Антитела к биотину и способы их применения

Антитела к биотину и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к антителам к биотину, производным антител к биотину и способам их применения. Предшествующий уровень техники

Гаптен-связывающие антитела могут быть применены в качестве захватывающих модулей для терапевтических и диагностических применений. Например, гаптен-связанные соединения, такие как флуорофоры, хелатообразующие реагенты, пептиды, нуклеиновые кислоты, белки, липиды, наночастицы и многие другие агенты могут реагировать с гаптен-связывающими антителами и производными антитела. Это делает возможным эффективную детекцию таких «нагрузок», а также захватывание, аккумуляцию в желаемых положениях, перекрестную сшивку и другие эффекты, опосредованные антителами. Поскольку свойства и композиция гаптенов могут влиять на композицию и «поведение» гаптен-связанных соединений (включая размер, растворимость, активность, биофизические свойства, фармакокинетику, биологические эффекты и более), крайне желательно разработать ряд различных гаптен-связывающих соединений. Поэтому, возможно совместить выбранный гаптен с заданной нагрузкой для получения оптимизированных гаптеновых конъюгатов. Впоследствии, оптимальные гаптен-связывающие соединения могут быть скомбинированы с упомянутыми конъюгатами для получения оптимальных сочетаний антитело-гаптен-нагрузка. В дальнейшем желательно иметь гаптен-связывающие соединения, такие как производные антител, которые гуманизированы. Это делает возможным применения со значительно сниженным риском интерференции, таким как иммунногеность при терапевтических применениях. Антитела, описанные в данном документе, связывают производные биотина (но не немодифицированный биотин). Данные антитела названы в данном документе «биотин-связывающими» антителами или «антителами к биотину».

В WO 00/50088 описаны комплексы биотинилированный хемокин-антитело.

Kohen, F., et al., сообщает о получении и свойствах антител к биотину (Methods Enzymol. 279 (1997) 451-463. Bagci, H., et al. сообщают, что моноклональные антитела к биотину имитируют авидность в распознавании биотина (FEBS Lett. 322 (1993) 47-50). Cao, Y., et al., сообщают о разработке биспецифичных моноклональных антител в качестве универсальной иммунопробы для детекции биотинилированных макромолекул (J. Immunol. Meth. 220 (1998) 85-91).

В WO 01/34651 описаны антитела, связывающие энантиомер неестественного происхождения (L-Биотин) и их другое применение в качестве направляющих агентов.

Dakshinamurti et al. сообщают о продукции и характеристике моноклонального антитела к биотину (Biochem. J. 237 (1986) 477-482). Сравнение присоединения биотина и биотинилированных макромолекулярных лигандов к моноклональному антителу к биотину и к стрептовидину описано Vincent, P., et al. (J. Immunol. Meth. 165 (1993) 177-182). Berger, M., et al. (Biochem. 14 (1975) 2338-2342) сообщают о продукции антител, связывающих биотин и ингибирующих ферменты, содержащие биотин.

Краткое описание изобретения

Данное изобретение предлагает антитела к биотину и антитела к производным биотина, а также способы их применения.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой гуманизированное антитело к биотину, где антитело включает (a) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (b) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и (с) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Данное антитело специфически связывается с биотином.

В одном воплощении антитело дополнительно включает (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09, (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (с) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

В одном воплощении антитело дополнительно включает (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и (с) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

В одном воплощении антитело включает в позиции 24 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток серина или/и включает в позиции 73 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток треонина.

В одном воплощении антитело включает в позиции 60 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток аланина и в позиции 61 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток глутамина.

В одном воплощении антитело (1) включает в позиции 24 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток серина или/и включает в позиции 73 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток треонина, (2) включает в позиции 60 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток аланина, и (3) включает в позиции 61 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, аминокислотный остаток глутамина.

В одном воплощении антитело включает (a) VH-последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12; (b) VL-последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или (с) VH-последовательность как в (а) и VL-последовательность как в (b), где аминокислотный остаток в позиции 24 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, представляет собой серии или/и аминокислотный остаток в позиции 73 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, представляет собой треонин, и аминокислотный остаток в позиции 60 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, представляет собой аланин, и аминокислотный остаток в позиции 61 вариабельного домена тяжелой цепи, пронумерованной согласно Kabat, представляет собой глутамин.

В одном воплощении антитело включает VH-последовательность SEQ ID NO: 12.

