Технология изготовления макромолекулярных микросфер

Технология изготовления макромолекулярных микросфер

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Преимущество приоритета заявлено в отношении предварительной заявки США №60/762002, поданной 24 января 2006 г. под названием "Технология изготовления макромолекулярных микросфер". Там, где допустимо, эта заявка включена во всей своей полноте посредством ссылки.

Кроме того, данная заявка является родственной заявке США с серийным №11/657812 (дело патентного поверенного №21865-004001/6504, поданное 24 января 2007 г.). Данная заявка также является родственной публикациям США №№ US 20050004020 A1 и US 20050112751 A1. Там, где допустимо, каждая из этих заявок включена во всей своей полноте посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Введение белков животным, в том числе людям, в пищевых добавках или в качестве терапевтических средств уже известно в течение некоторого времени. Белки для терапевтического введения или введения с пищей обычно доступны либо в виде (1) концентратов или порошков, которые вводят непосредственно или разводят в выбранной жидкости перед применением; или (2) жидких препаратов.

Изготовление и доставка полезных терапевтических белков в форме порошка или частиц находится в сфере усиленной исследовательской и опытно-конструкторской деятельности в фармацевтической промышленности. Что касается терапевтической эффективности, то желательно иметь однородный препарат. Например, для введения в легкие, в идеальном случае белок получен в форме дискретных микросфер, представляющих собой твердые или полутвердые частицы с диаметром от 0,5 до 5,0 микрона. Также желательно, чтобы частицы имели как можно более высокое содержание белка и сохраняли свою активность для концентрированной доставки и терапевтической эффективности.

Предшествующие способы получения белковых микрочастиц или наночастиц включали такие сложные стадии, как смешивание с органическими полимерами и/или образование решетчатой матрицы с полимерами; распылительная сушка, распылительная сублимационная сушка или методы с использованием сверхкритических жидких антирастворителей, в которых используют специальное и сложное оборудование; или лиофилизация с последующим измельчением или размалыванием, которая часто приводит к получению неоднородных частиц, подлежащих дополнительной сортировке. Часто предшествующие способы изготовления твердых белковых препаратов включают такие стадии обработки, как нагревание, которое приводит к денатурации белка и нарушает его активность. Кроме того, некоторые способы не обеспечивают максимального извлечения из раствора в твердый препарат.

Соответственно, существует необходимость в способе получения белковых и других макромолекулярных микрочастиц, который не требует сложного или специального оборудования и который дает однородные по размеру микрочастицы для доставки. Кроме того, существует необходимость в способе получения микрочастиц, которые содержат высокие концентрации белка или макромолекул относительно других компонентов, которые стабильны и сохраняют свою активность в течение длительных периодов времени при их хранении при температуре окружающей среды и которые не содержат значительного количества денатурированного белка. Также существует необходимость в способе получения микрочастиц белков и других макромолекул, в которых по существу весь белок или макромолекула в исходном веществе переходит в препарат микрочастиц с минимальной потерей. Также существует необходимость в микрочастицах белков или других макромолекул, имеющих указанные свойства, для введения, например, в виде терапевтического средства или пищевой добавки.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предложены способы получения белковых и других макромолекулярных микрочастиц, которые не требуют сложного или специального оборудования и в которых дают однородные по размеру микрочастицы для доставки; способы получения микрочастиц, которые содержат высокие концентрации белка или макромолекул относительно других компонентов, которые стабильны и сохраняют свою активность в течение длительных периодов времени при хранении их при температуре окружающей среды и которые не содержат значительного количества денатурированного белка. Также предложены способы получения микрочастиц белков и других макромолекул, где по существу весь белок или макромолекула в исходном веществе переходит в препарат микрочастиц с минимальной потерей. Также предложены микрочастицы белков и других макромолекул, обладающих указанными свойствами, для введения, например, в виде терапевтического средства или пищевой добавки.

Способы изготовления композиции на основе белка, сами композиции на основе белка, комбинации и изделия, предложенные ниже, характеризуются различными ингредиентами, стадиями изготовления и биофизическими, физическими, биохимическими и химическими параметрами. Как будет очевидно специалисту в данной области техники, композиции и способы, предложенные в данном изобретении, включают любые и все изменения и комбинации ингредиентов, стадии и/или параметры, описанные ниже.

