мг/мл, предпочтительно от приблизительно 0,4 мг/мл до приблизительно 0,9 мг/мл DOEPC. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженная молекула представляет собой РНК, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

В другом примере изобретение относится к композиции, содержащей отрицательно заряженную молекулу в комплексе с частицей катионной эмульсии "масло-в-воде", где частица содержит (a) масляное ядро и (b) DODAC, и где композиция содержит от приблизительно 0,365 мг/мл до приблизительно 0,725 мг/мл DODAC. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженная молекула представляет собой РНК, средний диаметр частиц эмульсии составляет от приблизительно 80 нм до приблизительно 180 нм, и N/P эмульсии составляет по меньшей мере 4:1. Необязательно, композицию буферизуют (например, с использованием цитратного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и т.д.), и она имеет pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, предпочтительно от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,8, и содержит не более чем 30 мМ неорганическую соль (например, NaCl). Необязательно, композиция дополнительно содержит неионное модифицирующее тоничность средство, такое как сахар, сахарный спирт или их комбинация, в достаточном количестве для того, чтобы сделать композицию изотонической.

Примеры отрицательно заряженных молекул включают отрицательно заряженные антигены, содержащие пептиды, молекулы нуклеиновой кислоты (например, РНК или ДНК), кодирующие один или несколько антигенов, содержащих пептиды, отрицательно заряженные низкомолекулярные соединения и отрицательно заряженные иммунологические адъюванты. Отрицательно заряженные иммунологические адъюванты включают, например, иммунос