Строение экспрессионного вектора, новые способы получения клеток-продуцентов и их применение для рекомбинантного получения полипептидов

Строение экспрессионного вектора, новые способы получения клеток-продуцентов и их применение для рекомбинантного получения полипептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В настоящем документе описаны новое строение векторов, новые способы получения линий клеток-продуцентов, такие как новые способы трансфекции или селекции, а также применение этих экспрессионных векторов и линий клеток-продуцентов для рекомбинантного получения интересующих полипептидов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Уровень транскрипции гена может иметь сильное влияние на уровень его экспрессии и, следовательно, определять продуктивность клетки. Главным образом, на уровень транскрипции гена влияют три элемента вектора: промотор, поли(А)-сигнальная последовательность и (если имеется) терминатор транскрипции.

Нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, как правило, содержит лидерную последовательность (сигнальную последовательность) (приблизительно 57 п.н./19 а.о.), которая удаляется при созревании белка, вариабельный район, VH (приблизительно 350 п.н./115 а.о.) и константный район, СН (приблизительно 990 п.н./330 а.о.). Нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, как правило, состоит из лидерной последовательности (приблизительно 66 п.н./22 а.о.), которая удаляется при созревании белка, вариабельного района, VK или VL (приблизительно 350 п.н./115 а.о.) и константного района, CK или CL (приблизительно 321 п.н./107 а.о.).

Рекомбинантное получение антител в эукариотических клетках включает получение экспрессионных систем (см. McCafferty, J., et al., (eds.), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press (1997)). Для разработки экспрессионных систем антитела создают экспрессионную кассету, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, фланкированную районами промотора и сигнала полиаденилирования (полиА). Также создают экспрессионную кассету тяжелой цепи, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь, фланкированную районами промотора и полиА. Экспрессионная кассета тяжелой цепи может быть скомбинирована с экспрессионной кассетой легкой цепи в одном векторе, который в итоге содержит обе указанные экспрессионные кассеты; или они могут быть интегрированы в два отдельных вектора.

Кассеты молекул ДНК иммуноглобулина, конструкции монотел, способы их получения и способы их применения описаны в патенте США номер 7,053,202. В патенте США номер 5,168,062 описаны вектора для переноса и микроорганизмы, содержащие немедленно-раннюю промоторную регуляторную последовательность ДНК цитомегаловируса. Фрагмент ДНК, содержащий промоторный район человеческого фактора элонгации полипептидной цепи 1α, его последовательность и экспрессионные плазмиды, содержащие фрагмент ДНК, имеющие высокую применимость к широкому спектру клеток-хозяев с высоким экспрессионным потенциалом, описаны в патенте США номер 5,225,348. В патенте США номер 5,266,491 описаны экспрессионные плазмиды, содержащие точку начала репликации SV40 и фрагмент ДНК, содержащий промоторный район гена человеческого фактора элонгации полипептидной цепи 1α. Соединения рекомбинантной ДНК и экспрессия полипептидов, таких как tPA, описаны в патенте США номер 5,122,458. В патенте США номер 7,422,874 описан экспрессионный вектор для животной клетки.

В Kim, D., et al. описаны улучшенные посредством манипулирования районами терминации транскрипции экспрессионные системы в клетках млекопитающих (Biotechnol. Prog. 19 (2003) 1620-1622). Описанный 9-нуклеотидный участок клеточной мРНК может функционировать как внутренний сайт посадки рибосомы (IRES), и, когда он представлен в виде множества соединенных копий, происходит значительное усиление IRES-активности, что описано в Chappell, S.A., et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 1536-1541. В Corish, P. and Tyler-Smith, С.описано уменьшение времени полужизни зеленого флуоресцентного белка в клетках млекопитающих (Prot. Eng. 12 (1999) 1035-1040). Новый вектор GFPneo, разработанный для выделения и анализа энхансерных элементов в трансфецированных клетках млекопитающих, описан в Primig, M., et al. (Gene 215 (1998) 181-189). В Ng, S.K., et al. описано применение дестабилизирующих последовательностей на маркере селекции для улучшения продуктивности рекомбинантного белка в CHO-DG44 (Metabol. Eng. 9 (2007) 304-316).