В данном изобретении предложены способы изготовления композиции на основе белка. Способ, предложенный в данном изобретении, может быть использован для изготовления композиций из других макромолекул помимо белков, включая ДНК, РНК, ПНК (пептидонуклеиновая кислота), липиды, олигосахариды и их комбинации.

Способы, предложенные в данном изобретении, могут включать стадии:

а) добавления противоиона к раствору, содержащему белок в водном растворителе;

б) добавления органического растворителя к данному раствору; и

в) постепенного охлаждения раствора до температуры ниже примерно 25°C, в результате чего образуется композиция, содержащая микрочастицы, содержащие белок, где стадии (а), (б) и (в) осуществляют одновременно, последовательно, с перерывами или в любом порядке.

В одном воплощении стадии осуществляют последовательно (а), (б) и затем (в). В другом воплощении способ изготовления композиции на основе белка включает осуществление стадий (а) и (б) одновременно или последовательно в любом порядке с последующим осуществлением стадии (в).

Образующиеся микрочастицы могут быть получены путем осаждения, разделения фаз или образования коллоида. В некоторых аспектах способы, предложенные в данном изобретении, также включают отделение микрочастиц от раствора для удаления компонентов, не являющихся микрочастицами. Эта стадия разделения может быть осуществлена после вышеупомянутой стадии (в). Разделение может быть осуществлено, например, посредством седиментации, фильтрации и/или сублимационной сушки.

Способы, предложенные в данном изобретении, включают добавление органического растворителя к водному растворителю, содержащему белок. В некоторых воплощениях органический растворитель смешивается или частично смешивается с водным растворителем. В других воплощениях способов, предложенных в данном изобретении, органический растворитель выбран из алифатических спиртов, ароматических спиртов, хлороформа, диметилхлорида, многоатомных сахарных спиртов, ароматических углеводородов, альдегидов, кетонов, сложных эфиров, простых эфиров, диоксанов, алканов, алкенов, конъюгированных диенов, дихлорметана, ацетонитрила, этилацетата, полиолов, полиимидов, полимеров сложных эфиров, полиальдегидов и их смесей. Например, если органический растворитель представляет собой алифатический спирт, то он может представлять собой изопропанол. В способах, предложенных в данном изобретении, количество добавленного органического растворителя может варьировать. Например, количество добавленного органического растворителя может составлять от примерно 0,1% или 0,1% до примерно 50% или 50% (об./об.). В других воплощениях количество добавленного органического растворителя составляет от примерно 1% или 1% до примерно 30% или 30% (об./об.), от примерно 5% или 5% до примерно 30% или 30% (об./об.), от примерно 10% или 10% до примерно 30% или 30% (об./об.) или от примерно 15% или 15% до примерно 20% или 20% (об./об.).

Противоион, используемый в способах, предложенных в данном изобретении, может представлять собой анионное соединение, катионное соединение и/или цвиттерионное соединение. Например, если противоион представляет собой анионное соединение, то он может быть глицином, цитратом натрия, сульфатом натрия, сульфатом цинка, сульфатом магния, сульфатом калия или сульфатом кальция. В способах, предложенных в данном изобретении, концентрация органического растворителя, добавленного к раствору, может варьировать. Например, концентрация противоиона, добавленного к раствору, может составлять от примерно 0,1 мМ или 0,1 мМ до примерно 100 мМ или 100 мМ. В других воплощениях концентрация противоиона, добавленного к раствору, составляет от примерно 0,2 мМ или 0,2 мМ до примерно 50 мМ или 50 мМ, от примерно 0,3 мМ или 0,3 мМ до примерно 30 мМ или 30 мМ, от примерно 0,5 мМ или 0,5 мМ до примерно 20 мМ или 20 мМ, или от примерно 1 мМ или 1 мМ до примерно 10 мМ или 10 мМ. В конкретном воплощении концентрация противоиона, добавленного к раствору, составляет примерно 5 мМ или 5 мМ.

