Анти-полиубиквитиновые антитела и способы применения

Анти-полиубиквитиновые антитела и способы применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка согласно 35 U.S.С. §119 (е) заявляет приоритет Предварительной заявки США №61/515,729, поданной 5 августа 2011 г., которая включена путем ссылки в данное описание в полном объеме.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей, который подан в формате ASCII через EFS-Web и, таким образом, включен путем ссылки в полном объеме. Копия указанного ASCII, созданная 6 августа 2012 г., носит название P4716R.1WO.txt, и ее размер составляет 128,429 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области анти-полиубиквитиновых антител, и, более конкретно, к анти-полиубиквитиновым антителам, которые не связываются специфично с моноубиквитином и которые являются специфичными в отношении линейного полиубиквитина, а также способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Убиквитин представляет собой белок небольшого размера, который играет ряд важных регуляторных ролей в широком спектре клеточных путей. Наиболее известные из них - это роль убиквитинов в разложении белка, причем ковалентное присоединение убиквитина к белку-мишени разрешает распознавание и уничтожение белка-мишени протеасомой 26S (см. Wilkinson, Semin. Cell Devel. Biol. 11(3): 141-148 (2000)). Ковалентное присоединение убиквитина, белка длиной 76 аминокислот, к белку-мишени представляет собой ферментный трехстадийный процесс (Pickart, Annu. Rev. Biochem. 70: 503-533 (2001)). Вначале убиквитин-активизирующий фермент Е1 образует тиоэфир убиквитин-E1 в ходе АТФ-зависимой реакции. Убиквитин переносится из тиоэфира убиквитин-Е1 к члену семейства убиквитин-конъюгирующего фермента (Е2). На третьей стадии, с помощью убиквитин-протеин лигазы (Е3) образуется изопептидная связь между карбоксильным концом убиквитина и ε-аминогруппой лизинового остатка белка-мишени. Ферменты под названием деубиквижназы удаляют убиквитиновые фрагменты с белков мишеней (Guterman and Glickman, Curr. Prot. Pep.Sci. 5: 201-210 (2004)).

Убиквитин содержит семь остатков лизина (Lys6, Lys11, Lys27, Lys33, Lys29, Lys48 и Lys63), и, таким образом, убиквитин сам по себе может служить белком-мишенью для убиквитинирования (Peng et al., Nat. Biotechnol. 21: 921-926 (2003); Pickart and Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol. 8:610-616 (2004)). Молекула, полученная при убиквитинировании белка убиквитин, называется молекулой полиубиквитина и может содержать два или более фрагментов убиквитина. Убиквитинирование убиквитина теоретически может происходить по любому из семи остатков лизина (Peng et al., Nat. Biotechnol. 21: 921-926 (2003)), таким образом, что существуют различные виды полиубиквитинов, содержащие изопептидные связи при различных остатках лизина в пределах убиквитина. Сообщалось о полиубиквитиновых цепях с внутренними изопептидными связями при всех семи остатках лизина. Iwai and Tokunaga, EMBO Reports 10:706-713 (2009).

Недавно было обнаружено, что также образуются линейные цепи полиубиквитина, в которых С-концевой глицин убиквитина конъюгирован с α-аминогруппой N-концевого метионина другой молекулы убиквитина. Iwai and Tokunaga, EMBO Reports 10:706-713 (2009). Линейный полиубиквитин образуется посредством комплекса сборки линейной цепи убиквитина (КСЛЦУ), который состоит из двух RING белков «цинковых пальцев», HOIL-1L и HOIP. Tokunaga et al., Nat. Cell Biol. 11: 123-132 (2009). Считается, что генетически кодируемый, незакрепленный линейный полиубиквитин не существует в клетках, поскольку его С-конец уязвим к расщеплению изопептидазой Т. Iwai and Tokunaga, EMBO Reports 10:706-713 (2009). Данное наблюдение наводит на мысль о том, что сборка линейного полиубиквитина происходит на белке-субстрате посттрансляционно, и что конъюгированные линейные молекулы полиубиквитина являются потенциальными модуляторами активности и функции белка. Id. Например, показано, что линейное полиубиквитинирование эссенциального модулятора NF-κВ (НЭМО) играет роль в активации NF-κВ. Id.

Антитела, которые отличают линейный полиубиквитин от полиубиквитина с различным расположением связей при остатках лизина, были бы пригодными для дополнительного изучения роли линейных цепей полиубиквитина в разложении белка и регуляции, а также для нацеливания и модуляции линейного полиубиквитина в опосредованных линейным полиубиквитином путях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В изобретении предлагаются антитела против линейного полиубиквитина и способы их применения. В одном из вариантов изобретения предлагается выделенное антитело, которое специфично связывается с первым полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом, причем указанное антитело не связывается специфично со вторым полиубиквитином, содержащим лизиновую связь. В другом варианте изобретения предлагается выделенное антитело, которое специфично связывается с первым полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом, и со вторым полиубиквитином, содержащим лизиновую связь, причем указанное антитело не связывается специфично с моноубиквитином, и при этом антитело связывается со вторым полиубиквитином со значительно меньшей аффинностью связывания по сравнению с аффинностью связывания антитела с первым полиубиквитином.