В одном воплощении антитело включает VL-последовательность SEQ ID NO: 16.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой антитело, включающее VH-последовательность SEQ ID NO: 12 и VL последовательность SEQ ID NO: 16.

В одном воплощении антитело представляет собой полноразмерное антитело IgG1 или полноразмерное антитело IgG4.

В одном воплощении антитело представляет собой моноклональное антитело.

В одном воплощении антитело представляет собой фрагмент антитела, который связывается с биотином.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой фармацевтический препарат, включающий антитело, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой антитело, как описано в данном документе, для применения в качестве лекарственного препарата.

Один аспект настоящего изобретения, как описано в данном документе, представляет собой применение антитела, как описано в данном документе, при производстве лекарственного препарата.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1: экспрессия гуманизированного антитела, связывающего биотин и производные биотина, с и без мутации cys для ковалентного присоединения нагрузки: восстанавливающий и невосстанавливающий ДСН-ПААГ-электрофорез демонстрирует композицию и гомогенность гуманизированных антител после очистки при помощи белка А и гель-фильтрационной хроматографии. H-цепи антитела (более высокий бэнд 50 кДа) и L-цепи (более низкий бэнд 25 кДа) детектируемы в качестве уникальных бэндов во фракциях очищенных при помощи гель-фильтрационной хроматографии обоих производных антител без присутствия видимых количеств контаминаций дополнительным белком.

Фигура 2: белковую структуру мышиного Fab-фрагмента антитела к биотину определяли в комплексе с биоцитинамидом: комплексированный гаптен расположен в непосредственной близости от отрицательно заряженного кластера аминокислот; биотин которого - в качестве гаптена - является производным присоединения нагрузки и его карбоксильная группа связывается с хорошей эффективностью, поскольку в данном положении отсутствует отталкивание зарядов (из-за утраты COOH-группы); для сравнения, свободный (обычный) биотин не может эффективно связываться с антителом, поскольку его карбоксильная группа будет в непосредственной близости от данного отрицательно заряженного кластера, и таким образом будет отталкиваться.

Детальное описание воплощения изобретения

I. Определения

"Акцепторный человеческий каркас" для целей данного документа представляет собой каркас, включающий аминокислотную последовательность каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), полученный из каркаса иммуноглобулина человека или человеческого консенсусного каркаса, как определено ниже. Акцепторный человеческий каркас, "полученный из" каркаса иммуноглобулина человека или человеческого консенсусного каркаса может включать его аминокислотную последовательность или может включать изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях, число аминокислотных замен составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В некоторых воплощениях VL-последовательность акцепторного человеческого каркаса является идентичной VL-последовательности каркаса иммуноглобулина человека или последовательности человеческого консенсусного каркаса.

«Аффинность» относится к силе общего количества нековалентных взаимодействий между единственным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, как употреблено в данном документе, «аффинность связывания» относится к истинной аффинности связывания, отражающей 1:1 взаимодействия между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X для ее партнера Y обычно может быть представлена при помощи константны диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерена обычными способами, хорошо известными в области техники, включая таковые, описанные в данном документе. Конкретные иллюстративные и типичные воплощения для оценки аффинности связывания описаны в далее.

Антитело с «созревшей аффинностью» относится к антителу с одним или более изменением в одном или более гипервариабельном участке (HVR), по сравнению с родительским антителом, которое не обладает такими изменениями, такие изменения приводят к улучшению аффинности антитела для антигена.

Термины «антитело к биотину» и «антитело, связывающееся с биотином» относятся к антителу, способному к связыванию с биотином с достаточной аффинностью, такой, что антитело полезно в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на биотин. В одном воплощении степень связывания антитела к биотину с неродственным небиотиновым белком, составляет менее приблизительно 10% связывания антитела с биотином, как измерено, например, посредством радиоиммунологического анализа (РИА). В конкретных воплощениях антитело, которое связывается с биотином, обладает константой диссоциации (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 M до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М).

Термин «антитело» в данном документе применяют в самом широком смысле, и он охватывает различные структуры антител, включая, но не ограничено, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую антиген-связывающую активность.

«Фрагмент антитела» относится к молекуле другой нежели интактное антитело, которая включает часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, который связывается с интактным антителом. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничены, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диантитела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител (например, scFv); и мультиспецифичные антитела, полученные из фрагментов антител.