В одном из аспектов способов, предложенных в данном изобретении, pH раствора, содержащего белок, равен или ниже pI белка. В некоторых аспектах pH раствора составляет от примерно 4,0 или 4,0 до примерно 9,0 или 9,0. В других аспектах pH раствора составляет от примерно 4,5 или 4,5 до примерно 8,0 или 8,0, от примерно 4,5 или 4,5 до примерно 6,5 или 6,5, или от примерно 4,5 или 4,5 до примерно 5,5 или 5,5.

Белок, который используется в предложенных в данном изобретении способах изготовления композиции на основе белка, может быть выбран из сиалидаз, сиалидазных слитых белков, протеаз, протеазных ингибиторов, цитокинов, инсулина, гормона роста человека, кальцитонина, рекомбинантной ДНКазы человека, интерферонов и паратиреоидного гормона. В одном воплощении, где белок представляет собой протеазный ингибитор, он представляет собой протеазный ингибитор 8 (PI8) человека. В другом воплощении белок представляет собой сиалидазный слитый белок. В некоторых аспектах, где белок представляет собой сиалидазный слитый белок, он содержит каталитический домен сиалидазы и якорный домен, причем каталитический домен сиалидазы в сиалидазном слитом белке является лишь частью сиалидазы. Сиалидаза может представлять собой, например сиалидазу Actinomyces viscosus, сиалидазу Clostridium perfringens, сиалидазу Arthrobacter ureafaciens, сиалидазу Micromonospora viridifeciens, сиалидазу Neu2 человека или сиалидазу Neu4 человека.

В одном из аспектов, где сиалидаза представляет собой сиалидазу Actinomyces viscosus, аминокислотная последовательность каталитического домена содержит последовательность аминокислотных остатков, начиная с любой из аминокислот от аминокислоты 270 до аминокислоты 290 и заканчивая любой аминокислотой от аминокислоты 665 до аминокислоты 901 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1. Например, в одном воплощении последовательность каталитического домена сиалидазы содержит последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:2. В другом воплощении последовательность каталитического домена содержит последовательность аминокислотных остатков, начиная с аминокислоты 274 и заканчивая аминокислотой 681 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1. В другом воплощении последовательность каталитического домена содержит последовательность аминокислотных остатков, начиная с аминокислоты 274 и заканчивая аминокислотой 666 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1. В другом воплощении последовательность каталитического домена содержит последовательность аминокислот, начиная с аминокислоты 290 и заканчивая аминокислотой 681 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов, где белок, используемый в предложенных в данном изобретении способах изготовления композиции на основе белка, представляет собой сиалидазный слитый белок, который содержит якорный домен, якорный домен представляет собой гликозаминогликан(GAG)-связывающий домен. В другом аспекте GAG-связывающий домен выбран из GAG-связывающего домена тромбоцитарного фактора 4 человека, GAG-связывающего домена интерлейкина 8 человека, GAG-связывающего домена антитромбина III человека, GAG-связывающего домена апопротеина Е человека, GAG-связывающего домена человеческого ангиогенез-ассоциированного белка, участвующего в миграции клеток (angio-associated migratory protein), и GAG-связывающего домена амфирегулина человека. В конкретных воплощениях аминокислотная последовательность GAG-связывающего домена содержит последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8.

В некоторых аспектах, где белок, используемый в предложенных в данном изобретении способах изготовления композиции на основе белка, представляет собой сиалидазный слитый белок, аминокислотная последовательность сиалидазного слитого белка содержит последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:9, последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:10, последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:11, последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:12, последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:13, последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:14, или последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:17.

В одном из аспектов количество белка в микрочастицах, получаемых способами, предложенными в данном изобретении, относительно общего количества белка в растворе со стадии (а) составляет от примерно 80% или 80% до более чем примерно 99% или 99%. В другом аспекте изготовленная композиция микрочастиц, изготовленная способами, предложенными в данном изобретении, также может содержать кислотоустойчивые покрывающие агенты, устойчивые к протеазам покрывающие агенты, энтеросолюбильные покрывающие агенты, наполнители, эксципиенты, неактивные ингредиенты, усилители стабильности, модификаторы вкуса и/или запаха или маскирующие агенты, витамины, терапевтические агенты, антиоксиданты, иммуномодуляторы, модификаторы трансмембранного транспорта, агенты, предотвращающие слеживание, хитозаны или усилители текучести.