В другом варианте изобретения предлагается выделенное антитело, которое специфично связывается с полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом, причем указанное антитело не связывается специфично с моноубиквитином. В одном из аспектов антитело содержит по меньшей мере одну гипервариабельную (HVR) последовательность, выбранную из HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-Н3 любой из SEQ ID NO:1, 4, 19 и 50-57; SEQ ID NO:2 и 58-63; SEQ ID NO:3, 5, 6, 20, 21 и 64-72; SEQ ID NO:7, 10, 13, 16, 22 и 73-81; SEQ ID NO:8, 11, 14, 17, 23, 24 и 82-86; и SEQ ID NO:9, 12, 15, 18 и 87-93, соответственно.

В другом аспекте антитело содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, причем HVR-L1 содержит последовательность аминокислот RASQX₁VX₂X₃X₄VA (SEQ ID NO:39), причем аминокислота X₁ выбрана из аминокислоты D, S и G, аминокислота Х₂ выбрана из S и D, аминокислота Х₃ выбрана из S, Т и N, и аминокислота Х₄ выбрана из А и S; причем HVR-L2 содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO:2; и при этом HVR-L3 содержит последовательность аминокислот QQX₅X₆X₇X₈X₉PX₁₀T (SEQ ID NO:40), причем аминокислота X₅ выбрана из S, Y и Н, аминокислота Х₆ выбрана из Y и F, аминокислота X₇ выбрана из Т, Y и А, аминокислота Х₈ выбрана из Т, Y и S, аминокислота Х₉ является необязательной, и, если она присутствует, представляет собой серин, и аминокислота Х₁₀ выбрана из Р и L.

В другом аспекте антитело содержит ни меньшей мере одну гипервариабельную (HVR) последовательность, выбранную из HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем HVR-H1 содержит последовательность аминокислот Х₁₁Х₁₂Х₁₃Х₁₄Х₁₅Х₁₆Х₁₇Х₁₈ (SEQ ID NO:41), и при этом аминокислота Х₁₁ выбрана из Т и N, аминокислота X₁₂ выбрана из F и I, аминокислота Х₁₃ выбрана из S, Т и Y, аминокислота Х₁₄ выбрана из N, D, S и Y, аминокислота X₁₅ выбрана из Т, Y, S и D, аминокислота X₁₆ выбрана из Y, D и S, аминокислота X₁₇ выбрана из I и М, и аминокислота X₁₈ выбрана из S и Н; причем HVR-H2 содержит последовательность аминокислот AX₁₉IX₂₀X₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅TX₂₆ (SEQ ID NO:42), аминокислота X₁₉ выбрана из S, G, W и E, аминокислота Х₂₀ выбрана из Т, S и Y, аминокислота X₂₁ выбрана из Р и S, аминокислота Х₂₂ выбрана из S и Y, аминокислота Х₂₃ выбрана из G, S и Y, аминокислота Х₂₄ выбрана из G и S, аминокислота Х₂₅ выбрана из S и Y, и аминокислота Х₂₆ выбрана из D и S, и HVR-H3 содержит последовательность аминокислот RX₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆X₃₇D (SEQ ID NO:43) причем аминокислота Х₂₇ выбрана из Т, Е и G, аминокислота Х₂₈ выбрана из W, А и Y, аминокислота Х₂₉ выбрана из L, G, V и S, аминокислота Х₃₀ выбрана из L, S и W, аминокислота Х₃₁ выбрана из R, K и Y, и аминокислота Х₃₂ выбрана из W, L, G и Y, аминокислота Х₃₃ выбрана из V, L, А и G, аминокислота Х₃₄ выбрана из М и F, и при этом аминокислоты Х₃₄, Х₃₅ и Х₃₆ присутствуют необязательно, и, если присутствуют, аминокислота Х₃₄ представляет собой S, аминокислота Х₃₅ выбрана из V и Р, и аминокислота Х₃₆ представляет собой А.

