Клетки млекопитающих, экспрессирующие лиганд cd40l, и их применение

Клетки млекопитающих, экспрессирующие лиганд cd40l, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная патентная заявка относится к области культивирования B-клеток. В ней описана система культивирования для стимуляции и экспансии кроличьих и человеческих антителосекретирующих клеток, например, активированных B-клеток, плазмобластов и B-клеток, выделенных из организмов иммунизированных кроликов или излечившихся от заболевания людей, в присутствии кроличьих или человеческих фидерных клеток, экспрессирующих CD40L.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно, что человеческие B-клетки, плазмобласты и плазматические клетки различных биологических видов трудно поддаются культивированию in vitro. На практике это затруднение обычно преодолевают, создавая иммортализованные линии B-клеток путем слияния первичных B-клеток с партнером для получения гибридом или путем иммортализации. У кроликов также были получены клетки плазмоцитомы - партнер по слиянию для получения гибридом (Spieker-Polet, Н., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 9348-9352), но гибридомная методика неэффективна для клеток кроликов. Для длительного поддержания кроличьих B-клеток в культуре in vitro необходимы основные активирующие стимулы и факторы, усиливающие жизнеспособность. Для этого используют различные соединения, такие как интерлейкин (IL, от англ. interleukin)-2, IL-4, IL-10 и другие (см., например, Zubler, R., et al., Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-363 и J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183).

Физиологическая активация B-клеток происходит при встрече со специфическим антигеном и дополнительной активации, например, опосредованной через путь CD40/CD40L (обзор Neron, S., et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. 59 (2011) 25-40) и/или цитокинами и/или факторами роста природного происхождения, например, производимыми дендритными клетками или Т-клетками.

В системах in vitro взаимодействие CD40/CD40L можно смоделировать при совместном культивировании с клетками тимомы EL4-B5 или добавлении растворимых или иммобилизованных антител, направленных против CD40 или CD40L. Системы, в которых используется клеточная подложка, недостаточно эффективны, их применение описано только в сочетании с дополнительными стимулами, например, с применением различных фидерных смесей (таких как смесь, предложенная Zubler; IL-4, IL-10 и т.д.) (Zubler, R., см. выше) или культурального супернатанта тимоцитов (TSN, от англ. thymocyte supernatant).

Weitkamp, J-H., et al., (J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237) описали создание рекомбинантных человеческих моноклональных антител к ротавирусу, которые производят одиночные антиген-специфические B-клетки, отобранные с использованием флуоресцентных вирусоподобных частиц. Способ получения множества изолированных антител, распознающих множество антигенов, описан в US 2006/0051348. В WO 2008/144763 и WO 2008/045140 описаны антитела, направленные против IL-6, и их применение, а также способ культивирования для получения клональной популяции антиген-специфических B-клеток, соответственно. Способ культивирования для получения клональной популяции антиген-специфических B-клеток описан в US 2007/0269868. Masri, et al. (Mol. Immunol. 44 (2007) 2101-2106) описали клонирование и экспрессию в E. coli функционального Fab фрагмента, направленного против токсина сибирской язвы, полученного из одного лимфоцита человека. Способ получения библиотек иммуноглобулинов описан в WO 2007/031550.

В WO 2009/10515 описан способ создания гибридных клеток, экспрессирующих необходимые антитела. Высокоаффинные антитела, нейтрализующие энтеротоксин В стафилококка, описаны в WO 2008/085878. Amanna I.J., и Slifka М.К. предложили количественное определение редких популяций B-клеток памяти с применением двух независимых и дополняющих друг друга подходов (J. Immunol. Meth. 317 (2006) 175-185). В WO 2011/052545 описан способ получения популяции антиген-специфических B-клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описан новый способ быстрого, эффективного и воспроизводимого получения кроличьих (или человеческих) антител, в котором взяты за основу кроличьи (или человеческие) B-клетки, включающий по меньшей мере один этап культивирования.

В данном документе также описана фидерная смесь, которую можно применять в комбинации с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L кролика, для создания высокоэффективной системы, обеспечивающей активацию и культивирование кроличьих B-клеток.

В данном документе также описана фидерная смесь, которую можно применять в комбинации с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L человека, для создания высокоэффективной системы, обеспечивающей активацию и культивирование человеческих B-клеток.

Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования кроличьих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика.

Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования кроличьих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, в присутствии/совместно с IL-2 и IL-21. В одном воплощении клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L кролика, представляют собой клетки яичников китайского хомячка (CHO, от англ. Chinese hamster ovary) или клетки почки новорожденного хомячка (BHK, от англ. baby hamster kidney).

Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования человеческих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека.

Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования человеческих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, в присутствии/совместно с IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.

В одном воплощении клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L человека, представляют собой клетки BHK или клетки CHO.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.

В одном воплощении все интерлейкины, используемые при совместном культивировании, представляют собой человеческие интерлейкины.

Один аспект данного описания представляет собой способ получения кроличьих антител, включающий этап культивирования антителосекретирующих кроличьих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, и выделение антитела из культуральной надосадочной жидкости с получением кроличьего антитела.

В одном воплощении клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L кролика, представляют собой клетки CHO или клетки BHK.

Один аспект данного описания представляет собой способ получения кроличьего антитела, включающий этап культивирования одной или нескольких антителосекретирующих кроличьих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, в присутствии/совместно с IL-2 и IL-21 и выделение антитела из культуральной надосадочной жидкости с получением кроличьего антитела.

В одном воплощении клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L кролика, представляют собой клетки CHO или клетки BHK.

В одном воплощении в начале культивирования добавляют IL-2 и IL-21.

В одном воплощении IL-2 и IL-21 добавляют исключительно в начале культивирования.

В одном воплощении кроличьи B-клетки представляют собой наивные или незрелые кроличьи B-клетки.

В одном воплощении B-клетки представляют собой lgG-положительные B-клетки (lgG⁺). lgG-положительные B-клетки имеют на своей поверхности маркер IgG, который можно детектировать и присоединять к нему метку.

Один аспект данного описания представляет собой способ получения человеческих антител, включающий этап культивирования антителосекретирующих человеческих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, и выделение антитела из культуральной надосадочной жидкости, с получением человеческого антитела.

В одном воплощении клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L человека, представляют собой клетки BHK или клетки CHO.

Один аспект данного описания представляет собой способ получения человеческого антитела, включающий этап культивирования антителосекретирующих человеческих B-клеток, и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, в присутствии/совместно с IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6 и выделение антитела из культуральной надосадочной жидкости с получением человеческого антитела.

В одном воплощении культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.

В одном воплощении культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.

В одном воплощении все интерлейкины, используемые при культивировании, представляют собой человеческие интерлейкины.

В одном воплощении клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L человека, представляют собой клетки BHK или клетки CHO.

В одном воплощении интерлейкины добавляют в начале культивирования.

В одном воплощении интерлейкины добавляют исключительно в начале культивирования.

В одном воплощении человеческие B-клетки представляют собой зрелые человеческие B-клетки.

В одном воплощении B-клетки представляют собой lgG-положительные B-клетки (lgG⁺). lgG-положительные B-клетки имеют на своей поверхности маркер IgG, который можно детектировать и присоединять к нему метку.

Один аспект данного описания представляет собой набор, содержащий клетки CHO, экспрессирующие CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21.

Один аспект данного описания представляет собой набор, содержащий клетки BHK, экспрессирующие CD40L человека, а также IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.

В одном воплощении набор содержит IL-2 и IL-21.

В одном воплощении набор содержит IL-2 и IL-21 и IL-6.

В одном воплощении все интерлейкины представляют собой человеческие интерлейкины.

Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования B-клеток, включающий совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии IL-2 или IL-21.

Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования B-клеток, включающий совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии IL-2 и IL-21.

Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования кроличьих B-клеток, включающий совместное культивирование кроличьих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, в присутствии IL-2 и IL-21.

В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO или клетки BHK.

Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования B-клеток, включающий совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.

Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования человеческих B-клеток, включающий совместное культивирование человеческих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, в присутствии IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.

В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки BHK или клетки CHO.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.

В одном воплощении все интерлейкины, применяемые при совместном культивировании, представляют собой человеческие интерлейкины.

Один аспект данного описания представляет собой способ культивирования B-клеток, секретирующих ингибирующие T-клетки соединения, включающий совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L.

Один аспект данного описания представляет собой способ культивирования антителосекретирующих B-клеток, включающий в следующем порядке:

i) первое совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии стимулятора митоза, и

ii) последующее второе совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в присутствии стимулятора продукции антитела.

