Способ получения рекомбинантного полипептида

Способ получения рекомбинантного полипептида

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ДАННОЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Данное изобретение относится к способу получения рекомбинантного полипептида и, более конкретно, к способу получения рекомбинантного полипептида, эффективно использующему клетки животных, в которых была уменьшена экспрессия ингибитора α ядерного фактора κB (NfkBia).

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] При получении белков, применимых в качестве лекарственных средств, с использованием технологии рекомбинации генов, применение клеток животных делает возможными усложненные посттрансляционную модификацию и фолдинг (укладку), которые не могут выполнять прокариотические клетки. Таким образом, клетки животных часто используются в качестве клеток-хозяев для получения рекомбинантных белков.

[0003] В недавние годы было разработано большое количество биофармацевтических лекарственных средств, таких как антитела и физиологически активные белки. Способы, которые позволяют эффективно продуцировать рекомбинантные белки с использованием животных клеток, приводят к уменьшению стоимости биофармацевтических лекарственных средств и обещают их стабильную поставку для пациентов.

[0004] При этих обстоятельствах желаемым является способ получения белков с более высокой эффективностью получения.

[0005] NfkBia (IKBα, ингибитор α ядерного фактора κB),

который является аббревиатурой ингибитора альфа ядерного фактора энхансера гена полипептида легкой цепи каппа в В-клетках, участвует в активации NF-каппа B, фактора транскрипции, связанного с внутриклеточной передачей сигнала. NfkBia является одним из факторов, которые инактивируют NF-kappa B. Эта индуцируемая ядерная экспрессия новосинтезированного NfkBia отрицательно регулирует связывание ДНК и транскрипционные активности NF-kappa B (Непатентный документ 1). Далее, экспрессия некоторых генов, которые ингибируют пролиферацию клеток, таких как NfkBia, подавляется почти во всех опухолевых клетках мыши или человека. (Патентный Документ 2). NF-kappa B обычно существует в состоянии, в котором он связан с инактиватором, таким как NfkBia. При наличии различных стимуляторов NF-kappa B высвобождается из такого инактиватора, активируется и транслоцируется в ядро и связывается со специфической ДНК-последовательностью в районах промотор/энхансер различных генов-мишеней цитокина, факторов роста, адгезионных молекул, регуляторов гибели клеток и т.п. (5’-GGGACTTTCC-3’; эту последовательность ДНК называют NFκB-связывающей последовательностью, kB-мотивом, реагирующим на NFkB элементом или т.п. (SEQ ID NO: 35)), и таким образом NF-kappa B участвует в модуляции транскрипционных активностей (Непатентный Документ 3).

[0006] Между тем, совершенно не было известным, каким образом NfkBia связан с продуцирующей рекомбинантный белок способностью, а также не было известным поведение NfkBia в культивируемых клетках животных.

СПИСОК ЦИТИРУЕМЫХ МАТЕРИАЛОВ

НЕПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА

[0007] Непатентный Документ 1: Inducible nuclear expression of newly synthesized I kappa B alpha negatively regulates DNA-binding and transcriptional activities of NF-kappa B, Mol. Cell. Biol., May 1995, 2689-2696, Vol. 15, No. 5.

Непатентный Документ 2: From mice to humans: Identification of commonly deregulated genes in mammary cancer via comparative SAGE studies, Hu Y., Sun H., Drake J., Kittrell F., Abba M. C., Deng L., Gaddis S., Sahin A., Baggerly K., Medina D. and Aldaz C. M., Cancer Research 2004 64:21 (7748-7755).

Непатентный Документ 3: “New insights into the Role of Nuclear Factor-kappa B in Cell Growth Regulation”, American Journal of Pathology, 2001, Vol. 159, No. 2: 387-397.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

[0008] Целью данного изобретения является обеспечение способа, способного продуцировать природный или рекомбинантный белок при высоком уровне.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ

[0009] Авторы данного изобретения использовали культивируемые клеточные штаммы (штаммы клеток CHO), имеющие высокую способность продуцирования рекомбинантного антитела, для проведения исследований на генах, экспрессируемых явно в этих клеточных штаммах, в тщательных попытках достижения вышеуказанной цели. В результате, авторы этого изобретения идентифицировали один тип мРНК, не кодирующий РНК, которая узнается с использованием специфической последовательности мыши, в качестве зонда. Этот транскрипт соответствовал комплементарной цепи нетранслируемого района мРНК NfkBia. Далее, авторы данного изобретения обнаружили, что экспрессия в культивируемых рекомбинантных клетках молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из частичной последовательности этого транскрипта, явно увеличивает способность продуцирования этого рекомбинантного полипептида культивируемых клеток. Авторы данного изобретения обнаружили также, что экспрессия NfkBia подавлялась в высоко продуцирующих антитело клетках, в которых увеличивалась экспрессия этой не кодирующей РНК. Кроме того, авторы данного изобретения обнаружили, что эти культивируемые клетки, имеющие высокую способность продуцирования рекомбинантного антитела, подавляли экспрессию NfkBia в этих клетках. На основе этих открытий, авторы данного изобретения ожидали, что количество продукции желаемого полипептида может быть увеличено индукцией высокой экспрессии транскрипта, который регулирует экспрессию NfkBia в культивируемых клетках. Эти открытия привели к завершению данного изобретения.

