Антитела против αβtcr

Антитела против αβtcr

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к антителу, специфическому в отношении альфа-бета Т-клеточного рецептора (αβTCR). В частности, настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу против αβTCR, которое получают из моноклонального антитела BMA031 мыши, и к применению указанного гуманизированного антитела в иммуносупрессивной терапии.

Введение

Применение иммуносупрессоров при аутоиммунных заболеваниях и профилактике кризиса отторжения трансплантата органа подтверждено документальными доказательствами, однако этот процесс является далеко не оптимальным. Токсичность, оппортунистические инфекции, цитокиновая буря и увеличенный риск развития рака широко распространены у пациентов, подвергнутых лечению этими средствами. Использование биологических средств в этой области улучшило в некоторой мере результат лечения пациентов, при этом эти побочные эффекты остаются явными.

Применение содержащих поликлональные антитела против лимфоцитов антисывороток с целью иммуносупрессии хорошо известно. Однако получение антисывороток является трудоемким процессом, причем антисыворотки демонстрируют свойства, которые варьируют между партиями, и специфичность, которой можно достичь, используя содержащие поликлональные антитела антисыворотки, является ограниченной.

Продукция моноклональных антител с использованием гибридомной технологии была впервые описана Kohler и Milstein (Nature 256: 495-497 (1975)). По сравнению с содержащими поликлональные антитела антисыворотками моноклональные антитела (мАт) являются более специфическими и обладают постоянными свойствами. мАт чаще и успешнее всего использовались в иммуносупрессивной терапии при клинической трансплантации органов. Однако большинство мАт, используемых в качестве иммуносупрессоров для лечения аутоиммунных заболеваний и для пациентов с трансплантатами, обладает широкой иммуносупрессорной способностью, оказывая, в силу этого, нежелательное воздействие на функционирование широкого спектра иммуноцитов, предположительно не все из которых вовлечены в отторжение трансплантата.

Моноклональные антитела мыши против антигенов в виде рецепторов T-клеточной поверхности были впервые получены в 1979, используя гибридомную технологию (Kung et al. (1979) Science 206: 347-349). Из трех моноклональных антител, обнаруженных Kung et al., одно антитело, названное муромонаб-CD3 (OKT3), обладало определенной специфичностью к CD3-рецептору Т-клетки, взаимодействуя с более чем 95% периферических зрелых Т-клеток, без оказания воздействия на незрелые тимоциты. Связывание OKT3 с CD3 комплексом приводит к интернализации CD3-рецептора и утрате CD3-позитивных клеток на периферии. Успешное лечение с использованием OKT3 связано с быстрым уменьшением CD3-позитивных T-клеток со значением приблизительно 60% до менее чем 5%.

OKT3 широко использовалось для лечения пациентов, у которых происходит острое отторжение аллотрансплантата после трансплантации почки (Russell, P.S., Colvin, R.B., Cosimi, A.B. (1984) Annu. Rev. Med. 35: 63 и Cosimi, A.B., Burton, R.C., Colvin, R.B. et al. (1981) Transplantation 32: 535). Кроме того, OKT3 и кроличий комплемент использовались для удаления зрелых T-клеток из костного мозга донора для предупреждения острой гомологичной болезни (GVHD) при аллогенной трансплантации костного мозга (Prentice, H.G., Blacklock, H.A., Janossy, G. et al. (1982) Lancet 1: 700 и Blacklock, H.A., Prentice, H.G., Gilmore, M.J. et al. (1983) Exp. Hematol. 11: 37). Тогда как лечение с использованием OKT3, по-видимому, является эффективным для профилактики GVHD при аллогенной трансплантации костного мозга для лечения острого лейкоза, комбинированная in vitro/in vivo обработка/лечение с использованием OKT3 не предотвратила развития GVHD во время лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита (Hayward, A.R. et al. (1982) Clin. Lab. Observ. 100: 665). Обработка T-клеток OKT3 вызывает несколько ответных реакций, несоответствующих иммуносупрессии, в том числе активацию T-клеток, продукцию иммуномедиаторов и T3-модуляцию. Теоретически допускают, что содержащий T3-антиген комплекс, распознаваемый CD3-мАт (например, OKT3), играет ключевую роль во время активации T-клеток. Альфа/бета T-лимфоциты распознают лиганды в форме пептид-MHC с помощью мультимерного белкового комплекса, называемого комплексом αβ T-клеточный антиген/рецептор (TCR)^.CD3. Эта структура состоит из непостоянного димера αβTCR, который связывается с антигенами, и трех инвариантных димеров (CD3γε, δε и ζζ), которые участвуют в поверхностном переносе TCR^.CD3, его стабилизации и трансдукции сигнала. Альфа-бета T-клеточный рецептор (αβTCR) представлен на большинстве (приблизительно 95%) T-клеток и играет важную роль в активации T-клеток путем соединения с антигеном, представленным на MHC. Остальные 5% клеток являются позитивными по гамма-дельта T-клеточному рецептору (γδTCR). Популяция γδTCR-позитивных клеток играет важную роль во врожденном иммунном ответе при защите от оппортунистических инфекций бактериального, вирусного и грибкового происхождения. Гамма-дельта T-клетки не играют роли в отторжении трансплантата при трансплантации. Следовательно, направленность против популяции αβTCR-позитивных клеток и сбережение популяции γδTCR-позитивных клеток должны создать возможность для значительной терапевтической эффективности при сохранении исходной иммунной защиты от оппортунистических инфекций.