Раствор и/или изготовленная композиция в соответствии со способами, предложенными в данном изобретении, в одном из аспектов могут дополнительно содержать активный агент. В некоторых воплощениях активный агент выбран из противодиабетических средств, противосудорожных средств, аналгетиков, противопаркинсонических средств, противовоспалительных средств, антагонистов кальция, анестетиков, противомикробных средств, противомалярийных средств, противопаразитарных средств, антигипертензивных средств, антигистаминов, жаропонижающих средств, альфа-адренергических агонистов, альфа-блокаторов, биоцидов, бактерицидных веществ, бронходилататоров, бета-адренергических блокирующих лекарственных средств, контрацептивов, сердечно-сосудистых лекарственных средств, ингибиторов кальциевых каналов, успокоительных средств, диагностических веществ, диуретиков, электролитов, ферментов, снотворных средств, гормонов, гипогликемических средств, гипергликемических средств, средств, способствующих мышечному сокращению, миорелаксантов, противоопухолевых средств, гликопротеинов, нуклеопротеинов, липопротеинов, офтальмических средств, транквилизаторов, седативных средств, стероидов, симпатомиметиков, парасимпатомиметиков, транквилизаторов, лекарственных средств для лечения мочевых путей, вакцин, вагинальных лекарственных средств, витаминов, минералов, нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, ангиотензин-превращающих ферментов, полинуклеотидов, полипептидов и полисахаридов. В другом воплощении активным агентом является пищевая добавка.

Способы, предложенные в данном изобретении, включают постепенное охлаждение раствора до температуры ниже примерно 25°C. В одном воплощении температура составляет от примерно 4°C до примерно -45°C. В другом воплощении температура составляет от примерно 2°C до примерно -20°C. В другом воплощении температура составляет от примерно 2°C до примерно -15°C. В другом воплощении температура лежит в интервале от примерно 0°C или 0°C до примерно -2°C или -2°C и от примерно -15°C или -15°C до примерно -20°C или -20°C. Постепенное охлаждение может быть осуществлено при разнообразных скоростях. Например, охлаждение может быть осуществлено со скоростью от примерно 0,01°C/мин или 0,01°C/мин до примерно 20°C/мин или 20°C/мин. В других воплощениях постепенное охлаждение осуществляется со скоростью от примерно или 0,05°C/мин либо примерно или 0,1°C/мин до примерно или 10°C/мин либо примерно или 15°C/мин, от примерно или 0,2°C/мин до примерно или 5°C/мин, или от примерно или 0,5°C/мин до примерно или 2°C/мин. В конкретном воплощении постепенное охлаждение осуществляется со скоростью примерно или 1°C/мин.

В одном из аспектов размер микрочастиц, изготовленных способами, предложенными в данном изобретении, составляет от примерно 0,001 мкм или 0,001 мкм до примерно 50 мкм или 50 мкм. В других воплощениях размер микрочастиц составляет от примерно 0,3 мкм или 0,3 мкм до примерно 30 мкм или 30 мкм, от примерно 0,5 мкм или 0,5 мкм до примерно 10 мкм или 10 мкм, от примерно 0,5 мкм или 0,5 мкм до примерно 5,0 мкм или 5,0 мкм, от примерно 1,0 мкм или 1,0 мкм до примерно 5,0 мкм или 5,0 мкм, или от примерно 1,0 мкм до примерно 2,0, 3,0, 4,0 или 5,0 мкм.

В некоторых аспектах способов, предложенных в данном изобретении, изготовленная композиция на основе белка имеет срок годности от примерно одной недели до примерно 1 месяца, от примерно 1 месяца до примерно шести месяцев, от примерно шести месяцев до примерно одного года, от примерно 1 года до примерно 2 лет, или от примерно 2 лет до примерно 5 лет при температуре примерно 55°C, 50°C, 45°C, 44°C, 42°C, 40°C, 39°C, 38°C, 37°C или ниже. 54. В другом аспекте содержание влаги в микрочастицах регулируют, в результате чего по меньшей мере примерно 90% активности белка сохраняется после хранения в течение от примерно шести месяцев до примерно 1 года при температуре примерно 25°C. В другом аспекте содержание влаги в микрочастицах регулируют, в результате чего по меньшей мере примерно 90% микрочастиц не агрегирует после хранения в течение от примерно шести месяцев до примерно 1 года при температуре примерно 25°C.