[0010] Такие РНК или ДНК или их последовательность, которая имеют функцию увеличения способности продуцирования такого белка, как рекомбинантное антитело, увеличением их экспрессии в культивируемых клетках, совместно называются здесь как APES (Усиливающая Продуцирование Антитела Последовательность) (также называются PPES (Усиливающая Продуцирование Полипептида Последовательность) в некоторых случаях).

[0011] Авторы данного изобретения предположили, что APES (или PPES) могли бы регулировать экспрессию NfkBia в культивируемых клетках, усиливая посредством этого активность NF-kappa B и, следовательно, увеличивая продуцирующую рекомбинантный полипептид способность. Предполагается, что NF-kappa B, имеющий усиленную активность, мог бы транслоцироваться в ядро, увеличивать экспрессию генов, связанных с иммунитетом, воспалением и анти-апоптозом (например, Bcl-2, Bcl-xL, IAP (Ингибиторов Белков Апоптоза)) и способствовать росту этих клеток, поддержанию коэффициента выживаемости этих клеток и т.п.

[0012] Кроме того, множество NF-kappa B-связывающих последовательностей существуют в районах промотор/энхансер обычных плазмид для экспрессии гена, кодирующего рекомбинантный белок или пептид, такой как антитело. Таким образом, предполагается также, что NF-kappa B, который был транслоцирован в ядро, мог бы усиливать промоторную активность экспрессионных плазмид и способствовать более высокому продуцированию антител. Например, в случае промотора MCMV, такие NF-kappa B-связывающие последовательности существуют в восьми сайтах в полученной из цитомегаловируса мыши последовательности (DD434486) и в трех сайтах в полученной из цитомегаловируса человека последовательности (DI097553).

[0013] Данное изобретение суммируется следующим образом:

(1) Способ получения полипептида, предусматривающий культивирование клетки, которая экспрессирует APES и в которую была введена ДНК, кодирующая желаемый полипептид, с получением посредством этого желаемого полипептида.

(1-1) Способ по (1), где эта клетка является сильно экспрессирующей APES клеткой.

(2) Способ по (1), где эта APES является молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая может связываться с ДНК или мРНК гена NfkBia, полученной из человека, мыши, крысы или хомячка спариванием оснований, и посредством этого может подавлять экспрессию гена NfkBia.

(3) Способ по (2), где эта APES является малой РНК с длиной самое большее 30 нуклеотидов, содержащей последовательность с длиной 19-25 нуклеотидов, которые могут связываться с частью мРНК NfkBia спариванием оснований.

(4-1) Способ по (2), где эта APES является некодирующей РНК мРНК-типа с длиной самое большее 561 нуклеотидов, содержащей последовательность с длиной 19-25 нуклеотидов, которая может связываться с частью мРНК NfkBia спариванием оснований.

(4) Способ по (2), где эта APES является некодирующей РНК мРНК-типа с длиной самое большее 500 нуклеотидов, содержащей последовательность с длиной 19-25 нуклеотидов, которая может связываться с частью мРНК NfkBia спариванием оснований.

(5-1) Способ по (2), где эта APES является некодирующей РНК мРНК-типа с длиной 561-1579 нуклеотидов, содержащей последовательность с длиной 19-25 нуклеотидов, которая может связываться с частью мРНК NfkBia спариванием оснований.

(5) Способ по (2), где эта APES является некодирующей РНК мРНК-типа с длиной 500-1000 нуклеотидов, содержащей последовательность с длиной 19-25 нуклеотидов, которая может связываться с частью мРНК NfkBia спариванием оснований.

(6) Способ по любому из (3)-(5), где эта непрерывная последовательность с длиной 19-25 нуклеотидов является любой частичной последовательностью в последовательности нуклеотидов, представленной SEQ ID NO: 2.