В другом аспекте антитело содержит по меньшей мере одну гипервариабельную последовательность (HVR), выбранную из HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, причем HVR-L1 содержит последовательность аминокислот RASQ Х₃₈Х₃₉Х₄₀Х₄₁Х₄₂Х₄₃А (SEQ ID NO:44), причем аминокислота Х₃₈ выбрана из D, А, Е, G, L, N, S, Т и V, аминокислота Х₃₉ выбрана из V, А, L и S, аминокислота Х₄₀ выбрана из S, F, G, L, R и V, аминокислота X₄₁ выбрана из Т, G, I, N, S и V, аминокислота Х₄₂ выбрана из А, Н, Q, R, S и Y, и аминокислота Х₄₃ выбрана из V и L, причем HVR-L2 содержит последовательность аминокислот SX₄₄X₄₅X₄₆X₄₇YX₄₈ (SEQ ID NO:45), причем аминокислота Х₄₄ выбрана из А и R, аминокислота Х₄₅ выбрана из S, K, Q и R, аминокислота Х₄₆ выбрана из F и Y, аминокислота Х₄₇ выбрана из L, А, F, G, Н, I, K, М, N, Р, R, S, V и Y, и аминокислота X₄₈ выбрана из S, А, D, F, G, Н, V, W и Y, и при этом HVR-L3 содержит последовательность QQ X₄₉X₅₀X₅₁X₅₂PPT (SEQ ID NO:46), причем аминокислота Х₄₉ выбрана из Н и S, аминикислота Х₅₀ выбрана из Y, K, N, Q, R, S, V и W, аминокислота X₅₁ выбрана из T, I, Q, R, S и V, и аминокислота Х₅₂ выбрана из Т, A, D, F, G, K, N, P, Q, R, S и V.

В другом аспекте антитело содержит по меньшей мере одну гипервариабельную последовательность (HVR), выбранную из HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, причем HVR-H1 содержит последовательность аминокислот X₅₃X₅₄X₅₅YX₅₆S (SEQ ID NO:47), причем аминокислота Х₅₃ выбрана из А, F, K, М, Q, R и S, аминокислота Х₅₄ выбрана из N и W, аминокислота Х₅₅ выбрана из Т, A, I, L, М и V, и аминокислота Х₅₆ выбрана из I, M и V, и при этом HVR-L2 содержит последовательность аминокислот AX₅₇X₅₈TPX₅₉SGX₆₀TX₆₁ (SEQ ID NO:48), причем аминокислота Х₅₇ выбрана из Т и S, аминокислота X₅₈ выбрана из I, S и V, аминокислота Х₅₉ выбрана из S и А, аминокислота Х₆₀ выбрана из S, H, I, L, М и Q, аминокислота Х₆₁ выбрана из D и N, причем HVR-H3 содержит последовательность аминокислот X₆₂WX₆₃X₆₄RWVX₆₅D (SEQ ID NO:49), и причем аминокислота Х₆₂ выбрана из S и Т, аминокислота Х₆₃ выбрана из L и Y, аминокислота Х₆₄ выбрана из L, I и V, аминокислота Х₆₅ выбрана из М и F.

В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1 или 4, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2 и последовательность HVR-L3, выбранные из SEQ ID NO:3, 5 и 6, соответственно. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-H1, выбранную из SEQ ID NO:7, 10, 13 и 16, последовательность HVR-H2, выбранную из SEQ ID NO:11, 23 и 24, и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:12, соответственно. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1, выбранную из SEQ ID NO:1 и 50-56, последовательность HVR-L2, выбранную из SEQ ID NO:2 и 57-62, и последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO:3 и 63-71, соответственно. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-H1, выбранную из SEQ ID NO:7 и 72-80, последовательность HVR-H2, выбранную из SEQ ID NO:8 и 81-85, и последовательность HVR-H3, выбранную из SEQ ID NO:9 и 86-92, соответственно.

В другом аспекте антитело содержит последовательности HVR-L1, HVR-L2, и HVR-L3, соответствующие указанным для клонов 1Е2, 1D8, 1F4 или 1А10 на Фиг.1А. В другом аспекте антитело содержит последовательности HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, соответствующие указанным для клонов 1Е2, 1D8, 1F4 или 1А10 на Фиг.1В. В другом аспекте антитело содержит последовательности HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3, соответствующие указанным для клонов 1D8.3C2, 1D8.3F8 или 1D8.4F5 на Фиг.4А. В другим аспекте антитело содержит последовательности HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, соответствующие указанным для клонов 1D8.3C2, 1D8.3F8 или 1D8.4F5 на Фиг.4В.

В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:11 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:12. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:19, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:23 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:12. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:20, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:11 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:12. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:20, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:10, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:11 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:12. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:8 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:9. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2, выбранную из SEQ ID NO:2, 57 и 59, последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO:3, 64 и 71, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:7 или 79, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:8 или 81, и последовательность HVR-L3, выбранную из SEQ ID NO:9, 86, 88 или 89. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:57, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:8 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:9. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность HVR-L2 SEQ ID NO:2, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:81 и последовательность HVR-H3 SEQ ID NO:9. В другом аспекте антитело содержит последовательность HVR-L1 SEQ ID NO:1, последовательность 11VR-L2 SEQ ID NO:57, последовательность HVR-L3 SEQ ID NO:3, последовательность HVR-H1 SEQ ID NO:7, последовательность HVR-H2 SEQ ID NO:81 и последовательность HVR-НЗ SEQ ID NO:9. В определенных аспектах любое из антител, описанных в данном описании, может содержать лейцин как первую аминокислоту после С-конца HVR-H3 (например, аминокислота, непосредственно смежная с С-концом HVR-Н3, как, например, 1Е3, -TWLLRVMDL (SEQ ID NO:96).