В одном воплощении первое и второе совместное культивирование осуществляют в том же сосуде для культивирования.

В одном воплощении способ культивирования антителосекретирующих B-клеток включает совместное культивирование B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, в котором вначале в среду для культивирования добавляют стимулятор митоза, а затем в среду для культивирования добавляют стимулятор продукции антитела.

В одном воплощении стимулятор продукции антитела добавляют по меньшей мере через один час после добавления стимулятора митоза. В одном воплощении стимулятор продукции антитела добавляют через один-три дня после добавления в среду для культивирования стимулятора митоза.

В одном воплощении стимулятор митоза выбран из группы, включающей CD40- и взаимодействующие с CD40L соединения, ICOS- (от англ. inducible T-cell costimulator, индуцибельный ко-стимулятор T-клеток) и взаимодействующие с ICOS-L (от англ. ICOS ligand, лиганд ICOS) соединения, APRIL (от англ. а proliferation-inducing ligand, индуцирующий пролиферацию лиганд), BAFF (B-cell activating factor, активирующий B-клетки фактор), CR2 (от англ. complement receptor type 2, рецептор комплемента 2 типа), CXCL (от англ. chemokine (СХС motif) ligand, хемокиновый лиганд с мотивом CXC) 9, CXCL12 (SDF-1 (от англ. stromal cell-derived factor-1, фактор стромальных клеток 1 типа), CXCL13, CXCL16, Flt-3L (от англ. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand, лиганд Fms-подобной тирозинкиназы), интерлейкин-1 (α/β), интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-7, интерлейкин-10, интерлейкин-14, интерлейкин-21, SAP (от англ. signaling lymphocyte activation molecule [SLAM] associated protein, белок, ассоциированный с сигнальной молекулой активации лимфоцитов), частицы золотистого стафилококка штамма Cowan 1 (SAC, от англ. Staphylococcus Aureus Cowan 1; убитые нагреванием, фиксированные формалином), лиганды Toll-подобных рецепторов (TLR, от англ. Toll-like receptors), такие как липополисахарид (LPS, от англ. lipopolysaccharide), различные олигодезоксинуклеотиды на основе CpG (от англ. cytosine phosphate-guanine, цитозинфосфат-гуанин) или резиквимод (R-848), TSLP (от англ. thymic stromal lymphopoietin, лимфопоэтин из стромы тимуса), фактор некроза опухоли (TNF, от англ. tumor necrosis factor) альфа, интерфероны I типа (например, IFN (от англ. interferon) α/β) и интерфероны II типа (например, IFNγ). Активацию B-клеток можно также вызывать при помощи антител, направленных против IgG, CD20 и/или CD27 антител.

В одном воплощении стимулятор продукции антител выбран из группы, включающей CD40- и взаимодействующие с CD40L соединения, ICOS- и взаимодействующие с ICOS-L соединения, APRIL, BAFF, CR2, CXCL9, CXCL12 (SDF-1), CXCL13, CXCL16, Flt-3L, интерлейкин-1 (α/β), интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-6, интерлейкин-9, интерлейкин-10, интерлейкин-13, интерлейкин-21, интерлейкин-33, SAP (от англ. signaling lymphocyte activation molecule [SLAM] associated protein, белок, ассоциированный с сигнальной молекулой активации лимфоцитов), частицы золотистого стафилококка штамма Cowan 1 (SAC, от англ. Staphylococcus Aureus Cowan 1; убитые нагреванием, фиксированные формалином), лиганды TLR, такие как LPS, различные олигодезоксинуклеотиды на основе CpG или резиквимод (R-848), TSLP, фактор некроза опухоли (TNF) альфа, интерфероны I типа (например, IFN α/β), интерфероны II типа (например, IFNγ). Кроме того, стимуляцию B-клеток можно осуществлять при помощи антител, направленных против IgG, CD20 и/или CD27 антител.

В одном воплощении стимулятор митоза добавляют в начале первого совместного культивирования.

В одном воплощении стимулятор митоза добавляют через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней после начала первого совместного культивирования.

В одном воплощении стимулятор продукции антител добавляют через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней после добавления стимулятора митоза.

В одном воплощении каждое совместное культивирование осуществляют в течение 5-14 дней.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в течение общего периода от 5 до 21 дня. В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в течение общего периода от 6 до 14 дней.