(7-1) Способ по (6), где эта APES выбрана из молекул нуклеиновых кислот, каждая из которых содержит любую из следующих нуклеотидных последовательностей:

(a) ДНК, состоящей из нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO: 1-16 и 29;

(b) ДНК, которая содержит вышеупомянутую последовательность (а) и является частичной последовательностью 3’-нетранслируемого района гена NfkBia;

(c) ДНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, идентичной вышеупомянутым (a) или (b), за исключением одного или нескольких нуклеотидов;

(d) РНК, которая является транскриптом вышеупомянутых (a), (b) или (c); и

(e) ДНК или РНК, состоящей из последовательности, которая может связываться с вышеупомянутой последовательностью (a) спариванием оснований.

(7) Способ по (6), где эта APES выбрана из молекул нуклеиновых кислот, каждая из которых содержит любую из следующих нуклеотидных последовательностей:

(a) ДНК, состоящей из нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO: 4-16;

(b) РНК, которая является вышеупомянутым транскриптом;

(c) ДНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, идентичной вышеупомянутой последовательности (а), за исключением одного нуклеотида;

(d) РНК, которая является вышеупомянутым транскриптом (c); и

(e) ДНК или РНК, состоящих из последовательности, которая может связываться с вышеупомянутой последовательностью (a) спариванием оснований.

(8) Способ по (1), где экзогенная ДНК, кодирующая желаемый полипептид, была введена в эту клетку и APES была искусственно введена в эту клетку.

(9) Способ по (8), где клетка, в которую была искусственно введена APES, является клеткой, трансфицированной этой APES.

(10) Способ по (8), где клетка, в которую была введена APES, является клеткой, в которой была активирована транскрипция эндогенной APES.

(11) Способ по (8), где ДНК, кодирующую транспортер таурина, была дополнительно введена в эту клетку.

(12) Способ по (8), где ДНК, кодирующую декарбоксилазу цистеинсульфиновой кислоты, была дополнительно введена в эту клетку.

(13) Способ по (8), где ДНК, кодирующую аланинтрансферазу, была дополнительно введена в эту клетку.

(14) Способ по (1), где этот полипептид является антителом.

(15) Способ по (8), где эта клетка является клеткой яичника Китайского хомячка.

(16) Способ получения фармацевтического препарата, содержащего полипептид, полученный по любому из вышеупомянутых способов.

(17) Молекула нуклеиновой кислоты (APES или PPES), которая содержит любую из следующих нуклеотидных последовательностей и имеет активность APES, при условии, что исключена молекула нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1:

(a) ДНК, состоящую из нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO: 2-16 и 29;

(b) ДНК, которая содержит последовательность (а) и является частичной последовательностью 3’-нетранслируемого района гена NfkBia;

(c) ДНК, состоящую из нуклеотидной последовательности, идентичной последовательности любой из SEQ ID NO: 1-16 и 29 или последовательности (b), за исключением одного или нескольких нуклеотидов;

(d) РНК, которая является вышеупомянутым транскриптом (a), (b) или (c); или

(e) ДНК или РНК, состоящую из последовательности, которая может связываться с вышеупомянутой последовательностью (a) спариванием оснований.

(18) Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по вышеупомянутому (17).

(19) Клетка, в которую были искусственно введены молекула нуклеиновой кислоты по вышеупомянутому (17) или вектор по вышеупомянутому (18).

ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0014] Данное изобретение делает возможным эффективное получение рекомбинантных белков.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0015] Фигура 1 показывает последовательность идентифицированного транскрипта AI462015 и его местоположение на геноме мыши.

Фигура 2 показывает интенсивность экспрессии транскрипта AI462015 на 3-й день субкультуры антитело-продуцирующей клетки, полученной экспрессией Mab1 (анти-IL-6 рецептор-антитела) при высоком уровне в клетке CHO-DG44.

Фигура 3 показывает интенсивность экспрессии транскрипта AI462015 на 3-й день субкультуры антитело-продуцирующей клетки, полученной экспрессией Mab2 (антиглипикан 3-антитела) при высоком уровне в клетке CHO-DXB11s.

Фигура 4 показывает интенсивность экспрессии транскрипта AI462015 на 3-й день в культуре с подпиткой в 1-литровом сосуде Mab2 (антиглипикан 3-антитела)-продуцирующих клеток.

Фигура 5 показывает интенсивность экспрессии транскрипта AI462015 на 13-й день в последней стадии культуры с подпиткой в 1-литровом сосуде Mab2-продуцирующих клеток.

Фигура 6 показывает интенсивность экспрессии транскрипта AI462015 на 3-й день в культуре с подпиткой в 1-литровом сосуде клеток, которые имели низкий потенциал продуцирования Mab1 (анти-IL-6-рецептор-антитела).

Фигура 7 показывает экспрессионную плазмиду частичной последовательности 434 п.н. транскрипта AI462015 (437 п.н.).