В Sanna Pietro, Р. описана экспрессия фрагментов Fab антитела и полноразмерного иммуноглобулина в клетках млекопитающих (Meth. Mol. Biol. 178 (2002) 389-395). Библиотека клеточного дисплея для клонирования генов различных районов человеческих антител к поверхностному антигену гепатита В описана в Higuchi, K., et al. (J. Immunol. Meth. 202 (1997) 193-204). В Kim, D., et al. описаны улучшенные посредством манипулирования районами терминации транскрипции экспрессионные системы млекопитающих (Biotechnol. Progress 19 (2003) 1620-1622). Методические указания по конструированию клеток для получения моноклональных антител описаны в Costa, R.A., et al. (Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 74 (2010) 127-138). В Kim, D.W., et al. описано применение промотора фактора элонгации 1α человека как универсальной и эффективной экспрессионной системы (Gene 91 (1990) 217-223). Сравнение интрон-зависимой и интрон-независимой экспрессии генов описано в Buchman, A.R., et al., (Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 4395-4405). В Wang, F., et al. описана экспрессия антител в клетках млекопитающих (в Therapeutic monoclonal antibodies - From bench to clinic, Wiley (2009), страницы 557-572). Сравнительное исследование разных конструкций векторов для экспрессии в млекопитающих рекомбинантных антител IgG описано в Li et al. (J. Immunol. Meth. 318 (2007) 113-124). В Ho, S.C.L., et al. описаны IRES-опосредованные трицистронные вектора для улучшенного получения клеточных линий СНО с высоким уровнем экспрессии моноклональных антител (J. Biotechnol. 157 (2011) 130-139). Получение химерного анти-CO₂ антитела рекомбинантными животными клетками описано в Hotta, Α., et al. (J. Biosci. Bioeng. 98 (2004) 298-303). В Lee, J-C, et al. описана высокоэффективная экспрессия белка, опосредованная последовательностью внутренней посадки рибосомы энтеровируса 71 (Biotechnol. Bioeng. 90 (2005) 656-662). В WO 2008/142124 описана получение рекомбинантного белка в птичьих клетках ЕВХ®.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Обнаружено, что при получении рекомбинантных антител расположение экспрессионной кассеты тяжелой цепи перед экспрессионной кассетой легкой цепи (HC-LC (5ʹ-3ʹ)) обеспечивает лучшие результаты экспрессии по сравнению с обратным порядком (LC-HC (5-3ʹ)). Кроме того, обнаружено, что расположение маркера селекции после обеих экспрессионных кассет антитела обеспечивает лучшие результаты экспрессии (HC-LC-SM (5ʹ-3ʹ)) по сравнению с двунаправленным расположением перед первой цепью антитела (SM (3ʹ-5ʹ)-НС-LC (5ʹ-3ʹ)).

Обнаружено, что для стабильных трансфекций является оптимальным расположение в порядке 1) тяжелая цепь антитела, 2) легкая цепь антитела и 3) маркер селекции. Но хотя промотор hEF1α, несомненно, превосходит промотор hCMV в стабильных пулах, мы наблюдали прямо противоположный эффект на уровне отдельных клонов. А именно, немедленно-ранний промотор/энхансер цитомегаловируса человека (hCMV) давал клоны с наиболее высокой продуктивностью. Более того, его действие может быть также усилено с помощью его комбинирования с поли(А)-сигнальной последовательностью из bGH и с терминаторной последовательностью гена гастрина человека (hGT), который усиливает и продуктивность, и стабильность экспрессии.