В конкретном аспекте способов, предложенных в данном изобретении, белок представляет собой слитый белок, содержащий каталитический домен сиалидазы и якорный домен, причем каталитический домен сиалидазы является лишь частью сиалидазы в слитом белке, органический растворитель добавлен в количестве от примерно 5% или 5% до примерно 20% или 20% (об./об.), противоион добавлен в количестве от примерно 1 мМ или 1 мМ до примерно 5 мМ или 5 мМ, а pH раствора доведен до величины от примерно 4,5 или 4,5 до примерно 5,5 или 5,5. В одном воплощении этого аспекта каталитический домен сиалидазы происходит из Actinomyces viscosus, и якорный домен представляет собой GAG-связывающий домен амфирегулина человека. Кроме того, pH составляет примерно 5,0 и/или противоион выбран из глицина, цитрата натрия, сульфата натрия, сульфата цинка, сульфата магния, сульфата калия или сульфата кальция. В другом воплощении этого аспекта органический растворитель представляет собой изопропанол. В одном воплощении этого аспекта изготовленная композиция содержит микрочастицы, содержащие белок в качестве единственного активного ингредиента (т.е. состоящие по существу из него). В другом воплощении способ включает отделение микрочастиц от раствора для удаления компонентов, не являющихся микрочастицами, например, седиментацией, фильтрацией и/или сублимационной сушкой.

В некоторых воплощениях этого аспекта содержание влаги в микрочастицах составляет от примерно 6% до примерно 12% или от примерно 7% до примерно 10,5%.

В данном изобретении предложены композиции, содержащие микрочастицы сиалидазы или сиалидазного слитого белка. Если белок представляет собой сиалидазный слитый белок, то он может содержать каталитический домен сиалидазы и якорный домен. В некоторых аспектах сиалидаза в композиции представляет собой сиалидазу Actinomyces viscosus, сиалидазу Clostridium perfringens, сиалидазу Arthrobacter ureafaciens, сиалидазу Micromonospora viridifaciens, сиалидазу Neu2 человека или сиалидазу Neu4 человека.

В одном из аспектов, где сиалидаза в композиции представляет собой сиалидазу Actinomyces viscosus, аминокислотная последовательность каталитического домена содержит последовательность аминокислот, начиная с любого из аминокислотных остатков от аминокислоты 270 до аминокислоты 290 и заканчивая любым из аминокислотных остатков от аминокислоты 665 до аминокислоты 901 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1. Например, последовательность каталитического домена может содержать последовательность аминокислот, начиная с аминокислоты 274 и заканчивая аминокислотой 681 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1, последовательность аминокислот, начиная с аминокислоты 290 и заканчивая аминокислотой 666 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1, или последовательность аминокислот, начиная с аминокислоты 290 и заканчивая аминокислотой 681 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1. В другом воплощении последовательность каталитического домена сиалидазы содержит последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:2.

В одном из аспектов, где композиция содержит микрочастицы сиалидазного слитого белка, якорный домен сиалидазного слитого белка представляет собой гликозаминогликан(GAG)-связывающий домен. В другом аспекте GAG-связывающий домен выбран из GAG-связывающего домена тромбоцитарного фактора 4 человека, GAG-связывающего домена интерлейкина 8 человека, GAG-связывающего домена антитромбина III человека, GAG-связывающего домена апопротеина Е человека, GAG-связывающего домена человеческого ангиогенез-ассоциированного белка, участвующего в миграции клеток, и GAG-связывающего домена амфирегулина человека. В конкретных воплощениях аминокислотная последовательность GAG-связывающего домена содержит последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8.

Сиалидазные слитые белки композиций, предложенных в данном изобретении, могут содержать, например последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:17.

Количество белка в микрочастицах композиций, предложенных в данном изобретении, может варьировать. Например, количество белка в микрочастицах может составлять от примерно 60% до более чем примерно 99% (масс./масс.). В одном воплощении количество белка в микрочастицах составляет от примерно 65% до примерно 90% (масс./масс.). В другом воплощении количество белка в микрочастицах составляет от примерно 70% до примерно 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% (масс./масс.). Количество белка в микрочастицах композиций, предложенных в данном изобретении, также может составлять от примерно 90% до примерно 99% (масс./масс.).