Фигура 8 показывает экспрессионную плазмиду частичной последовательности 165 п.н. транскрипта AI462015 (437 п.н.).

Фигура 9 показывает плазмиду, в которой в качестве контроля экспрессировался только ген устойчивости к гигромицину.

Фигура 10 показывает, что количество продуцирования Mab1 увеличивается частичными последовательностями транскрипта (437 п.н.).

Фигура 11 показывает сильную экспрессию транскрипта AI462015 и супрессированную экспрессию NfkBia в высокопродуцирующих антитело клетках.

Фигура 12 показывает набор зондов, используемый для количественного измерения экспрессии NfkBia.

Фигура 13 показывает результат количественного измерения супрессированной экспрессии NfkBia в высокопродуцирующих антитело клетках.

Фигура 14 показывает восемь NfkB-связывающих сайтов промотора IE2 CMF (SEQ ID NO: 23) (эти сайты подчеркнуты).

Фигура 15 является схемой способа для анализа экспрессии микроРНК.

Фигура 16 показывает продукты ПЦР, полученные из микроРНК, которые были экспрессированы при высоких уровнях в высокопродуцирующих антитело клетках.

Фигура 17 показывает плазмиды pPur-APES165 и pPur-ALT1, которые использовали для коэкспрессии частичной последовательности 165bp транскрипта AI642048 (437 п.н.) и коэкспрессии ALT1, соответственно, в pHyg-TAUT-экспрессирующих клетках.

Фигура 18 показывает результат культуры с подпиткой в шейкере, который показывает высокий эффект роста клеток и высокий эффект продуцирования антитела, которые происходили из сильной экспрессии APES.

Фигура 19 показывает результат культуры с подпиткой в 1-литровом сосуде, который показывает высокий эффект роста клеток и высокий эффект продуцирования антитела, которые происходили из сильной экспрессии APES.

Фигура 20 показывает корреляцию между уровнем экспрессии APES сильно экспрессирующих APES165 кандидатных клеток-хозяев (девяти штаммов) и плотностью их жизнеспособных клеток.

Фигура 21 показывает, что количество продуцирования Mab1 увеличивается сильной экспрессией частичных последовательностей частичной последовательности APES165 транскрипта AI462015 (437 п.н.).

Фигура 22 показывает, что частичные последовательности APES165, которые, как было обнаружено, имеют эффект высокого продуцирования антител, как показано на Фигуре 21, содержат комплементарную Nfkbia последовательность.

Фигура 23 показывает, что AI462015 является комплементарной цепью мРНК Nfkbia мыши (Пример 8).

Фигура 24 показывает, что имеется гомологичная последовательность AI462015 на геноме клеток CHO-K1 (Example 8).

Фигура 25а показывает, что частичная последовательность (нуклеотиды 7-91 от 5’-конца) AI462015 является консервативной независимо от вида.

Фигура 25b показывает, что частичная последовательность (нуклеотиды 7-91 от 5’-конца) AI462015 является консервативной независимо от вида.

Фигура 25c показывает, что частичная последовательность (нуклеотиды 7-91 от 5’-конца) AI462015 является консервативной независимо от вида.

Фигура 25d показывает, что частичная последовательность (нуклеотиды 7-91 от 5’-конца) AI462015 является консервативной независимо от вида.

Фигура 25е показывает, что частичная последовательность (нуклеотиды 7-91 от 5’-конца) AI462015 является консервативной независимо от вида.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0016] Варианты осуществления данного изобретения описаны ниже более подробно.

[0017] (1) APES (Усиливающая Продуцирование Антитела Последовательность)

Данное изобретение обеспечивает способ получения полипептида, предусматривающий культивирование клетки, которая экспрессирует APES и в которую была введена ДНК, кодирующая желаемый полипептид, с получением посредством этого желаемого полипептида.

[0018] Как подробно описано в Примерах ниже, авторы данного изобретения обнаружили некодирующую РНК мРНК-типа с увеличенным уровнем экспрессии, коррелируемым с антитело-продуцирующей способностью в культивируемых СНО-клетках, и авторы этого изобретения идентифицировали некодирующую РНК мРНК-типа в виде транскрипта из 437 нуклеотидов в геноме мыши (Фигура 1; GenBank Accession ID: AI462015; SEQ ID NO: 1). Эта последовательность AI462015 и ее местоположение на геноме мыши показаны на Фигуре 1. Эта последовательность AI462015 существует на комплементарной цепи вблизи 3’-нетранслируемого района NfkBia (ингибитора α ядерного фактора κB) мРНК генома мыши (Примечание: Последующее обновление информации, выдаваемое GeneBank, выявило, что этот 437-нуклеотидный транскрипт AI462015 соответствует комплементарной цепи 3’-нетранслируемого района (513 нуклеотида) мРНК NfkBia мыши (Фигура 23)).