Обнаружено, что применение экспрессионного вектора, включающего в себя экспрессионную кассету тяжелой цепи антитела и экспрессионную кассету легкой цепи антитела, каждая из которых содержит промотор, структурный ген и поли(А)-сигнальную последовательность, и, необязательно, терминаторную последовательность, приводит к большему количеству клеточных клонов, продуцирующих/секретирующих антитело, после трансфекций в случае, если 1) промотором является промотор цитомегаловируса человека (hCMV), поли(А)-сигнальной последовательностью является сигнальная последовательность полиА бычьего гормона роста (полиА bGH) и терминаторной последовательностью является транскрипционная терминаторная последовательность гена гастрина человека (hGT) или 2) промотором является промотор фактора элонгации 1α человека (EF1α), сигнальной последовательностью полиА является поли(А)-сигнальная последовательность бычьего гормона роста (полиА bGH) и терминаторная последовательность отсутствует.

При использовании экспрессионного вектора, соответствующего описанию выше, после трансфекций может быть получено большее количество клеток, продуцирующих/секретирующих антитело, и, таким образом, снижены необходимые усилия для обнаружения высокопродуктивной клетки, подходящей для крупномасштабного получения рекомбинантных антител.

Одним аспектом настоящего изобретения является экспрессионный вектор, содержащий

экспрессионную кассету легкой цепи антитела

экспрессионную кассету тяжелой цепи антитела и

экспрессионную кассету маркера селекции,

где экспрессионные кассеты расположены однонаправлено и

где экспрессионные кассеты расположены по направлению от 5ʹ- к 3ʹ-концу последовательности в следующем порядке: экспрессионная кассета тяжелой цепи антитела, экспрессионная кассета легкой цепи антитела и экспрессионная кассета маркера селекции.

В одном варианте экспрессионная кассета легкой цепи антитела и/или экспрессионная кассета тяжелой цепи антитела, и/или экспрессионная кассета маркера селекции независимо друг от друга содержат промотор, выбранный из промотора фактора элонгации 1α, человека, промотора CMV человека и промотора SV40.

В одном варианте одна, две или все три экспрессионные кассеты содержат промотор фактора элонгации 1α человека. В одном варианте экспрессионная кассета легкой цепи антитела и/или экспрессионная кассета тяжелой цепи антитела и/или кассета маркера селекции независимо друг от друга содержат промотор фактора элонгации 1α человека. В одном варианте экспрессионная кассета не содержит терминаторную последовательность, т.е. экспрессионная кассета свободна от терминаторной последовательности. В одном варианте терминаторной последовательностью является транскрипционная терминаторная последовательность гена гастрина человека (hGT).

В одном варианте одна, две или все три экспрессионные кассеты содержат промотор CMV человека. В одном варианте экспрессионная кассета легкой цепи антитела и/или экспрессионная кассета тяжелой цепи антитела и/или кассета маркера селекции независимо друг от друга содержат промотор CMV человека.

В одном варианте одна, две или три экспрессионные кассеты содержат сигнальную последовательность полиА бычьего гормона роста. В одном варианте экспрессионная кассета легкой цепи антитела и/или экспрессионная кассета тяжелой цепи антитела, и/или кассета маркера селекции независимо друг от друга содержат сигнальную последовательность полиА бычьего гормона роста.

В одном варианте экспрессионная кассета легкой цепи антитела и/или экспрессионная кассета тяжелой цепи антитела и/или кассета маркера селекции независимо друг от друга содержат одну из следующих сигнальных последовательностей полиА: сигнальная последовательность полиА бычьего гормона роста и сигнальная последовательность SV40.

В одном варианте одна, две или все три экспрессионные кассеты содержат терминаторную последовательность гастрина человека после сигнальной последовательности полиА с условием, что экспрессионные кассеты не содержат промотор фактора элонгации 1α человека. В одном варианте экспрессионная кассета легкой цепи антитела и/или экспрессионная кассета тяжелой цепи антитела, и/или кассета маркера селекции независимо друг от друга содержат терминаторную последовательность гастрина человека после сигнальной последовательности полиА.

В одном варианте экспрессионная кассета легкой цепи антитела и/или экспрессионная кассета тяжелой цепи антитела и/или кассета маркера селекции независимо друг от друга содержат в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу сигнальную последовательность полиА бычьего гормона роста и терминаторную последовательность гастрина человека с условием, что экспрессионные кассеты не содержат промотор фактора элонгации 1α человека.