В другом аспекте антитело содержит последовательность аминокислот легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO:25-28, 33-35, 94 и 193-195. В другом аспекте антитело содержит последовательность аминокислот тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO:29-31, 36-38, 95 и 196-198.

В другом аспекте антитело содержит последовательности аминокислот легкой цепи и тяжелой цепи по меньшей мере на 95% идентичные последовательностям аминокислот из следующих комбинаций последовательностей: SEQ ID NO:25 и 29; SEQ ID NO:26 и 30; SEQ ID NO:27 и 31; SEQ ID NO:28 и 32; SEQ ID NO:33 и 36; SEQ ID NO:34 и 37; SEQ ID NO:35 и 38; SEQ ID NO:95 и 95; SEQ ID NO:193 и 196; SEQ ID NO:194 и 197; и SEQ ID NO:195 и 198.

В другом варианте изобретения предлагается выделенное антитело, причем указанное антитело связывается с таким же антигенным детерминантом на полиубиквитине, содержащем связь С-конца с N-концом, как любое из вышеперечисленных антител, и при этом антитело не связывается специфично с моноубиквитином. В другом варианте изобретения предлагается выделенное антитело, которое конкурирует с любым из вышеперечисленных антител за связывание с полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом, причем указанное антитело не связывается специфично с моноубиквитином. В другом варианте изобретения предлагается любое из вышеперечисленных выделенных антител, причем указанное антитело специфично связывается с полиубиквитинированным белком, содержащим связь С-конца с N-концом. В другом варианте изобретения предлагается любое из вышеперечисленных выделенных антител, причем указанное антитело модулирует по меньшей мере один опосредованный полиубиквитином путь передачи сигнала.

В одном из общих аспектов любое из вышеперечисленных антител представляет собой моноклональное антитело. В другом общем аспекте любое из вышеперечисленных антител представляет собой человеческое антитело. В другом общем аспекте любое из вышеперечисленных антител представляет собой гуманизированное антитело. В другом общем аспекте любое из вышеперечисленных антител представляет собой химерное антитело. В другом общем аспекте любое из вышеперечисленных антител представляет собой фрагмент антитела, который связывается с полиубиквитином, содержащим связь С-конца с N-концом.

В другом варианте изобретения предлагается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая любое из вышеперечисленных антител. В другом варианте изобретения предлагается вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из вышеперечисленных антител. В другом варианте изобретения предлагается клетка-хозяин, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из вышеперечисленных антител. В другом варианте изобретения предлагается клетка-хозяин, содержащая вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из вышеперечисленных антител.

В другом варианте изобретения предлагается способ продуцирования любого из вышеперечисленных антител, включающий культивирование заявленной выше клетки-хозяина в условиях, при которых вырабатывается антитело. В одном из аспектов способ дополнительно включает извлечение антитела из клетки-хозяина. В другом аспекте способ дополнительно включает очистку антитела.

В другом варианте изобретения предлагается иммуноконъюгат, содержащий любое из вышеперечисленных антител и цитотоксический агент. В другом варианте изобретения предлагается фармацевтический состав, содержащий любое из вышеперечисленных антител и фармацевтически приемлемый носитель. В одном из аспектов фармацевтический состав, дополнительно содержит дополнительный терапевтический агент. В одном из таких аспектов дополнительный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент.

В другом варианте изобретения предлагается любое из вышеперечисленных антител для применения в качестве лекарственного средства. В другом варианте изобретения предлагается любое из вышеперечисленных антител для применения при лечении связанного с клеточным циклом заболевания или расстройства. В одном из аспектов связанное с клеточным циклом заболевание или расстройство выбрано из заболевания или расстройства, связанного с аберрантно ускоренным прогрессированием клеточного цикла и заболеванием или расстройством, связанным с аберрантно замедленным прогрессированием клеточного цикла. В одном из таких аспектов заболевание или расстройство, связанное с аберрантно ускоренным прогрессированием клеточного цикла, представляет собой рак. В другом таком аспекте, заболевание или расстройство, связанное с аберрантно замедленным прогрессированием клеточного цикла, выбрано из мышечного дегенеративного расстройства и нейродегенеративного расстройства.

В другом варианте изобретения предлагается применение любого из вышеперечисленных антител в производстве лекарственного средства. В одном из аспектов лекарственное средство применяется при заболевании или расстройстве, выбранном из рака, мышечного дегенеративного расстройства и нейродегенеративного расстройства. В другом варианте изобретения предлагается способ лечения индивидуума, страдающего заболеванием или расстройством, выбранным из рака, мышечного дегенеративного расстройства и нейродегенеративного расстройства, включающий введение указанному индивидууму эффективного количества любого из вышеперечисленных антител.