Микрочастицы в композициях, предложенных в данном изобретении, также могут содержать кислотоустойчивые покрывающие агенты, устойчивые к протеазам покрывающие агенты, энтеросолюбильные покрывающие агенты, наполнители, эксципиенты, неактивные ингредиенты, усилители стабильности, модификаторы вкуса и/или запаха или маскирующие агенты, витамины, терапевтические агенты, антиоксиданты, иммуномодуляторы, модификаторы трансмембранного транспорта, агенты, предотвращающие слеживание, хитозаны или усилители текучести.

В одном из аспектов композиции, предложенные в данном изобретении, также могут содержать активный агент. Активный агент может представлять собой пищевую добавку, противодиабетические средства, противосудорожные средства, аналгетики, противопаркинсонические средства, противовоспалительные средства, антагонисты кальция, анестетики, противомикробные средства, противомалярийные средства, противопаразитарные средства, антигипертензивные средства, антигистамины, жаропонижающие средства, альфа-адренергические агонисты, альфа-блокаторы, биоциды, бактерицидные вещества, бронходилататоры, бета-адренергические блокирующие лекарственные средства, контрацептивы, сердечно-сосудистые лекарственные средства, ингибиторы кальциевых каналов, успокоительные средства, диагностические вещества, диуретики, электролиты, ферменты, снотворные средства, гормоны, гипогликемические средства, гипергликемические средства, средства, способствующие мышечному сокращению, миорелаксанты, противоопухолевые средства, гликопротеины, нуклеопротеины, липопротеины, офтальмические средства, транквилизаторы, седативные средства, стероиды, симпатомиметические средства, парасимпатомиметические средства, транквилизаторы, лекарственные средства для лечения мочевых путей, вакцины, вагинальные лекарственные средства, витамины, минералы, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, ангиотензин-превращающие ферменты, полинуклеотиды, полипептиды и полисахариды.

Композиции, предложенные в данном изобретении, могут иметь срок годности различной продолжительности. В одном из аспектов срок годности составляет от примерно одной недели до примерно 1 месяца, от примерно 1 месяца до примерно шести месяцев, от примерно шести месяцев до примерно одного года, от примерно 1 года до примерно 2 лет, или от примерно 2 лет до примерно 5 лет при температуре примерно 55°C, 50°C, 45°C, 44°C, 42°C, 40°C, 39°C, 38°C, 37°C или ниже. В конкретном аспекте содержание влаги в микрочастицах регулируют, в результате чего по меньшей мере примерно 90% активности белка сохраняется после хранения в течение от примерно шести месяцев до примерно 1 года при температуре примерно 25°C.

Микрочастицы в композициях, предложенных в данном изобретении, также могут содержать противоион, такой как, например, анион, катион или цвиттерион. В некоторых воплощениях противоион выбран из глицина, цитрата натрия, сульфата натрия, сульфата цинка, сульфата магния, сульфата калия или сульфата кальция. Количество противоиона в микрочастице может варьировать. Например, количество противоиона в микрочастицах может составлять от примерно 0,5% или 0,5% до примерно 5% или 5% (масс./масс.), от примерно 0,5% или 0,5% до примерно 2% или 2% (масс./масс.), или от примерно 1% или 1% до примерно 2% или 2% (масс./масс.).

В некоторых воплощениях содержание влаги в микрочастицах в композициях, предложенных в данном изобретении, составляет от примерно 6% или 6% до примерно 12% или 12%, или от примерно 7% или 7% до примерно 10,5% или 10,5%.

Композиции, предложенные в данном изобретении, могут быть изготовлены в виде препаратов для многих способов введения. Например, композиции могут быть введены перорально, например путем проглатывания, внутривенно, интраназально, парентерально, подкожно или внутримышечно. Композиции также могут быть изготовлены в виде препаратов для легочного или офтальмического введения. В конкретном аспекте композиция, предложенная в данном изобретении, предназначена для ингаляции.