«Антитело, связывающееся с таким же эпитопом», что и референсное антитело, относится к антителу, которое блокирует связывание референсного антитела с антигеном в анализе конкурентного связывания на 50% или более, или наоборот, референсное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в анализе конкурентного связывания на 50% или более. Пример анализа конкурентного связывания предложен в данном документе.

Термин «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из отдельного источника или вида, в то время как оставшаяся часть тяжелой или легкой цепи получена из другого источника или вида.

«Класс» антитела относится к типу константного домена или константного участка содержащей его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IGA₂. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов называют α, δ, ε, γ и μ соответственно.

Термин «цитотоксический агент», как употреблено в данном документе, относится к веществу, ингибирующему или предотвращающему клеточную функцию и/или вызывающему гибель клетки или деструкцию. Цитотоксические агенты включают, но не ограничены, радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu); хемотерапевтические агенты или лекарственные средства (например, метотриксат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мельфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты ингибирующие рост; их ферменты и фрагменты, такие как нуклеотидные ферменты; антибиотики; токсины, такие как небольшие молекулы токсинов или ферментативно активные токсины бактерий, грибов, растений или животных, включая фрагменты и/или их варианты; и различные противоопухолевые и противораковые агенты, раскрытые ниже.

«Эффекторные функции» относятся к таковым биологическим активностям, свойственным Fc-участку антитела, которые варьируют в зависимости от класса антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: C1q связывание и комплемент зависимую цитотоксичность (CDC); Fc-рецепторное связывание; антитело-зависимую клеточное-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию поверхностных клеточных рецепторов (например, В-клеточного рецептора); и В-клеточную активацию.

«Эффективное количество» агента, например, фармацевтического препарата относится к количеству эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического и профилактического результата.

Термин «Fc-участок» в данном документе употребляют для определения C-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина, которая включает по меньшей мере часть константного участка. Термин включает природную последовательность Fc-участков и вариантные Fc-участки. В одном воплощении Fc-участок тяжелой цепи IgG простирается от Cys226, или от Pro230, до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако C-концевой лизин (Lys447) Fc-участка может присутствовать или нет. Если не указано иное, в данном документе нумерация аминокислотных остатков в Fc-участке или константном участке соответствует европейской системе нумерации, также называемой EU index, как описано в Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th éd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

«Каркас» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена иным нежели чем остаткам гипервариабельного домена (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно последовательности HVR и FR обычно представлены в следующей последовательности в VH (или VL): FR1-Н1 (L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «целое антитело» применяют в данном документе взаимозаменяемо в отношении антитела, имеющего структуру в значительной степени сходную со структурой нативного антитела или имеющего тяжелые цепи, которые включают Fc-участок как определено в данном документе.

Термины «хозяйская клетка», «хозяйская клеточная линия» и «хозяйская клеточная культура» употребляют взаимозаменяемо и в отношении клеток, в которые введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомков таких клеток. Хозяйские клетки включают «трансформантов» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированную клетку и потомство, полученное от нее, без относительно числа пассажей. Потомство может быть не полностью идентичным по нуклеокислотному составу родительской клетке, и могут содержать мутации. Мутантное потомство, обладающее такой же функцией или биологической активностью в виде скринированных или выбранных в исходно трансформированной клетке включены в данный документ.

«Человеческое антитело» представляет собой антитело, обладающее аминокислотной последовательностью, соответствующей таковой антитела, продуцированного человеком или человеческой клеткой, или полученное из источника, не являющегося человеком, который использует спектры человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела. Данное определение человеческого антитела определенно не включает гуманизированное антитело, включающее нечеловеческие антиген-связывающие остатки.

«Человеческий консенсусный каркас" представляет собой каркас, который содержит наиболее распространенные при селекции каркасных последовательностей VL или VH человеческого иммунноглобулина. Обычно селекцию последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека проводят из подгруппы последовательностей вариабельного домена. Обычно подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу как в Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. В одном воплощении, для VL, подгруппа представляет собой подгруппу каппа I как в Kabat et al., выше. В одном воплощении для VH, подгруппа представляет собой подгруппу III как в Kabat et al., выше.

«Гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, включающему аминокислотные остатки нечеловеческого антитела HVRs и аминокислотные остатки человеческих FRs. В определенных воплощениях, гуманизированное антитело будет включать практически все из по меньшей мере одного и обычно двух, вариабельных доменов, в которых все или практически все HVRs (например, CDRs) соответствуют таковым нечеловеческого антитела и все или практически все FRs соответствуют таковым человеческого антитела. Гуманизированное антитело может включать по меньшей мере часть константного участка антитела, полученного из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое было подвергнуто гуманизации.