В другом варианте изобретения предлагается способ определения присутствия полиубиквитина или полиубиквитинированного белка в образце, в котором предполагают присутствие полиубиквитина или полиубиквитинированного белка, который включает обеспечение воздействия на образец по меньшей мере одним из вышеперечисленных антител и определение связывания по меньшей мере одного антитела с полиубиквитином или полиубиквитинированным белком в указанном образце. В другом варианте изобретения предлагается способ отделения полиубиквитинированного белка, содержащего связь С-конца с N-концом от полиубиквитинированного белка, не содержащего связи С-конца с N-концом, в образце, который включает приведение образца в контакт с по меньшей мере одним из вышеперечисленных антител. В другом варианте изобретения предлагается способ определения функции и/или активности полиубиквитина, содержащего связь С-конца с N-концом, в клетке или образце, который включает приведение клетки или образца в контакт с по меньшей мере одним из вышеперечисленных антител и оценку влияния указанной стадии контакта на клетку или образец.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 иллюстрирует результаты пятна фага ТИФА, демонстрирующие относительные сигналы связывания на длине волны 450 нм для клонов 1D8, 1Е3, 1F4 и 1А10 с панелью убиквитиновых белков, как описано в Примере 1В. Каждый из клонов библиотеки Fab содержал метку gD, и показ Fab на фаге оценивали путем связывания с анти-gD антителом. Непокрытую ячейку использовали в качестве отрицательного контроля.

Фиг.2А и 2В иллюстрируют последовательности аминокислот легкой и тяжелой цепи Fab, полученных в Примере 1. Фиг.2А иллюстрирует последовательность легкой цепи клонов 1Е3, 1D8, 1F4 и 1А10 (SEQ ID NO:25-28, соответственно). Фиг.2В иллюстрирует выравнивание последовательности тяжелой цепи клонов 1Е3, 1D8, 1F4 и 1А10 (SEQ ID NO:29-32, соответственно). На Фиг.2А и 2В последовательности HVR для каждого клона показаны обведенными прямоугольником участками, причем первый прямоугольник показывает HVR-L1 (Фиг.2А) или HVR-H1 (Фиг.2В), второй прямоугольник показывает HVR-L2 (Фиг.2А) или HVR-H2 (Фиг.2В), и третий прямоугольник показывает HVR-L3 (Фиг.2) или HVR-H3 (Фиг.2В).

Фиг.3 иллюстрирует результаты 1С₅₀ конкуренции ТИФА для фага с целью измерения аффинности очищенных 1F4, 1D8 и 1Е3 Fab для линейного диубиквитина.

Фиг.4 иллюстрирует результаты анализа методом Вестерн-блота для определения способности Fab 1D8 и 1Е3 специфично распознавать панель диубиквитиновых белков в контексте иммобилизации.

Фиг.5А и 5В иллюстрируют последовательности аминокислот легкой и тяжелой цепи клонов созревшей аффинности, полученных в Примере 2 из кругов сортировки библиотеки созревания аффинности 1D8. Фиг.5А иллюстрирует последовательности легкой цепи клонов созревшей аффинности 1D8.3C2, 1D8.3F8 и 1D8.4F5 (SEQ ID NO:33-35, соответственно). Фиг.5А иллюстрирует последовательности 1D8 как SEQ ID NO:26. Фиг.5В иллюстрирует выравнивание последовательностей тяжелой цепи клонов созревшей аффинности 1D8.3C2, 1D8.3F8 и 1D8.4F5 (SEQ ID NO:36-38, соответственно). Фиг.5В иллюстрирует последовательности 1D8 как SEQ ID NO:30. Как на Фиг.5А, так и 5В, последовательности HVR для каждого клона показаны обведенными прямоугольниками участками, причем первый прямоугольник показывает HVR-L1 (Фиг.5А) или HVR-H1 (Фиг.5В), второй прямоугольник показывает HVR-L2 (Фиг.5А) или HVR-H2 (Фиг.5В), и третий прямоугольник показывает HVR-L3 (Фиг.5А) или HVR-H3 (Фиг.5В). Модификации аминокислот относительно материнской последовательности 1D8 обозначены серой заливкой.

Фиг.6 иллюстрирует результаты IC₅₀ конкуренции ТИФА для фага с целью измерения аффинности Fab 1D8, 1D8.3C2, 1D8.3F8 и 1D8.4F5 с линейным диубиквитином.

Фиг.7А и 7В иллюстрируют результаты исследований, в которых оценивали характеристики специфичности связывания мутантных вариантов созревшей аффинности в сравнении с материнским клоном 1Е3 и контрольными антителами. Связывание материнского клона 1Е3 и 11 одинарных мутантных вариантов созревшей аффинности, показанных на фаге, тестировали на предмет связывания с панелью убиквитиновых белков в анализе ТИФА. Связывание с анти-gD антителом использовали для оценки показа Fab на фаге, и не покрытые лунки использовали в качестве отрицательного контроля.