В одном воплощении стимулятор митоза удаляют до начала второго совместного культивирования. В одном воплощении удаление осуществляют путем замены надосадочной культуральной жидкости и/или отмывания клеток нейтральной средой.

Один аспект данного описания представляет собой способ получения антитела, которое специфически связывается с антигеном, включающий следующие этапы:

a) совместное культивирование пулированных или одиночных антителосекретирующих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L,

b) выделение нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи, и выделение нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, которое специфически связывается с антигеном,

c) культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, выделенную на этапе (b), или ее вариант, кодирующий гуманизированную версию вариабельного домена легкой и/или тяжелой цепи, в составе одной или нескольких экспрессионных кассет,

d) выделение антитела из клетки или культуральной среды с получением антитела, которое специфически связывается с антигеном.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии стимулятора митоза и/или стимулятора продукции антитела.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

a) получение популяции антителосекретирующих (зрелых) B-клеток (полученных из крови экспериментального животного или человека),

b) окрашивание клеток, входящих в популяцию B-клеток, по меньшей мере одним флуоресцентным красителем (в одном воплощении с использованием от одного до трех или от двух до трех флуоресцентных красителей),

c) осаждение одиночных клеток окрашенной популяции B-клеток или пула клеток из окрашенной популяции B-клеток в индивидуальные контейнеры (в одном воплощении контейнер представляет собой лунку многолуночного планшета),

d) культивирование одиночных B-клеток в присутствии клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, и возможно IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6,

e) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культуральную среду отдельными B-клетками,

f) определение аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител и получение таким образом при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,

g) встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,

h) введение нуклеиновой кислоты в клетку,

i) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или из культуральной надосадочной жидкости и таким образом, получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

a) получение популяции антителосекретирующих (зрелых) кроличьих B-клеток,

b) окрашивание клеток, входящих в популяцию кроличьих B-клеток, по меньшей мере одним флуоресцентным красителем (в одном воплощении с использованием от одного до трех или от двух до трех флуоресцентных красителей),

c) осаждение одиночных клеток окрашенной популяции кроличьих B-клеток или пула клеток из окрашенной популяции кроличьих B-клеток в индивидуальные контейнеры (в одном воплощении контейнер представляет собой лунку многолуночного планшета),

d) культивирование осажденных кроличьих B-клеток в присутствии клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, и IL-2 и IL-21,

e) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культуральную среду кроличьими B-клетками,

f) определение аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител и получение таким образом при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,

g) встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,

h) введение нуклеиновой кислоты в клетку,

i) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или из культуральной надосадочной жидкости и таким образом получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

a) получение популяции антителосекретирующих (зрелых) человеческих B-клеток,

b) окрашивание клеток, входящих в популяцию человеческих B-клеток, по меньшей мере одним флуоресцентным красителем (в одном воплощении с использованием от одного до трех или от двух до трех флуоресцентных красителей),

c) осаждение одиночных клеток окрашенной популяции человеческих B-клеток или пула клеток из окрашенной популяции человеческих B-клеток в индивидуальные контейнеры (в одном воплощении контейнер представляет собой лунку многолуночного планшета),

d) культивирование осажденных человеческих B-клеток в присутствии клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, а также IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6,

е) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культуральную среду человеческими B-клетками,

f) определение аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования нуклеотидной последовательности и таким образом получение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклинального антитела,

g) встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,

h) введение нуклеиновой кислоты в клетку,

i) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или из культуральной надосадочной жидкости и таким образом получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.

В одном воплощении культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.

В одном воплощении культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.

В одном воплощении все интерлейкины, используемые при совместном культивировании, являются человеческими интерлейкинами.

В одном воплощении пул клеток включает приблизительно от 10 B-клеток приблизительно до 1000000 B-клеток. В одном воплощении пул содержит приблизительно от 500 B-клеток приблизительно до 100000 B-клеток. В одном воплощении пул содержит приблизительно 500 B-клеток.