Термины «гипервариабельный участок» или «HVR», как употреблено в данном документе, относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, который является гипервариабельным в последовательности и/или формирует структурно определенные петли («гипервариабельные петли»). Обычно нативные четырехцепочечные антитела включают шесть HVR; три в VH (Н1, Н2, Н3), и три в VL (L1, L2, L3). HVR обычно включают аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из «участков, определяющих комплементарность» (CDRs), последние являются наиболее вариабельными и/или вовлечены в распознавание антигена. Например, гипервариабельные петли, возникают в аминокислотных остатках 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3). (Chothia, С. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Например, CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) возникают в аминокислотных остатках 24-34 L1, 50-56 L2, 89-97 L3, 31-35В Н1, 50-65 Н2 и 95-102 Н3. (Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.). За исключением CDR1 в VH, CDR обычно включают аминокислотные остатки, которые формируют гипервариабельные петли. CDR также включают «остатки, определяющие специфичность» или «SDR», которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR заключены внутри участков CDR, называемых укороченные-CDRs, или a-CDR. Например, a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) возникают в аминокислотных остатках 31-34 L1, 50-55 L2, 89-96 L3, 31-35 В Н1, 50-58 Н2 и 95-102 H3. (См. Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). Если не указано иное, HVR остатки и другие остатки в вариабельном домене (например, FR остатки) пронумерованы в данном документе согласно Kabat et al., выше.

«Иммунноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более гетерологичной молекулой(ми), включая, но не ограничено, цитотоксический агент.

«Индивидуум» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающее включает, но не ограничено, одомашненных животных (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматов (например, люди и приматы, не являющиеся человеком, такие как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы). В конкретных воплощениях, индивидуум или субъект представляет собой человека.

«Изолированное» антитело представляет собой таковое, отделенное от компонента его естественного окружения. В некоторых воплощениях, антитело очищают до свыше 95% или 99% чистоты, как определено, например, электрофоретически (например, ДСН-ПААГ-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование (IEF), капиллярный электрофорез) или хроматографически (например, ионнообменная или обратнофазовая ВЭЖХ). Для обзора способов оценки чистоты антитела, см., например, Flatman, S., et al., J. Chrom. В 848 (2007) 79-87.

«Изолированная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, отделенной от компонента ее естественного окружения. Изолированная нуклеиновая кислота включает молекулу, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно и в участке хромосомы, отличном от ее естественного расположения.

«Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к биотину» относится к одной или более молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую и легкую цепи антитела (или их фрагменты, включая такую молекулу(ы) нуклеиновой кислоты в единственном векторе или в различных векторах и такая молекула(ы) нуклеиновой кислоты присутствует в одном или более участке в хозяйской клетке.

Термин «моноклональное антитело», как употреблено в данном документе относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. популяции, содержащей отдельные антитела, которые идентичны и/или связывают один и тотже эпитоп, исключая возможные варианты антител, например, содержащие естественные мутации или мутации, возникающие в течение продукции препарата моноклональных антител, такие варианты обычно присутствуют в минорных количествах. По сравнению с препаратами поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопы), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител специфично к единственной детерминанте на антигене. Таким образом, модификатор «моноклональное» означает характер антитела в качестве полученных из по существу гомогенной популяции антител, и не рассматриваются как требующие продукции антител каким-либо особым способом. Например, моноклональные антитела, подлежащие применению согласно настоящему изобретению, могут быть получены посредством ряда техник, включая, но не ограничено гибридомный способ, способы рекомбинантной ДНК, способы фагового отображения и способы с применением трансгенных животных, содержащие все или часть локусов иммуноглобулина человека, такие способы и другие примерные способы получения моноклональных антител описаны в данном документе.

«Голые антитела» относятся к антителу, которое не конъюгировано с гетерологичной группой (например, цитотоксичная группа) или радиоактивно меченной. Голое антитело может присутствовать в фармацевтическом препарате.