Фиг.8А и 8В иллюстрируют результаты исследований, в которых оценивали характеристики специфичности связывания одинарных мутантных и двойных мутантных вариантов в сравнении с материнским клоном 1Е3 и контрольными антителами, как описано в Примере 3. Связывание материнского клона 1Е3, 4 одинарных мутантных вариантов созревшей аффинности и 3 двойных мутантных вариантов созревшей аффинности, показанных на фаге, тестировали на предмет связывания с панелью убиквитиновых белков в анализе ТИФА. Связывание с анти-gD антителом использовали для оценки показа Fab на фаге, и не покрытые лунки использовали в качестве отрицательного контроля.

Фиг.9А и 9В иллюстрируют последовательности аминокислот легкой и тяжелой цепи Fab 1Е3, клоны созревшей аффинности, полученные в Примере 3 из кругов сортировки второй библиотеки созревания аффинности 1Е3 (1F11 и 3F5), мутация Y102L наблюдалась в клоне 4Е4 и тройном мутантном Fab, содержащем модификации аминокислот из клонов 1F11 и 3F5 и мутацию Y102L как описано в Примере 3Р. Фиг.9А иллюстрирует последовательности легкой цепи клонов созревшей аффинности для 1Е3, 1F11, 3F5, Y102L и 1F11/3F5/Y102L (SEQ ID NO:25, 193, 194, 195 и 94, соответственно). Фиг.9В иллюстрирует выравнивание последовательностей тяжелой цепи клонов созревшей аффинности для 1Е3, 1F11, 3F5, Y102L и 1F11/3F5/Y102L (SEQ ID NO:29, 196, 197, 198 и 95, соответственно). На Фиг.9А и 9В положения Kabat, служащие мишенью для вариации аминокислот во вторых библиотеках созревания аффинности для 1Е3 показаны очерченными прямоугольником участками. Модификации аминокислот относительно материнской последовательности 1Е3 выделены заливкой серым цветом.

На Фиг.10 проиллюстрированы анализы методом Вестерн-блоттинга связывания материнского 1Е3, одинарных и двойных мутантных IgG с линейным диубиквитином (серийные разведения 1000, 333, 111, 37 и 12 нг на полосу) и K63-связанным диубиквитином (1000 нг на полосу).

Фиг.11 иллюстрирует анализ методом Вестерн-блоттинга связывания материнского 1Е3, двойных и тройных мутантных IgG с линейным диубиквитином (серийные разведения 1000, 333, 111, 37 и 12 нг на полосу) и K63-связанным диубиквитином (1000 нг на полосу).

Фиг.12 иллюстрирует анализ методом Вестерн-блоттинга связывания Y1012L, мутантного Y102L T110A, а также IgG Y102L, T110A, 3F5 и 1F11, содержащих различные комбинации мутаций, с линейным диубиквитином (серийные разведения 1000, 333, 111, 37 и 12 нг на полосу) и K63-связанным диубиквитином (1000 нг на полосу).

Фиг.13 иллюстрирует анализ методом Вестерн-блоттинга связывания материнского 1Е3, одинарных, двойных и тройных мутантных IgG, как описано в Примере 3М, с линейным диубиквитином (серийные разведения 1000, 333, 111, 37 и 12 нг на полосу) и K63-связанным диубиквитином (1000 нг на полосу).

Фиг.14 иллюстрирует анализ методом Вестерн-блоттинга связывания 1Е3 и 1F11/3F5/Y102L IgG с двукратными серийными разведениями линейного диубиквитина (1000, 500, 250, 125, 63, 31 и 16 нг/полому, где указан градиент) или моноубиквитина, K11-связанного диубиквитина, K48-связанного диубиквитина и K63-связанного диубиквитина (1 мкг/полосу). В качестве контроля анализировали связывания анти-K63 gG, Apu3.A8, с двукратными серийными разведениями K63-связанного диубиквитина (1000, 500, 250, 125, 63, 31 и 16 нг/полосу, где указан градиент) или моноубиквитина, линейного диубиквитина, K11-связанного диубиквитина и K48-связанного диубиквитина (1 мкг/полосу). Окрашенный Coomassie гель (панель вверху слева) приведен для иллюстрации того, каким образом каждый из изученных убиквитинов мигрирует в гелях.

Фиг.15 иллюстрирует результаты экспериментов, в которых линейный моноубиквитин, полиубиквитин 2-7 (длиной от 2 до 7 субъединиц убиквитина), K48-связанный полиубиквитин 2-7 (длиной от 2 до 7 субъединиц убиквитина), K63-связанный полиубиквитин 2-7 (длиной от 2 до 7 субъединиц убиквитина) и K11-связанный полиубиквитин (1 мкг каждою на полису) подвергали иммуноблоттингу с пан-убиквитиновым антителом P4D1 (средняя панель) или 1F11/3F5/Y102L IgG (правая панель). Окрашивание Coomassie выявило состав образцов (левая панель). Показано короткое и длительное время контакта для Вестерн-блотов.