[0019] Кроме того, авторы этого изобретения обнаружили, что количество продуцирования желаемого полипептида может быть увеличено введением молекул нуклеиновых кислот, каждая из которых имеет произведенную из AI462015 частичную последовательность, в клетки-хозяева для возможности осуществления этой экспрессии.

[0020] Авторы этого изобретения предположили, что эти молекулы нуклеиновых кислот могут регулировать экспрессию NfkBia в культивируемых клетках, усиливая посредством этого активность Nf-kappa B и, следовательно, увеличивая продуцирующую рекомбинантный белок способность. Конкретно, авторы этого изобретения предположили, что NF-kappa B, имеющий усиленную активность, мог бы транслоцироваться в ядро, увеличивать экспрессию генов, связанных с иммунитетом, воспалением и анти-апоптозом (например, Bcl-2, Bcl-xL, IAP (Ингибиторов Белков Апоптоза)) и способствовать росту этих клеток, поддержанию коэффициента выживаемости этих клеток и т.п.

[0021] Авторы этого изобретения назвали совместно APES (Усиливающей Продуцирование Антитела Последовательность) (также называемой PPES (Усиливающей Продуцирование Полипептида Последовательностью) (в некоторых случаях) РНК или ДНК или их последовательность, которая имеет следующие функции, обеспечиваемые их собственной экспрессией или увеличенной экспрессией в культивируемых клетках: регуляцию экспрессии NfkBia в культивируемых клетках и посредством этого усиление активности Nf-kappa B и увеличение способности продуцировать желаемый рекомбинантный полипептид, такой как рекомбинантное антитело, и которая предпочтительно не кодирует белки.

[0022] Предыдущая произведенная из AI462015 последовательность или ее частичная последовательность является консервативной не только в грызунах, таких как мышь или хомячок, но также в человеке и, как считается, является также высококонсервативной последовательностью в других млекопитающих и животных, таких как рыба и насекомые. Таким образом, частичная последовательность 3’-нетранслируемого района мРНК NfkBia, полученной из различных клеток животных, или последовательность, комплементарная этой последовательности, (эта частичная последовательность и эта комплементарная последовательность соответствуют произведенной из AI462015 последовательности или ее частичной последовательности) также могут быть использованы в качестве APES-последовательностей данного изобретения.

[0023] В одном варианте осуществления, часть последовательности APES содержит комплементарную Nfkbia последовательность или является комплементарной Nfkbia последовательностью, и этот признак приводит к супрессии экспрессии Nfkbia в APES-экспрессирующих клетках. Эта супрессия стимулирует функцию продуцирования антитела и т.п. при высоких уровнях.

[0024] В одном варианте осуществления, APES является молекулой нуклеиновой кислоты, которая интерферирует с мРНК NfkBia (RNA-интерференция) и которая имеет сама функцию связывания с мРНК NfkBia в клетке для отрицательной регуляции экспрессии мРНК. Это увеличение внутриклеточного уровня экспрессии APES приводит к супрессированной экспрессии функции NfkBia и посредством этого увеличивает уровень экспрессии генов антител и дополнительно продуцирует рекомбинантный полипептид, такой как антитело, при высоких уровнях.

[0025] Таким образом, APES может быть следующей последовательностью, содержащей последовательность, которая может связываться с ДНК или мРНК гена NfkBia спариванием оснований: двухцепочечной РНК (dsRNA) или siRNA, которая является короткой dsRNA, или siRNA, диссоциированной на отдельные цепи, или shRNA, антисмысловой ДНК или РНК, микроРНК (miRNA) или некодирующей РНК типа мРНК.

[0026] Например, эта последовательность APES может быть олигонуклеотидом, состоящим из последовательности, содержащей частичную последовательность, комплементарную мРНК-мишени NfkBia. Такой олигонуклеотид является, например, miRNA, которая является последовательностью, соответствующей 19-25 нуклеотидам в комплементарной цепи мРНК NfkBia, или последовательностью, идентичной вышеуказанной последовательности, за исключением одного олигонуклеотида, и которая проявляет эффект супрессии экспрессии NfkBia. Альтернативно, APES может быть длинной цепью, некодирующей РНК типа мРНК, и может быть, например, такой РНК, которая состоит из последовательности с длиной 561 нуклеотидов (561-мер) или с длиной самое большее 500 нуклеотидов (500-мер), содержащей последовательность, способную связываться с ДНК или мРНК гена NfkBia спариванием оснований, и которая проявляет эффект супрессии экспрессии NfkBia. Альтернативно, APES может быть более длинной цепью (сотнями - сотнями тысяч нуклеотидов), некодирующей РНК мРНК-типа. Например, APES может быть молекулой нуклеиновой кислоты или последовательностью с длиной 200-100000 нуклеотидов или с длиной 300-300000 нуклеотидов.