Композиции, предложенные в данном изобретении, могут быть получены в виде таблеток, каплет, гелей, ампул, предварительно заполненных шприцев, ингаляторов, электростатических устройств и других устройств для доставки. Доставляемая дозировка композиций может составлять от примерно 0,5 мг белка на дозу до примерно 100 мг белка на дозу, или примерно 0,75 мг, 1 мг, 1,5 мг, 2 мг, 3 мг, 5 мг, 10 мг, 15 мг, 20 мг, 30 мг, 40 мг, 45 мг, 50 мг, 55 мг или 60 мг белка на дозу. Частота введения дозы, например, для лечения или профилактики гриппа, может составлять от трех или более раз в сутки до двух раз в сутки, до одного раза в сутки, до двух раз в неделю, до одного раза в неделю, до одного раза каждые две недели или реже, чем один раз каждые две недели. В целях профилактики введение обычно может быть осуществлено порядка примерно один раз каждые две недели или с меньшей частотой, как, например, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели или дольше.

Размер микрочастиц в композициях, предложенных в данном изобретении, может варьировать. Например, размер микрочастиц может составлять от примерно 0,001 мкм или 0,001 мкм до примерно 50 мкм или 50 мкм. В некоторых воплощениях размер микрочастиц составляет от примерно 0,3 мкм или 0,3 мкм до примерно 30 мкм или 30 мкм, от примерно 0,5 мкм или 0,5 мкм до примерно 10 мкм или 10 мкм, от примерно 0,5 мкм или 0,5 мкм до примерно 5,0 мкм или 5,0 мкм, от примерно 1,0 мкм или 1,0 мкм до примерно 5,0 мкм или 5,0 мкм, или от примерно 1,0 мкм до примерно 2,0, 3,0, 4,0 или 5,0 мкм.

Кроме того, в данном изобретении предложены изделия, включающие композицию, содержащую микрочастицы сиалидазы или сиалидазного слитого белка, упаковочный материал для композиции и этикетку, на которой указано, что данная композиция предназначена для терапевтического показания. В одном воплощении терапевтическим показанием является грипп. Изделие также может включать ингалятор для легочного введения композиции. В некоторых воплощениях ингалятор представляет собой сухой порошковый ингалятор, дозирующий ингалятор или электростатическое устройство для доставки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

А. Определения

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в данной области техники, к которой относится изобретение (я). Все патенты, заявки на патент, опубликованные заявки и публикации, последовательности из Genbank, веб-сайты и другие опубликованные материалы, на которые приведены ссылки во всем описании данного изобретения, если не указано иное, включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае, если имеется множество определений для приведенных в данном описании терминов, доминирующими являются приведенные в данном разделе. Если делается ссылка на URL (определитель местонахождения ресурса) или другой такой идентификатор или адрес, то понятно, что такие идентификаторы могут меняться, а конкретная информация из интернета может приходить и уходить, однако эквивалентную информацию можно найти путем поиска в интернете. Ссылка на нее служит доказательством доступности и публичного распространения такой информации.

Используемый в данном описании термин "макромолекула" применяется для обозначения молекулы, состоящей из двух или более мономерных субъединиц или их производных, которые соединены связью, или любой макромолекулы, которая может образовывать третичную структуру. Макромолекула может представлять собой, например, полинуклеотид, молекулы нуклеиновых кислот, включая ДНК, рНК и пептидонуклеиновую кислоту (ПНК), полипептид, белок, углевод или липид, или их производные или комбинации, например, молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую часть пептидонуклеиновой кислоты или гликопротеин, соответственно. Способы, композиции, комбинации, наборы и изделия, предложенные в данном изобретении, хотя они описаны со ссылкой на белки, могут быть адаптированы для применения с другими макромолекулами, которые определены и предложены в данном изобретении.