В одном варианте промотор одной, двух или всех трех экспрессионных кассет содержит интрон А.

В одном варианте одна, две или все три экспрессионные кассеты содержат сигнальную последовательность полиА SV40.

В одном варианте одна, две или все три экспрессионные кассеты содержат промотор SV40.

В одном варианте нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит, по меньшей мере, один интрон.

В одном варианте нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, является кДНК.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение экспрессионного вектора, описанного в настоящем документе, для рекомбинантного получения антитела.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение экспрессионного вектора, описанного в настоящем документе, для получения стабильной клеточной линии.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение экспрессионного вектора, описанного в настоящем документе, для получения линии клеток-продуцентов.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение экспрессионного вектора, описанного в настоящем документе, включающего в себя, по меньшей мере, одну экспрессионную кассету, содержащую промотор фактора элонгации 1α человека, для получения стабильной клеточной линии.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение экспрессионного вектора, описанного в настоящем документе, включающего в себя, по меньшей мере, одну экспрессионную кассету, содержащую промотор фактора элонгации 1α человека, для получения линии клеток-продуцентов.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение экспрессионного вектора, описанного в настоящем документе, включающего в себя, по меньшей мере, одну экспрессионную кассету, содержащую промотор фактора элонгации 1α человека, для рекомбинантного получения антитела.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение экспрессионного вектора, описанного в настоящем документе, включающего в себя, по меньшей мере, одну экспрессионную кассету, содержащую промотор CMV человека, для получения линии клеток-продуцентов.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение экспрессионного вектора, описанного в настоящем документе, включающего в себя, по меньшей мере, одну экспрессионную кассету, содержащую промотор CMV человека, для получения стабильной клеточной линии.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение экспрессионного вектора, описанного в настоящем документе, включающего в себя, по меньшей мере, одну экспрессионную кассету, содержащую промотор CMV человека, для получения антитела.

Одним аспектом настоящего изобретения является способ трансфекций эукариотической клетки экспрессионным вектором, который характеризуется тем, что он линеаризован перед трансфекцией путем разрезания в точке начала репликации прокариот.

В одном варианте точка начала репликации прокариот находится между экспрессионной кассетой легкой цепи антитела и экспрессионной кассетой тяжелой цепи антитела.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение способа, описанного в настоящем документе, для получения эукариотической клетки для рекомбинантного получения антитела.

Одним аспектом настоящего изобретения является способ селекции эукариотических клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, который характеризуется тем, что агент для селекции в первый раз добавляют в культуральную среду примерно через 24 часа после трансфекций.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение способа, описанного в настоящем документе, для получения эукариотической клетки для рекомбинантного получения антитела.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение клетки, селектированной с помощью способа, описанного в настоящем документе, для рекомбинантного получения антитела.

Одним аспектом настоящего изобретения является способ получения антитела, включающий следующие этапы:

культивирование эукариотической клетки, содержащей экспрессионный вектор согласно настоящему документу, и

выделение антитела из клетки или из культуральной среды.

Одним аспектом настоящего изобретения является способ получения антитела, включающий следующий этап:

культивирование эукариотической клетки, полученной путем трансфекций экспрессионным вектором, который был линеаризован перед трансфекцией путем разрезания в точке начала репликации прокариот, и

выделение антитела из клетки или из культуральной среды.

Одним аспектом настоящего изобретения является способ получения антитела, включающий следующий этап:

культивирование эукариотической клетки, селектированной с помощью добавления в культуральную среду агента для селекции примерно через 24 часа после трансфекций, и

выделение антитела из клетки или из культуральной среды.

Одним аспектом настоящего изобретения является способ трансфекций эукариотической клетки экспрессионным вектором, содержащим прокариотические и эукариотические последовательности нуклеиновых кислот, который характеризуется тем, что прокариотические последовательности нуклеиновых кислот удаляют из экспрессионного вектора перед трансфекцией эукариотической клетки экспрессионным вектором.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение линеаризованного экспрессионного вектора, не содержащего прокариотические последовательности нуклеиновых кислот, для трансфекций эукариотической клетки.