Один аспект данного описания представляет собой способ получения антитела, которые специфически связывается с антигеном, включающий следующие этапы:

a) совместное культивирование пула антителосекретирующих кроличьих B-клеток или одиночных антителосекретирующих кроличьих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также с IL-2 и IL-21,

b) выделение нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи и выделение нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, которое специфически связывается с антигеном,

c) культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, выделенную на этапе b), или ее варианта, кодирующего гуманизированную версию вариабельного домена легкой и/или тяжелой цепи, в составе одной или нескольких экспрессионных кассет,

d) выделение антитела из клетки или культуральной среды и таким образом получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии стимулятора митоза и/или стимулятора продукции антитела.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

a) получение популяции антителосекретирующих (зрелых) кроличьих B-клеток,

b) окрашивание клеток, входящих в популяцию B-клеток, по меньшей мере одним флуоресцентным красителем (в одном воплощении с использованием от одного до трех или от двух до трех флуоресцентных красителей),

c) осаждение одиночных клеток окрашенной популяции B-клеток или пула клеток из окрашенной популяции B-клеток в индивидуальные контейнеры (в одном воплощении контейнер представляет собой лунку многолуночного планшета),

d) культивирование отдельных B-клеток в присутствии клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L, и возможно IL-2 и IL-21,

e) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культуральную среду отдельными B-клетками,

f) определение аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител и получение таким образом при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,

g) встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, или ее варианта, кодирующего гуманизированную версию вариабельного домена легкой и/или тяжелой цепи, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,

h) введение нуклеиновой кислоты в клетку,

i) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или из культуральной надосадочной жидкости и таким образом получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.

В одном воплощении способ включает следующие этапы:

a) получение популяции антителосекретирующих (зрелых) кроличьих B-клеток,

b) окрашивание клеток, входящих в популяцию кроличьих B-клеток, по меньшей мере одним флуоресцентным красителем (в одном воплощении с использованием от одного до трех или от двух до трех флуоресцентных красителей),

c) осаждение одиночных клеток окрашенной популяции кроличьих B-клеток или пула клеток из окрашенной популяции кроличьих B-клеток в индивидуальные контейнеры (в одном воплощении контейнер представляет собой лунку многолуночного планшета),

d) культивирование осажденных кроличьих B-клеток в присутствии клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21,

e) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культуральную среду кроличьими B-клетками,

f) определение аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител и получение таким образом при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,

g) встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,

h) введение нуклеиновой кислоты в клетку,

i) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или из культуральной надосадочной жидкости и таким образом получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.

В одном воплощении пул клеток содержит приблизительно от 10 B-клеток приблизительно до 1000000 B-клеток. В одном воплощении пул содержит приблизительно от 500 B-клеток приблизительно до 100000 B-клеток. В одном воплощении пул содержит приблизительно 500 B-клеток.

Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, для совместного культивирования антителосекретирующих кроличьих B-клеток.

В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO.

В одном воплощении CD40L кролика имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01.

Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, для совместного культивирования антителосекретирующих человеческих B-клеток.

В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки BHK.

В одном воплощении CD40L человека имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02.

Один аспект данного описания представляет собой применение SAC для совместного культивирования антителосекретирующих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L.

Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21 для совместного культивирования кроличьих B-клеток.

Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, а также IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6 для совместного культивирования человеческих B-клеток.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.

В одном воплощении все интерлейкины, используемые для совместного культивирования, представляют собой человеческие интерлейкины.

Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования кроличьих B-клеток, включающий этап культивирования одиночных кроличьих B-клеток или пула кроличьих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L кролика, в присутствии IL-2 и IL-21.

В одном воплощении всех аспектов данного описания IL-2 представляет собой либо человеческий IL-2, либо мышиный IL-2, a IL-21 представляет собой либо человеческий IL-21, либо мышиный IL-21.

Один аспект данного описания представляет собой способ совместного культивирования человеческих B-клеток, включающий этап культивирования одиночных человеческих B-клеток или пула человеческих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L человека, в присутствии IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.

В одном воплощении все интерлейкины, используемые при совместном культивировании, представляют собой человеческие интерлейкины.

Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21 при совместном культивировании кроличьих B-клеток для улучшения роста клеток.

Один аспект данного описания представляет собой применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, а также IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6 при совместном культивировании человеческих B-клеток для улучшения роста клеток.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.

В одном воплощении все интерлейкины, используемые при совместном культивировании, представляют собой человеческие интерлейкины.

Один аспект данного описания представляет собой способ улучшения роста кроличьих B-клеток, включающий этап культивирования одиночных кроличьих B-клеток или пула кроличьих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L кролика, в присутствии IL-2 и IL-21.

В одном воплощении всех аспектов данного описания IL-2 представляет собой либо человеческий IL-2, либо мышиный IL-2, a IL-21 представляет собой либо человеческий IL-21, либо мышиный IL-21.