Термин "по существу" или "существенный", используемый в данном описании, обычно означает по меньшей мере примерно 60% или 60%, примерно 70% или 70%, либо примерно или ровно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или выше относительно ссылочного соединения, такого как, например, нуклеиновокислотная или белковая последовательность, или первоначального состава объекта. Таким образом, композиция, содержащая микрочастицы, отделенные "по существу" от всех других примесей и/или ингредиентов, включая противоионы, соли и растворители из коктейль-раствора, подразумевает, что по меньшей мере примерно 60% или 60%, примерно 70% или 70%, либо примерно или ровно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокие количества примесей и/или реагентов удалены из коктейль-раствора, в котором образуются микрочастицы. Термин "по существу идентичный" или "по существу гомологичный" или "аналогичный" варьирует в контексте понимания специалистами в релевантной области техники и обычно означает идентичность по меньшей мере примерно на 60% или 60%, примерно 70% или 70%, либо примерно или ровно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше.

Термин "состоит по существу из" или "состоящий по существу из", используемый в данном описании, относится к объекту, из которого удалены или от которого отделены по существу все другие компоненты/ингредиенты, не ассоциирующиеся с данным объектом или его свойствами. Таким образом, композиция "состоящая по существу из микрочастиц" означает, что все другие ингредиенты, такие как примеси и растворители, по существу удалены из раствора/суспензии, содержащего/содержащей микрочастицы.

Термин "микрочастица", используемый в данном описании, является взаимозаменяемым с термином "микросфера" и относится к частицам с размером в диапазоне (средняя длина, ширина или диаметр) от примерно или 0,001 микрона (мкм) до примерно или 500 микрон, которые содержат макромолекулу и доставляют интересующий агент, такой как лекарственное средство или пищевая добавка, субъекту. Агент может представлять собой макромолекулу, например, белок, нуклеиновую кислоту, липид или полисахарид, или макромолекула, образующая микрочастицу, может представлять собой носитель для активного агента, такого как лекарственное средство или пищевая добавка. Микрочастицы также могут содержать синтетические макромолекулы, включая полимеры, такие как полиэтиленгликоль (PEG), полимолочная кислота (PLA), сополимер полимолочной и полигликолевой кислот (PLGA), и природные полимеры, такие как альбумин, желатин, хитозан и декстран. "Микрочастицы", которые описаны в данном изобретении, могут состоять и могут быть изготовлены только из одной конкретной природной или синтетической макромолекулы, или из более чем одного типа той же природной или синтетической макромолекулы (например, более чем одного типа белка), или из комбинаций более чем одного другого типа природной или синтетической макромолекулы (например, белка и нуклеиновой кислоты или белка и синтетического полимера).

Кроме того, термин "микрочастица", используемый в данном описании, обычно относится к частице, которая не является твердой формой самого раствора, из которого ее получают, хотя замороженные и/или высушенные частицы раствора, содержащего макромолекулы, также охватываются данным изобретением. Скорее, микрочастица, как использовано в данном описании, обычно представляет собой ансамбль фракции компонентов раствора, включая соли, противоионы, растворители и другие ингредиенты, который образуется в результате процесса, включающего осаждение, седиментацию, разделение фаз и образование коллоида, но не ограничивается этим.

Термин "осаждение", используемый в данном описании, относится к процессу, в результате которого интересующее растворенное вещество или растворенные вещества в растворе, такие как компоненты микрочастицы, больше не остаются в растворе, а образуют фазу, которая отделена от растворителя или растворителей, используемых для образования раствора. Осаждение микрочастицы и регулирование размера осажденной микрочастицы может быть осуществлено различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, регулирование температуры, ионной силы, pH, диэлектрической постоянной, концентрации противоиона, концентрации органического растворителя, добавление полиэлектролитов или полимеров, поверхностно-активных веществ, детергентов или их комбинаций.

Термин "разделение фаз", используемый в данном описании, относится к превращению одной гомогенной фазы, такой как раствор, в две или более фаз, такой как суспензия твердых частиц в растворителе или растворе.

Термин "седиментация", используемый в данном описании, относится к движению частиц, таких как микрочастицы, которые находятся в суспензии в жидкости или которые образуются в растворе в ответ на внешнюю силу, такую как сила тяжести, центробежная сила или сила электрического поля.

Термин "раствор" используется в данном описании взаимозаменяемо с термином "коктейль-раствор" и относится к гомогенной смеси двух или более ингредиентов в одной фазе, твердой, жидкой или газообразной, в которой отдельные ингредиенты распознаются только на молекулярном уровне. Раствор может представлять собой жидкость, в которой одно или более растворенных веществ, таких как соли, раст