Фиг.16А и 16В иллюстрируют результаты экспериментов, в которых лизаты клеток HeLa S3, обработанных различными концентрациями TNFα и на протяжении различных периодов времени 5,8 мкМ MG132, подвергали иммуноблоттингу с гибридным антителом 1F11/3F5/Y102L для цепей линейного убиквитина или с антителом Apu3.A8 для цепей K63-связанного убиквитина. В качестве контроля по 250 нг очищенного линейного полиубиквитин 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 анализировали на каждом геле (Фиг.16А). Для оценки уровня активации пути NFκB лизаты подвергали блоттингу на предмет уровней IκВα (Фиг.16 В). В качестве нагрузочного контроля проводили блоттинг лизатов на предмет β-тубулина.

Фиг.17 иллюстрирует результаты экспериментов иммунопреципитации с гибридным антителом против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L, контрольным изотипом или анти-K52 антителом Apu3.A8. Эксперименты ИЛ выполняли в буфере ИП 4 М мочевины с тремя наборами условий (смесь всех цепей убиквитин, отсутствие линейных цепей убиквитина или только линейные цепи убиквитина). В качестве контроля по 1 мкг очищенного линейного полиубиквитина 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 анализировали на каждом геле.

Фиг.18А и 18В иллюстрируют результаты экспериментов иммунопреципитации с использованием смесей 1:1 линейного полиубиквитина 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 с антителом против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L или анти-КбЗ антителом Apu3.A8 при различных концентрациях мочевины или в ФБРТ, которые подвергали иммуноблоттингу с 1F11/3F5/Y102L (против линейного) или Apu3.A8 (анти-K63). В качестве контроля по 1 мкг очищенного линейного полиубиквитина 2-7 и K63-связанного полиубиквитина 2-7 анализировали на каждом геле. Фиг.18А иллюстрирует результаты экспериментов ИП при 0М, 2М, 4М и 6М мочевины. Фиг.18В иллюстрирует результаты экспериментов ИП при 6М, 7 М и 8 М мочевины.

Фиг.19 иллюстрирует результаты экспериментов иммунопреципитации и иммуноблоттинга с использованием смеси 1:1:1:1 линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 с антителом против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L, контрольным изотипом или анти-K63-полиубиквитиновым антителом Apu3.A8, поперечно сшитым с гранулами Белка А при различных концентрациях мочевины. Антитела, используемые для иммуноблоттинга, представляли собой 1F11/3 F5/Y102L (против линейного), 2А3/2Е6 (анти-КП), Арu2.07 (анти-K48) или Apu3.A8 (анти-K63) IgG. В качестве контроля по 1 мкг очищенного линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 анализировали на каждом геле.

Фиг.20 иллюстрирует результаты экспериментов иммунопреципитации и иммуноблоттинга с использованием смеси 1:1:1:1 линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 с гибридным антителом против линейного полиубиквитина 1F11/3 F5/Y 102L, контрольным изотипом или анти-K63-полиубиквитиновым IgG антителом Apu3.A8, поперечно сшитым с гранулами Белка G при различных концентрациях мочевины. Антитела, используемые для иммуноблоттинга, представляли собой 1F11/3F5/Y102L (против линейного), 2А3/2Е6 (анти-КП), Apu2.07 (анти-K48) или Apu3.A8 (анти-K63) IgG. В качестве контроля по 1 мкг очищенного линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 анализировали на каждом геле.

Фиг.21А иллюстрирует результаты экспериментов иммунопреципитации и иммуноблоттинга из смеси 1:1:1:1 линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 с антителом против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L, контрольным изотипом или анти-K63-полиубиквитиновым антителом Apu3.A8 при различных концентрациях мочевины. Антитела, используемые для иммуноблоттинга, представляли собой 1F11/3F5/Y102L (против линейного), 2А3/2Е6 (анти-K11), Apu2.07 (анти-K48) или Apu3.A8 (анти-K63) IgG. В качестве контроля по 500 нг очищенного линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 анализировали на каждом геле.

Фиг.21В иллюстрирует результаты экспериментов иммунопреципитации из смеси 1:1:1:1 линейного полиубиквитина 2-7, K11-связанного полиубиквитина, K48-связанного полиубиквитина и K63-связанного полиубиквитина 2-7 с гибридным антителом против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L, контрольным изотипом или анти-K63-полиубиквитиновым антителом Apu3.A8 при различных концентрациях мочевины с разделением на геле SDS-PAGE и окрашиванием Coomassie. Показаны участки, вырезанные для масс-спектрометрии AQUA.