[0027] Последовательность, которая может связываться спариванием оснований, не ограничивается последовательностью полного спаривания (т.е. 100% комплементарной последовательностью), и присутствие неспаривающихся нуклеотидов является также приемлемым, пока они не интерферируют с ее функциями (т.е. не мешают ее функциям). Предпочтительной является скорее частичная комплементация, зависящая от формы APES. Таким образом, например, последовательность, которая является по меньшей мере на 70%, более предпочтительно на 80%, еще более предпочтительно на 90%, наиболее предпочтительно на 95% гомологичной генетической ДНК или мРНК, содержащей нетранслируемый район NfkBia, или последовательность, комплементарная вышеуказанной последовательности, также включена в термин “последовательность, которая может связываться спариванием оснований”. Например, что касается некодирующей РНК мРНК-типа, 561-мера или 500-мера, по меньшей мере 90% гомологичная последовательность включает в себя мутантные последовательности, которые содержат 1-50 ошибочно спаренных нуклеотидов (или 1-56 ошибочно спаренных нуклеотидов в случае РНК 561-мера), происходящих из инсерции, делеции или точковой мутации нуклеотидов, и которые имеют функцию увеличения способности продуцирования рекомбинантного полипептида, такого как антитело, в ассоциации с экспрессией самих мутантных последовательностей в клетках-хозяевах, или функцию супрессии экспрессии NfkBia. Таким образом, предполагается, что последовательность, произведенная из ортолога NfkBia (ксеногенного гомологичного гена), которая имеет некоторую степень сходства последовательности (например, по меньшей мере 70% гомологию) и произведена из вида, отличающегося от клетки-хозяина, также может быть использована в качестве APES.

[0028] Альтернативно, эта последовательность, которая может связываться спариванием оснований, включает в себя последовательность, которая может связываться с мРНК NfkBia при таких условиях, как внутриклеточные условия. Такая последовательность включает в себя, например, последовательность, которая гибридизуется при условиях, известных квалифицированному в данной области специалисту как условия высокой строгости, и которая имеет желаемые функции. Одним примером условий высокой строгости является инкубирование полинуклеотида и другого полинуклеотида в гибридизационном буферном растворе, содержащем 6 × SSPE или SSC, 50% формамид, 5 × реагент Денхардта, 0,5% ДСН и 100 мкг/мл фрагментированной, денатурированной ДНК спермы лосося, при температуре гибридизации 42°C в течение 12-16 часов (один из этих полинуклеотидов может быть прикреплен к поверхности, такой как твердая поверхность, например, мембрана) и последующие промывки полученного материала промывочным буферным раствором, содержащим 1 × SSC и 0,5% ДСН при оптимальной температуре 42°C или более высокой. В отношении других конкретных условий, можно сослаться на многочисленные экспериментальные руководства, которые хорошо известны квалифицированному в данной области специалисту, такие как Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition)”, Cold Spring Harbor Laboratory Pr; и Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, Maruzen Co., Ltd.

[0029] Новая молекула нуклеиновой кислоты, имеющая активность APES, или молекула нуклеиновой кислоты, имеющая комплементарность последовательности с этой молекулой, является важным признаком данного изобретения.

[0030] В одном варианте осуществления, APES является молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей функцию супрессии экспрессии NfkBia или увеличения продуцирования рекомбинантного полипептида, и является РНК или ДНК, которые могут связываться с ДНК или мРНК гена NfkBia, произведенных из человека, мыши, крысы или хомячка, спариванием оснований. Предполагается, что такая молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, гомологичную или комплементарную мРНК, кодирующей NfkBia, и может связываться с геном или мРНК NfkBia и ингибировать его экспрессию.

[0031] В одном варианте осуществления, APES является малой РНК с длиной 19-25 нуклеотидов, содержащей последовательность, комплементарную части мРНК NfkBia, или малой РНК, которая имеет последовательность, идентичную этой последовательности, за исключением одного нуклеотида, и имеет функцию супрессии экспрессии NfkBia или увеличения продуцирования рекомбинантных полипептидов. Эта малая РНК обозначает в данном контексте малую некодирующую РНК (snRNA), и snRNA включает в себя miRNA.