Один аспект данного описания представляет собой способ улучшения роста человеческих B-клеток, включающий этап культивирования одиночных человеческих В- клеток или пула человеческих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L человека, в присутствии IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21.

В одном воплощении совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2 и IL-21 и IL-6.

В одном воплощении все интерлейкины, используемые при совместном культивировании, представляют собой человеческие интерлейкины.

Подробное описание изобретения

Объектом данного описания является способный найти широкое применение способ быстрого, эффективного и воспроизводимого получения кроличьих (или человеческих) антител, в котором за основу взяты кроличьи (или человеческие) B-клетки, включающий по меньшей мере один этап культивирования.

Обнаружили, что добавление клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21 может улучшить пролиферативные свойства кроличьих B-клеток, т.е. кроличьи B-клетки, в виде одиночных или пулированных клеток, могут расти и достигать высокой плотности клеток быстрее, чем в отсутствие клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, а также IL-2 и IL-21. Таким образом, за короткое время можно добиться высокой плотности кроличьих B-клеток и, соответственно, высоких концентраций IgG в культуральной надосадочной жидкости.

Одним аспектом данного описания являются клетки ОНО, экспрессирующие CD40L кролика.

Одним аспектом данного описания является применение клеток CHO, экспрессирующих CD40L кролика, совместно с IL-2 и IL-21 для совместного культивирования кроличьих B-клеток.

Одним аспектом данного описания является искусственная фидерная смесь, которую можно применять в комбинации с клетками CHO, экспрессирующими CD40L кролика, или другими фидерными клетками для создания высокоэффективной системы, обеспечивающей активацию и культивирование B-клеток.

Одним аспектом данного описания являются клетки BHK, экспрессирующие CD40L человека.

Одним аспектом данного описания является применение клеток BHK, экспрессирующих CD40L человека, вместе с IL-2 и/или IL-21 для совместного культивирования человеческих B-клеток.

Одним аспектом данного описания является искусственная фидерная смесь, которую можно применять в комбинации с клетками BHK, экспрессирующими CD40L человека, или другими фидерными клетками для создания высокоэффективной системы, обеспечивающей активацию и культивирование B-клеток.

Способы и методы, известные специалистам в данной области техники, которые могут найти применение в осуществлении данного изобретения, описаны, например, Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Определения

"Акцепторные каркасные участки человеческого происхождения" в данном описании представляют собой каркасные участки, содержащие аминокислотную последовательность каркасного участка вариабельного домена легкой цепи (VL, от англ. variable light) или каркасные участки вариабельного домена тяжелой цепи (VH, от англ. variable heavy), полученные на основе каркасных участков иммуноглобулина человека или консенсусных каркасных участков человеческого происхождения, определение которым приведено ниже. Акцепторные каркасные последовательности, "полученные на основе" каркасной последовательности иммуноглобулина человека или консенсусных каркасных участков человека, могут иметь ту же аминокислотную последовательность или иметь аминокислотные замены. В некоторых воплощениях число аминокислотных замен равно 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В некоторых воплощениях акцепторная последовательность каркасных участков VL идентична последовательности каркасных участков VL иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасных участков человеческого происхождения.

Антитело, "подвергнутое аффинному созреванию", обозначает антитело, имеющее одну или несколько модификаций в одном или нескольких гипервариабельных участках (HVR, от англ. hypervariable regions) по сравнению с материнским антителом, не имеющим таких модификаций, указанные модификации приводят к повышению аффинности антитела к антигену.

Термин "аминокислота" в данном описании обозначает группу карбокси-альфа-аминокислот, которые непосредственно или в форме предшественника могут кодироваться нуклеиновой кислотой. Индивидуальные аминокислоты кодируются нуклеиновыми кислотами, содержащими три нуклеотида, так называемыми кодонами или триплетами оснований. Каждая аминокислота кодируется по меньшей мере одним кодоном. Кодирование одной и той же аминокислоты разными кодонами известно как "вырожденность генетического кода". Термин "аминокислота" в данном описании обозначает карбокси-альфа-аминокислоты естественного происхождения и включает аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: A), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, C), глутамин (gln, Q), глутаминовую кислоту (glu, E), глицин (gly, G), гистидин (his, H), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, M), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серии (ser, S), треонин (thr, T), триптофа