Одним аспектом настоящего изобретения является применение экспрессионного вектора, содержащего только эукариотические последовательности нуклеиновых кислот, для получения эукариотической клетки для рекомбинантного получения антитела.

В одном варианте всех аспектов, заявленных в настоящем документе, антитело является биспецифическим.

В одном варианте биспецифическое антитело имеет первую специфичность связывания или сайт связывания, который специфично связывается с первым антигеном или с первым эпитопом на антигене, и биспецифическое антитело имеет вторую специфичность связывания или сайт связывания, который специфично связывается со вторым антигеном или со вторым эпитопом на антигене.

В одном варианте экспрессионный вектор содержит или

первую экспрессионную кассету, содержащую по направлению от 5ʹ- к 3ʹ-концу промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую легкую цепь антитела, сигнальную последовательность полиА, и, необязательно, терминаторную последовательность,

вторую экспрессионную кассету, содержащую по направлению от 5ʹ- к 3ʹ-концу промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую легкую цепь антитела, сигнальную последовательность полиА, и, необязательно, терминаторную последовательность,

третью экспрессионную кассету, содержащую по направлению от 5ʹ- к 3ʹ-концу промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь антитела, сигнальную последовательность полиА, и, необязательно, терминаторную последовательность,

четвертую экспрессионную кассету, содержащую по направлению от 5ʹ- к 3ʹ-концу промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь антитела, сигнальную последовательность поли А, и, необязательно, терминаторную последовательность,

или

первую экспрессионную кассету, содержащую по направлению от 5ʹ- к 3ʹ-концу промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, сигнальную последовательность поли А, и, необязательно, терминаторную последовательность,

вторую экспрессионную кассету, содержащую по направлению от 5ʹ- к 3ʹ-концу промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь антитела, сигнальную последовательность поли А, и, необязательно, терминаторную последовательность,

третью экспрессионную кассету, содержащую по направлению от 5ʹ- к 3ʹ-концу промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь антитела, сигнальную последовательность поли А, и, необязательно, терминаторную последовательность,

где легкая цепь антитела является общей для обеих тяжелых цепей антитела.

В одном варианте всех аспектов, заявленных в настоящем документе, экспрессионный вектор содержит

экспрессионную кассету легкой цепи антитела,

экспрессионную кассету первой тяжелой цепи антитела,

экспрессионную кассету второй тяжелой цепи антитела, и

экспрессионную кассету маркера селекции,

где, по меньшей мере, одна из экспрессионной кассеты тяжелой цепи антитела, экспрессионной кассеты легкой цепи антитела и экспрессионная кассета маркера селекции расположены однонаправленно, и

где однонапраленные экспрессионные кассеты расположены по направлению от 5ʹ- к 3ʹ-концу последовательности в следующем порядке: экспрессионная кассета тяжелой цепи антитела, экспрессионная кассета легкой цепи антитела и экспрессионная кассета маркера селекции.

В одном варианте всех аспектов, заявленных в настоящем изобретении, экспрессионный вектор содержит

экспрессионную кассету первой легкой цепи антитела,

экспрессионную кассету второй легкой цепи антитела,

экспрессионную кассету первой тяжелой цепи антитела,

экспрессионную кассету второй тяжелой цепи антитела, и

экспрессионную кассету маркера селекции,

где одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела, одна из экспрессионных кассет легкой цепи антитела и экспрессионная кассета маркера селекции расположены однонаправленно, и

где однонапраленные экспрессионные кассеты расположены по направлению от 5ʹ- к 3ʹ-концу последовательности в следующем порядке: экспрессионная кассета тяжелой цепи антитела, экспрессионная кассета легкой цепи антитела и экспрессионная кассета маркера селекции.

В одном варианте одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую мутацию типа «впадина».

В одном варианте одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую мутацию типа «выступ».

В одном варианте одна из экспрессионных кассет легкой цепи антитела кодирует легкую цепь антитела, содержащую вариабельный домен легкой цепи антитела и домен СН1 тяжелой цепи антитела в качестве константного домена, и/или одна из экспрессионных кассет легкой цепи антитела кодирует легкую цепь антитела, содержащую вариабельный домен легкой цепи антитела и домен CL легкой цепи антитела в качестве константного домена.