[0032] В одном варианте осуществления, APES является некодирующей РНК мРНК-типа с длиной самое большее 561 нуклеотид, которая содержит последовательность, комплементарную части мРНК NfkBia (например, эта последовательность является малой некодирующей РНК-последовательностью, описанной выше).

[0033] В одном варианте осуществления, APES является некодирующей РНК мРНК-типа с длиной 561-1579 нуклеотидов, которая содержит последовательность, комплементарную части мРНК NfkBia (например, эта последовательность является малой некодирующей РНК-последовательностью, описанной выше).

[0034] Один специфический пример APES, который был обнаружен в транскрипте в клетках CHO, имеет произведенную из AI462015 мыши частичную последовательность или такую частичную последовательность, в которой один или несколько нуклеотидов были заменены, делетированы или добавлены. В частности, включены ДНК-последовательность из 165 нуклеотидов, которая состоит из нуклеотидной последовательности между G в нуклеотиде 4 и С в нуклеотиде 168 от 5’-конца (SEQ ID NO: 2, APES165); комплементарной (антисмысловой) ДНК-последовательности из этой ДНК-последовательности; последовательности, содержащей РНК-последовательность, транскрибируемую из этих ДНК; или частичной последовательности любой длины в этой последовательности. Альтернативно, включена также ДНК-последовательность из 434 нуклеотидов, которая состоит из нуклеотидной последовательности между G в нуклеотиде 4 от 5’-конца и Т в 3’-конце (SEQ ID NO: 3, APES34); комплементарной (антисмысловой) ДНК-последовательности этой ДНК-последовательности; последовательности, содержащей РНК-последовательность, транскрибируемую из этих ДНК; или частичной последовательности любой длины, произведенной из этой последовательности. Включена также нуклеотидная последовательность, содержащая последовательность, полученную из млекопитающего, такого как человек, хомячок или крыса, которая соответствует последовательности AI462015 мыши; частичная последовательность, содержащая полученную из млекопитающего последовательность; или такая частичная последовательность, в которой один или несколько нуклеотидов были заменены, делетированы или добавлены.

[0035] В одном варианте осуществления, APES имеет нуклеотидную последовательность между нуклеотидами 4 и 133 от 5’-конца (SEQ ID NO: 4, APES130) в AI462015 или частичную последовательность, произведенную из этой последовательности. Например, включена ДНК-последовательность между нуклеотидами 4 и 68 от 5-конца (SEQ ID NO: 5, APES4-68) или ДНК-последовательность между нуклеотидами 69 и 133 от 5’-конца (SEQ ID NO: 6, APES69-133) или их комплементарная ДНК-последовательность или последовательность, транскрибируемая из этих ДНК.

[0036] В одном варианте осуществления, APES имеет последовательность из 52 нуклеотидов между нуклеотидами 40 и 91 от 5’-конца (SEQ ID NO: 7) в AI462015 или последовательность, произведенную из частичной последовательности, полученной отщеплением 52 нуклеотидов в любом местоположении. Например, включена ДНК-последовательность первой части (29 нуклеотидов APES40-68, 24 нуклеотида APES40-63 или 22 нуклеотида APES40-61) или последней части (23 нуклеотида APES69-91), или их комплементарная ДНК-последовательность (соответствующая SEQ ID NO: 8-11, соответственно), или последовательность, транскрибируемая из этих ДНК.

[0037] Эти 52 нуклеотида, описанные выше, являются последовательностью, идентичной последовательности комплементарной цепи 3’-нетранслируемого района гена NfkBia крысы, за исключением одного нуклеотида. 5’-24 нуклеотида (APES40-63, SEQ ID NO: 9) являются последовательностью, идентичной последовательности 3’-нетранслируемого района гена NfkBia человека. Эти 5’-22 нуклеотида (APES40-61, SEQ ID NO:10: AAGTACCAAAATAATTACCAAC) являются последовательностью, идентичной последовательности комплементарной цепи 3’-нетранслируемого района мРНК NfkBia независимо от вида, такого как крыса, макак резус, собаки и лошади. Ожидается что RNAi-эффект будет проявляться экспрессией в клетках-хозяевах частичной последовательности, комплементарной 3’-нетранслируемому району гена NfkBia. Например, возможно, что РНК, имеющая последовательность, комплементарную 19-25 нуклеотидам из вышеуказанных 52 нуклеотидов, будет действовать как микроРНК (miRNA) на нетранслируемом районе мРНК NfkBia, интерферируя посредством этого с процессом трансляции.