«Нативные антитела» относятся к молекулам иммунноглобулина естественного происхождения с различными структурами. Например, нативные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые дисульфидно связаны. От N- к С-концу, каждая тяжелая цепь имеет вариабельный участок (VH), также называемый тяжелым вариабельным доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, с последующими тремя константными доменами (СН1, СН2 и СН3). Аналогично, от N- к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельный участок (VL), также называемый вариабельный легкий домен или вариабельный домен легкой цепи, с последующим константным легким доменом (CL). Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному или двум типам, называемым каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности его константного домена.

Термин «аннотация» употреблен в данном документе в отношении инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию об обозначениях, применениях, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или опасности применения таких терапевтических продуктов.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» в отношении референсной полипептидной последовательности определяют в качестве процента аминокислотных остатков в интересующей последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в референсной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения пропусков, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности, и без рассмотрения каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения идентичности аминокислотной последовательности может быть проведено различными путями, известными специалистам в области техники, например, с применением общедоступного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN или программного обеспечения Megalign (DNASTAR). Специалисты в области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине последовательностей. Подлежащих сравнению. Для целей данного документа, однако значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают при помощи компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Авторские права на компьютерную программу ALIGN-2 принадлежат Genentech, Inc., и программный код зарегистрирован при помощи пользовательской документации в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна от Genentech, Inc., South San Francisco, California, или может быть составлена при помощи программного кода. Программа ALIGN-2 должна быть составлена для применения на операционной системе UNIX, включая Digital UNIX V4.0D. все параметры сравнения последовательностей установлены программой ALIGN-2 и неизменны.

В ситуациях, когда ALIGN-2 применяют для сравнений аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотной последовательности заданной аминокислотной последовательности А по отношению к, с или против заданной аминокислотной последовательности В (которая альтернативно может быть сформулирована в качестве заданной аминокислотной последовательности А, которая обладает или включает определенный % идентичности аминокислотной последовательности в отношении к, с или против заданной аминокислотной последовательности В) вычисляют следующим образом:

100 × дробь X/Y

где X представляет собой число аминокислотных остатков, оцененное в качестве идентичных пар посредством программы для сравнения последовательностей ALIGN-2, в которой программное выравнивание А и В, и где Y представляет собой общее число аминокислотных остатков в B. Следует понимать, что в случае, когда длина аминокислотной последовательности А не эквивалентна длине аминокислотной последовательности В, % идентичности аминокислотной последовательности А к В не будет эквивалентен % идентичности аминокислотной последовательности В к А. Если специально не указано иное, все значения % идентичности аминокислотной последовательности, употребленные в данном документе, получены в качестве описанных в непосредственно предшествующем абзаце при помощи компьютерной программы ALIGN-2.

Термин «фармацевтический препарат» относится к препарату, который присутствует в форме, делающей биологическую активность, содержащегося в нем активного ингредиента эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, неприемлемо токсичных для субъекта, которому вводят препарат.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтическом препарате, другому нежели активный ингредиент, нетоксичный для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничен, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

Термин «биотин», как употреблено в данном документе, означает 5-[(3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1Н-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил]пентановую кислоту. Биотин также известен как витамин H или коэнзим R.

Как употреблено в данном документе «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «лечение») относятся к клиническому вмешательству в попытке изменить естественное развитие индивидуума, подлежащего лечению, и может быть выполнено или для профилактики или в течение развития клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, но не ограничены, предотвращение возникновения или рецидива заболевания, облегчение симптомов, уменьшение каких-либо прямых или непрямых патологических следствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогресса заболевания, ослабление или временное улучшение состояния заболевания, и ремиссию или улучшенный прогноз. В некоторых воплощениях, антитела по изобретению применяют для приостановки развития заболевания или замедления прогресса заболевания.

Термин «вариабельный участок» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, вовлеченному в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, с каждым доменом, включающим четыре консервативных каркасных участка (FRs) и три гипервариабельных региона (HVRs). (См., например, Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91). Одного VH или VL домена может быть достаточно для обеспечения антиген-связывающей специфичности. Более того, антитела, которые связывают конкретный антиген, могут быть изолированы при помощи VH или VL домена из антитела, связывающего антиген для скрининга библиотеки комплементарности VL или VH доменов, соответственно. См., например, Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628).

Термин «вектор», как употреблено в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной распространять другую аминокислоту, с которой связан. Термин включает вектор в качестве самореплицирующийся нуклеокислотной структуры, а также вектор, встроенный в геном хозяйской клетки, в которую он был введен. Определенные вектора способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие вектора относят в данном документе к «экспрессионным векторам».