В одном варианте одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую в качестве первого константного домена константный домен легкой цепи (CL), и/или одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую в качестве первого константного домена константный домен СН1 тяжелой цепи.

В одном варианте промотор hCMV имеет последовательность SEQ ID NO: 01. Это промотор hCMV без интрона А и без 5ʹ-НТО.

В одном варианте промотор hCMV имеет последовательность SEQ ID NO: 02. Это промотор hCMV без интрона А и с 5-НТО.

В одном варианте промотор hCMV имеет последовательность SEQ ID NO: 03. Это полноразмерный промотор hCMV с интроном А.

В одном варианте промотор фактора элонгации 1α человека имеет последовательность SEQ ID NO: 04. Это промотор hEFα без интрона А.

В одном варианте промотор фактора элонгации 1α человека имеет последовательность SEQ ID NO: 05. Это промотор hEFα с интроном А.

В одном варианте промотор фактора элонгации 1α человека имеет последовательность SEQ ID NO: 06. Это короткий промотор hEFα с интроном А и с 5ʹ-НТО.

В одном варианте промотор CMV крысы имеет последовательность SEQ ID NO: 07.

В одном варианте сигнальная последовательность полиА SV40 имеет последовательность SEQ ID NO: 08.

В одном варианте сигнальная последовательность полиА бычьего гормона роста имеет последовательность SEQ ID NO: 09.

В одном варианте терминатор гастрина человека имеет последовательность SEQ ID NO: 10.

В одном варианте промотор SV40 имеет последовательность SEQ ID NO: 11.

В одном варианте последовательность PEST орнитиндекарбоксилазы кодируется последовательностью SEQ ID NO: 12.

В одном варианте последовательность GFP кодируется последовательностью SEQ ID NO: 13.

В одном варианте маркер селекции для неомицина имеет последовательность SEQ ID NO: 14.

В одном варианте слитый полипептид GFP-PEST-NEO кодируется последовательностью SEQ ID NO: 15.

В одном варианте EMCV-IRES имеет последовательность SEQ ID NO: 16.

В одном варианте EV71-IRES имеет последовательность SEQ ID NO: 17.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Основные аспекты

Как известно специалисту в данной области техники, применение технологии рекомбинантной ДНК делает возможным получение множества производных нуклеиновой кислоты и/или полипептида. Такие производные могут быть, например, модифицированы в одной отдельной позиции или в разных позициях путем замещения, изменения, обмена, делеции или вставки. Данная модификация может быть, например, выполнена посредством сайт-направленного мутагенеза. Такие модификации могуть быть легко выполнены специалистом в данной области техники (см., например, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Нью-Йорк, США (1999)). Применение рекомбинантной технологии позволяет специалисту в данной области техники трансформировать различные клетки-хозяева гетерологичными нуклеиновыми кислотами. Хотя механизм транскрипции и трансляции, т.е. экспрессии, в различных клетках использует одинаковые элементы, клетки, принадлежащие к разным видам, могут иметь, помимо прочего, отличаться так называемой частотой использования кодонов. В связи с этим, идентичные полипептиды (по аминокислотной последовательности) могут кодироваться различными нуклеиновыми кислотами. Также, в связи с вырожденностью генетического кода, различные нуклеиновые кислоты могут кодировать один и тот же полипептид.

Применение технологии рекомбинантной ДНК позволяет создавать множество производных нуклеиновой кислоты и/или полипептида. Такие производные могут быть, например, модифицированы в одной отдельной или в нескольких позициях путем замещения, изменения, обмена, делеции или вставки. Данная модификация или создание производных могут быть, например, выполнены посредством сайт-направленного мутагенеза. Такие модификации могут быть легко выполнены специалистом в данной области техники (см., например, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Нью-Йорк, США (1999); Hames, B.D., and Higgins, S.J., Nucleic acid hybridization - a practical approach, IRL Press, Оксфорд, Англия (1985)).