[0038] Альтернативно, APES имеет последовательность из 85 нуклеотидов между нуклеотидами 7 и 91 от 5’-конца (SEQ ID NO: 29) в AI462015 или последовательность, произведенную из частичной последовательности, полученной отщеплением 85 нуклеотидов в любом местоположении. Возможно, что РНК, имеющая последовательность, комплементарную 19-25 нуклеотидам из вышеуказанных 85 нуклеотидов, будет действовать как микроРНК (miRNA) на нетранслируемом районе мРНК NfkBia, интерферируя посредством этого с процессом трансляции.

[0039] В одном варианте осуществления, APES имеет последовательность, найденную в поиске на siRNA из 21 нуклеотидов. Примеры включают в себя miRNA-последовательности, содержащие последовательность, комплементарную ДНК-последовательности между нуклеотидами 84 и 104 (SEQ ID NO: 12, APES84-104) в AI462015, ДНК-последовательность между нуклеотидами 99 и 119 (SEQ ID NO: 13, APES99-119) или ДНК-последовательность между нуклеотидами 101 и 121 (SEQ ID NO: 14, APES101-121). Последовательность между нуклеотидами 71 и 112 (SEQ ID NO: 16) в вышеуказанной APES 69-133 является районом, который был определен количественно на GeneChip и действительно экспрессировался на высоком уровне. Таким образом, предполагается, что существует высокая вероятность того, что APES84-104 может функционировать как мРНК.

[0040] Кроме того, на основе структурного или функционального признака APES, новая молекула нуклеиновой кислоты, имеющая APES-активность, может быть синтезирована химически или выделена из биологических источников. Структурным признаком APES является то, что она является молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, комплементарную части мРНК NfkBia (мишени). Эта молекула нуклеиновой кислоты может находиться в любой форме, независимо от того, является ли она ДНК, ДНК-транскриптом, мРНК или кДНК, экзосомной РНК, химически синтезированной одноцепочечной РНК или химически синтезированной двухцепочечной РНК. Функциональным признаком является увеличение способности продуцировать рекомбинантный полипептид, такой как антитело, или супрессия экспрессии NfkBia, в ассоциации с экспрессией APES в клетках-хозяевах.

[0041] Если APES выделена из биологического источника, она может быть получена из любого живого организма без какого-либо конкретного ограничения. Конкретные примеры включают в себя APES, полученные из животных, включающих в себя приматов, таких как человек и шимпанзе; грызунов, таких как мышь, крыса и хомячок; скот, например, крупный рогатый скот, свинья и коза; птицы, такие как курица; рыба, такая как рыба-зебра; насекомых, таких как муха; нематоду; и т.п. APES предпочтительно получают из человека, грызуна или того же самого вида, к которому принадлежит клетка-хозяин. Например, когда сильно APES-экспрессирующей клеткой является клетка яичника Китайского хомячка (CHO-клетка), APES предпочтительно получают из человека, мыши или хомячка.

[0042] Такая молекула нуклеиновой кислоты может быть получена способом, известным квалифицированному в данной области специалисту. Например, эта молекула нуклеиновой кислоты может быть получена в соответствии со следующими процедурами: получением общей РНК из культивируемых клеток, которые продуцировали рекомбинантный полипептид, такой как антитело, на высоком уровне, синтезом олигонуклеотида на основе последовательности нуклеиновой кислоты этого изобретения (например, APES165 SEQ ID NO: 2), и проведением ПЦР с использованием этого олигонуклеотида в качестве праймера для амплификации кДНК, имеющей признаки APES. Далее, после получения малой РНК из культивируемых клеток, которые продуцировали рекомбинантный полипептид, такой как антитело, на высоком уровне, может быть получена кДНК-библиотека для получения малой РНК, содержащей частичную последовательность, комплементарную мРНК NfkBia на основе этой нуклеотидной последовательности клонированной кДНК. Эта кДНК-библиотека может быть также сконструирована способом, описанным, например, в Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), после получения малой РНК, такой как микроРНК (miRNA).

[0043] Кроме того, APES-экспрессирующая геномная ДНК может быть выделена определением нуклеотидной последовательности полученной кДНК и скринингом библиотеки геномной ДНК с использованием этой кДНК в качестве зонда.

[0044] Конкретно, могут быть использованы следующие процедуры: сначала общую РНК выделяют из клеток, тканей или т.п., которые, вероятно, экспрессируют APES данного изобретения; для этого выделения мРНК используют известный способ, такой как способ ультрацентрифугирования с использованием гуанидина (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) или AGPC-способ (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) для получения общей РНК и затем эту общую РНК дополнительно очищают с использованием мининабора RNeasy Mini Kit (QIAGEN) или т.п.

[0045] Из этой полученной общей РНК кДНК синтезируют с использованием обратной транскриптазы. кДНК может быть также синтезирована с использован