Термин «гаптен» означает небольшую молекулу, которая может вызывать иммунный ответ только будучи прикрепленной к большому носителю, такому как белок. Примеры гаптенов представляют собой анилин, о-, m- и п-аминобензойную кислоту, хинон, гидралазин, галотан, флуоресцеин, биотин, дигоскигенин, теофиллин и динитрофенол. В одном воплощении гаптен представляет собой биотин или дигоксигенин или теофиллин или карборан.

Термин «гаптен, конъюгированный с» или «гаптенилированное соединение» означает гаптен, ковалентно связанный с дополнительной группой, такой как полипептид или метка. Активированные производные гаптена часто применяют в качестве исходных материалов для образования таких конъюгатов. В одном воплощении гаптен представляет собой дигоксигенин и конъюгирован (в одном воплощении через его 3-гидрокси группу) с группой через линкер. В одном воплощении линкер содержит а) один или более (в одном воплощении три-шесть) метилен-карбокси-метильных групп (-СН₂-C(O)-), и/или b) от 1 до 10 (в одном воплощении от 1 до 5) аминокислотных остатков (в одном воплощении, выбранных из глицина, серина, глутамата, β-аланина, γ-аминобутировой кислоты, ε-аминокопроновой кислоты или лизина), и/или с) один или более (в одном воплощении один или два) соединения, обладающих структурной формулой NH₂-[(CH₂)_nO]_xCH₂-CH₂-COOH, в которой n представляет собой 2 или 3 и x представляет собой 1-10, в одном воплощении 1-7. Последний элемент дает (по меньшей мере частично) линкер (часть) формулы -ΝΗ-[(СН₂)_nO]_хСН₂-CH₂-С(O)-. Одним из примеров такого соединения является, например, 12-амино-4,7,10-триоксадодекановая кислота (дает TEG (триэтиленгликолевый) линкер). В одном воплощении линкер дополнительно включает мальимидо группу. Линкер обладает стабилизирующим и солюбилизирующим эффектом, поскольку содержит заряды или/и может формировать водородные мостики. Кроме того, он может пространственно облегчать связывание антитела к гаптену с гаптен-конъюгированным полипептидом. В одном воплощении линкер локализован в боково цепи аминокислоты полипептида (например, конъюгирован с боковой цепью лизина или цистеина через амино или тиольную группу). В одном воплощении линкер локализован в амино конце или карбокси конце полипептида. Позицию линкера на полипептиде обычно выбирают в участке, не оказывающем влияние на биологическую активность полипептида. Поэтому позиция прикрепления линкера зависит от природы полипептида и соответствующих структурных элементов, которые ответственны за биологическую активность. Биологическаяя активность полипептида, к которому прикреплен гаптен, может быть протестирована в исследовании in vitro.

Термин «ковалентный комплексный препарат» означает, что после образования нековалентного комплекса, например, между антителом к теофиллину и теофиллином, образуется ковалентная связь между двумя партнерами в комплексе. Образование ковалентной связи происходит без необходимости добавления дополнительных реагентов.

II. Композиции и способы

В одном аспекте изобретение основано на антителах, которые связываются с биотином. Данные антитела предложены в данном документе. Антитела по изобретению полезны, например, в качестве моноспецифичных антител для связывания биотинилированных соединений и в качестве мультиспецифичных антител для диагностики и лечения всех типов заболеваний за счет специфичности связывания с биотинилированным соединением в качестве характеристики нагрузки антитела.

А. Примерные антитела к биотину

В одном аспекте, изобретение предлагает изолированные антитела, которые связываются с биотином. В конкретных воплощениях антитела к биотину представляют собой гуманизированные антитела. В конкретных воплощениях, антитела к биотину, как описано в данном документе, связываются с биотинилированными соединениями без интерференции с биологической активностью соединения, которое конъюгировано с биотином и специфично связывается антителом через биотиновый остаток. Поэтому эти антитела могут быть применены для улучшения фармакокинетических свойств соединений, конъюгированных с биотином (биотинилированное соединение), если (биотинилированное соединение), если антитело представляет собой моноспецифичное антитело. Также данные антитела могут быть применены для целевой доставки биотинилированного соединения, если антитело представляет собой би-или мультиспецифичное антитело, поскольку одна специфичность связывания направлена против биотина и может быть применена в качестве универсальной специфичности нагрузки, в связи с тем, чт