Применение рекомбинантной технологии позволяет трансформировать различные клетки-хозяева гетерологичными нуклеиновыми кислотами. Хотя механизм транскрипции и трансляции, т.е. экспрессии, в различных клетках использует одинаковые элементы, клетки, принадлежащие к разным видам, могут иметь, помимо прочего, отличаться так называемой частотой использования кодонов. В связи с этим, идентичные полипептиды (по аминокислотной последовательности) могут кодироваться различными нуклеиновыми кислотами. Также, в связи с вырожденностью генетического кода, различные нуклеиновые кислоты могут кодировать один и тот же полипептид.

Определения

Термин антитело «с созревшей аффинностью» подразумевает антитело с одним или более изменениями в одном или более гипервариабельных районах (HVR) по сравнению с исходным антителом, которое не обладает такими изменениями; такие изменения приводят к улучению аффинности антитела к антигену.

Термин «антитело» в настоящем документе используется в широком смысле и охватывает различные структуры антител, влючая моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, но не ограничиваясь ими, при условии, что они демонстрируют желаемую антиген-связывающую активность.

Термин «фрагмент антитела» подразумевает молекулу, отличающуюся от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, Fv, Fab, Fabʹ, Fabʹ-SH, F(abʹ)₂; димерные антитела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антитела (например, scFv); и мультиспецифичные антитела, сформированные из фрагментов антител.

Термин «химерное» антитело подразумевает антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из одного источника или вида, тогда как оставшаяся часть тяжелой и/или легкой цепи получена из другого источника или вида.

Термин «класс» антитела подразумевает тип константного домена или константного района, который имеет его тяжелая цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и несколько из них могут быть подразделены на подклассы (изотипы), например IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ, и μ, соответственно.

Термин «экспрессия» в настоящем документе подразумевает процессы транскрипции и/или трансляции, происходящие внутри клетки. Уровень транскрипции интересующей последовательности нуклеиновой кислоты в клетке может быть определен на основе количества соответствующей мРНК, присутствующей в клетке. Например, мРНК, транскрибированная с интересующей последовательности, может быть количественно определена с помощью ПЦР в реальном времени или путем Нозерн-гибридизации (см. Sambrook et al., 1999, выше). Полипептиды, кодируемые интересующей нуклеиновой кислотой, могут быть количественно определены различными способами, например, с помощью ИФА, с помощью анализа на биологическую активность данного полипептида или путем применения методов анализа, не зависящих от подобной активности, таких как Вестерн-блоттинг или радиоиммуноанализ, с применением иммуноглобулинов, которые распознают данный полипептид и связываются с ним (см. Sambrook et al., 1999, выше).

Термин «экспрессионная кассета» подразумевает конструкцию, содержащую необходимые регуляторные элементы, такие как промотор и сайт полиаденилирования, для экспрессии в клетке, по меньшей мере, содержащейся в ней нуклеиновой кислоты.

Термин «экспрессионный вектор» обозначает нуклеиновую кислоту, имеющую все необходимые элементы для экспрессии содержащихся в ней структурных генов в клетке-хозяине. Как правило, экспрессионная плазмида содержит элемент для размножения плазмиды в клетках прокариот, например, в Е. coli, содержит точку начала репликации и маркер селекции, эукариотический маркер селекции и одну или более экспрессионных кассет для экспрессии интересующих структурных генов, каждая из которых содержит промотор, структурный ген и терминатор транскрипции, включая сигнал полиаденилирования. Экспрессия гена обычно находится под контролем промотора, и такой структурный ген называют «функционально связанным» с данным промотором. Аналогично, регуляторный элемент и коровый промотор являются функционально связанными, если регуляторный элемент модулирует активность корового промотора.

Термин «Fc-район» в настоящем документе используется для определения С-концевого района тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащего, по меньшей мере, часть константного района. Данный термин включает нативные последовательности Fc-районов и варианты Fc-районов. В одном варианте, Fc-район тяжелой цепи IgG человека располагается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc-района может присутствовать или может отсутствовать. Если в настоящем документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков Fc-района или константного района происходит согласно европейской (EU) системе нумерации, также называемой EU-индексом, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, Мэриленд 1991, NIH Publication 91-3242.