Фиг.21C представляет собой график, на котором указано количество в пикомолях связей полиубиквитина, идентифицированных масс-спектрометрией AQUA из иммунопреципитатов 1F11/3F5/Y102L, как показано на Фиг.24В (участок В и участок С) и описано в Примере 4D.

Фиг.21D представляет собой график, на котором указан состав связей полиубиквитиновых цепей, идентифицированных масс-спектрометрией AQUA из иммунопреципитатов 1F11/3F5/Y102L, как показано на Фиг.24В (участок В и участок С).

Фиг.21Е представляет собой график, на котором указан процент линейных цепей, извлеченных из иммунопреципитатов 1F11/3F5/Y102L, по данным масс-спектрометрии AQUA.

Фиг.22А иллюстрирует иммуноблоты с лизатами из клеток 293Т, трансфицированных плазмидой, чрезмерно экспрессирующей Hoil-1L и Hoip, или пустым вектором. Пятна зондировались на линейный полиубиквитин, Hoil-1L, Hoip и β-тубулин, как описано в Примере 4Е.

Фиг.22В иллюстрирует результаты экспериментов иммунопреципитации из лизатов клеток 293Т, трансфицированных плазмидой, чрезмерно экспрессирующей Hoil-1L и Hoip, или пустым вектором. Иммуноблоты зондировали на наличие линейного полиубиквитин или окрашивали Coomassie. Показанные участки окрашенного Coomassie геля вырезали для масс-спектрометрии AQUA.

Фиг.22С иллюстрирует график, на котором показан состав связей полиубиквитина, идентифицированный масс-спектрометрией AQUA, в иммунопреципитатах 1F11/3F5/Y102L из клеток, чрезмерно экспрессирующих Hoil-1L/Hoip, как проиллюстрировано на Фиг.22В.

Фиг.22D иллюстрирует иммунофлуоресценцию клеток HeLa S3, трансфицированных плазмидой, чрезмерно экспрессирующей Hoil-1L и Hoip, или пустым вектором, и окрашенных с использованием антитела против линейного полиубиквитина 1F11/3F5/Y102L. Добавление рекомбинантного линейного полиубиквитина длиной пять или семь субъединиц (*) создает конкуренцию за связывание с антитела против линейного полиубиквитина.

Фиг.23 иллюстрирует различные представления со-кристаллической структуры комплекса, образованного между фрагментом Fab 1F11/3F5/Y102L и линейным диубиквитином. А) 1F11/3F5/Y102L показан в виде эскиза внизу фигуры, и линейный диубиквитин показан как эскиз внутри модели заполненного пространства вверху. Показаны проксимальные и дистальные субъединицы убиквитина, а также линейная связь.

B) Эпитоп на линейном диубиквитине показан темно-серым цветом на поверхности диубиквитина, которая взаимодействует с 1F11/3F5/Y102L. Остатки, для которых по меньшей мере 25% доступной для растворителя площади поверхности спрятано в зоне контакта линейного диубиквитина и 1F11/3F5/Y102L и/или которые находятся в пределах 4,5 Å Fab, обозначены однобуквенным кодом аминокислоты и номером остатка. На Фиг.23В раскрыты остатки 31-37, 70-76 и 60-63 как SEQ ID NO:379-381, соответственно.

C) Паратоп на Fab 1F11/3F5/Y102L показан темно-серым цветом на поверхности Fab, которая взаимодействует с диубиквитином. Остатки, для которых по меньшей мере 25% доступной для растворителя площади поверхности спрятано в зоне контакта 1F11/3F5/Y102L и диубиквитина и/или которые находятся в пределах 4,5 Å диубиквитина, обозначены однобуквенным кодом аминокислоты и номером остатка. На Фиг.23С раскрыты остатки 95-99 и 52-56 как SEQ ID NO:378 и 377, соответственно.

Фиг.24 иллюстрирует дополнительные представления в увеличенном масштабе со-кристаллической структуры комплекса, образованного между фрагментом Fab 1F11/3F5/Y102L и линейным диубиквитином. А) Увеличенный масштаб иллюстрирует водородные связи, образованные между боковой цепью Gln56 тяжелой цепи и карбонильными группами основной цепи Gly75 и Gly76. Диубиквитин показан светлосерым, и Fab - темно-серым. В) Потенциальное электростатическое взаимодействие между Lys52 легкой цепи и Asp32 и диполем карбокси-концевого конца альфа-спирали диубиквитина. Диубиквитин показан светло-серым, и Fab - темно-серым. С) Гидрофобные взаимодействия между Leu 102 тяжелой цепи и Val2 и Leu4 каркаса 1 тяжелой цепи. Leu 102 находится на карбокси-конце CDR Н3. Диубиквитин показан светло-серым, и Fab - темно-серым.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

"Человеческий каркас-акцептор" для целей данного описания представляет собой каркас, содержащий последовательность аминокислот каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящие от каркаса человеческого иммуноглобулина или человеческого консенсусного каркаса, как определяется ниже. Челов