Термин «Fc-район» является хорошо известным и определяется на основе разрезания папаином тяжелой цепи антитела. В одном варианте комплексы, зявленные в настоящем документе, могут содержать в качестве полипептида шарнирного района тяжелой цепи антитела человеческий Fc-район или производное Fc-района человеческого происхождения. В другом варианте Fc-район представляет собой Fc-район человеческого антитела подкласса IgG4 или представляет собой Fc-район человеческого антитела подкласса IgG1, IgG2 или IgG3, который модифицирован таким образом, что не обнаруживает связывания с рецептором Fcγ (например, FcγRIIIa) и/или с C1q. В одном варианте Fc-район представляет собой Fc-район человека и, в частности, принадлежит к подклассу IgG4 человека или является мутантным Fc-районом из подкласса IgG1 человека. В одном варианте данный Fc-район принадлежит к подклассу IgG1 человека и содержит мутации L234A и L235A. Тогда как IgG4 демонстрирует сниженное связывание с рецептором Feγ (FcγIIIa), антитела других подклассов IgG демонстрируют сильное связывание с данным рецептором. Однако аминокислотные остатки Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (отсутствие углевода Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, и/или His435, в случае, если они изменены, также обеспечивают сниженное связывание с рецептором Fcγ (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, Α., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; ЕР 0307434). В одном варианте антитело для экспрессии согласно аспекту настоящего документа в отношении связывания с рецептором Fcγ относится к подклассу IgG4 или к подклассам IgG1 или IgG2 с мутацией в позиции L234, L235 и/или D265, и/или с мутацией PVA236. В одном варианте данные мутации представляют собой S228P, L234A, L235A, L235E, и/или PVA236 (PVA236 обозначает, что аминокислотная последовательность ELLG (приведена в однобуквенном аминокислотном коде) в аминокислотных позициях от 233 до 236 IgG1 или EFLG в IgG4 замещена на PVA). В одном варианте данные мутации представляют собой S228P в IgG4 и L234A и L235A в IgG1. Fc-район антитела непосредственно вовлечен в ADCC (антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность) и CDC (комплементзависимую цитотоксичность). Комплекс, который не связывает рецептор Fcγ и/или фактор комплемента C1q, не вызывает антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплементзависимую цитотоксичность (CDC). Модификация «выступа» обозначает мутацию T366W в домене СН3 антитела (нумерация в соответствии с Kabat). Модификация «впадины» обозначает мутации T366S, L368A и Y407V в домене СН3 антитела. В дополнение к модификациям «выступа» и «впадины» может присутствовать мутация S354C в одном домене СН3 и мутация Y349C в другом домене СН3.

Термин «каркасный район» или «FR» подразумевает аминокислотные остатки вариабельного домена, отличающиеся от остатков гипервариабельного района (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR в составе VH (или VL) обычно расположены в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «целое антитело» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего по существу сходную структуру со структурой нативного антитела или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc-район, как он определен в настоящем документе.

Термин «ген» обозначает нуклеиновую кислоту, являющуюся сегментом, например, хромосомы или плазмиды, которая может вызывать экспрессию пептида, полипептида или белка. Помимо кодирующего района, т.е. структурного гена, ген содержит другие функциональные элементы, например, сигнальную последовательность, промотор (промоторы), интроны и/или терминаторы.

Термины «клетка-хозяин», линия «клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и подразумевают клетки, в которые введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Термин клетка-хозяин включает «трансформантов» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированные клетки и полученное от них потомство независимо от количества пассажей. Потомство может быть не полностью идентично родительской клетке по составу нуклеиновых кислот, может содержать мутации. Мутантное потомство, обладающее теми же функциональными характеристиками или той же биологической активностью, которые отбирали или селектировали в изначально трансформированных клетках, также включено в данные термины.

Термин «человеческое антитело» означает антитело, имеющее аминокислотную последов