Моноклональное антитело мыши изотипа IgG2b - BMA031 (Borst et al. (Nov. 1990) Hum. Immunol. 29(3): 175-88; EP0403156) является специфическим для общей детерминанты в комплексе TCR альфа/бета/CD3 и не связывается с гамма-дельта TCR. BMA031 является в высокой степени иммуносупрессорным и способно к индукции апоптоза активированных T-клеток через механизм индуцируемой активацией гибели клеток (AICD) (Wesselborg et al. (May 1993) J. Immunol. 150(10): 4338-4345). In vitro антитело ингибирует реакцию смешанной культуры лимфоцитов, и оно продемонстрировало эффективность в предварительном клиническом испытании в профилактики отторжения трансплантата в ряде сценариев трансплантации цельных органов, а также в лечении острой гомологической болезни (aGVHD) (Kurrle et al. (Feb 1989) Transplant Proc. 21 (1): 1017-1019). BMA031 не соединяется с Fc-гамма рецепторами человека (FcγR) у большей части населения (приблизительно у 10% людей имеются FcγR, которые действительно связываются с изотипом IgG2b мыши). Как таковое, это антитело не приводит к активации T-клеток путем перекрестного связывания T-клеточного рецептора, и, следовательно, оно не вызывает активацию T-клеток или связанный с этим выброс цитокинов. В связи с этим, его профиль является наиболее предпочтительным по сравнению с таковым OKT3. Однако BMA031 является мышиным антителом и, как таковое, не подходит для многократного введения доз являющимся людьми субъектам ввиду образования антимышиных антител человека (HAMA), вызываемого у них.

Несколько гуманизированных вариантов BMA031 было описано (см. EP 0403156; также Shearman et al., (1991) J. Immunol. 147: 4366-4373). Как отмечено в EP0403156, в результате только пересадки CDR не удалось сохранить связывание с антигеном. Один клон со значительными модификациями каркасной области, EuCIV3, успешно связывался с T-клетками; однако, как отмечено в EP0403156, связывание с αβTCR не является столь же эффективным, как в случае исходного антитела BMA031, как определено с помощью анализов конкуренции с использованием проточной цитометрии. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что способность EuCIV3 к ингибированию in vitro иммунной реакции является значительно уменьшенной по сравнению с BMA031 (см. фиг.2). Кроме того, EuCIV3 был первоначально создан на основе IgG1 или IgG4 человека дикого типа, которая все еще продолжает связываться с FcγR. Следовательно, эти гуманизированные антитела давали возможность для активации T-клеток, их пролиферации и сопутствующего выброса цитокинов, и, как таковые, были достоверно отличны от первоначальных свойств BMA031.

Изменение степени/характера гликозилирования антител известно в данной области. Например, известно, что негликозилированные антитела могут обладать в значительной степени модифицированной функцией; см. Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318. Однако негликозилированные формы гуманизированного BMA031 или производные с измененными характерами гликозилирования ранее не были описаны.

Следовательно, в данной области существует потребность в гуманизированном антителе против αβTCR, способности к связыванию которого улучшены по сравнению с таковыми EUCIV3, и у которого преимущественно сохраняется способность к иммуносупрессии и не активации T-клеток BMA031.

Краткое изложение сущности изобретения

В первом аспекте изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу, которое содержит CDR BMA031 и у которого сохраняется аффинность BMA031 в отношении распознаваемого им антигена. В первом варианте осуществления указанное гуманизированное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO:7, 12 или 13, и каркасную область IGH3-23 человека SEQ ID NO:17, где остатком в положении 6 каркасной области является донорный остаток (остаток донорной последовательности); в альтернативном варианте осуществления остатком в положении 18 каркасной области является донорный остаток. Необязательно, остатками в положениях 49 и/или 69 каркасной области являются донорные остатки.

Во втором варианте осуществления гуманизированное моноклональное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO:15 или 16, и каркасную область IGHV1-3*01 человека SEQ ID NO:18, где одним или более остатков в положениях 38, 44 и/или 48 каркасной области является донорный остаток; в альтернативном варианте осуществления остатками в положениях 44 и 48 каркасной области являются донорные остатки.

В третьем варианте осуществления гуманизированное моноклональное антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR SEQ ID NO:14, и каркасную область IGKV3-11*01 человека SEQ ID NO:19, где остатками в положениях 70 и/или 71 каркасной области являются донорные остатки. Необязательно, остатком в положении 46 является донорный остаток.

Примеры антител согласно первому варианту осуществления включают антитела, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из тяжелых цепей, содержащих последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13, и последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:14.

Примеры антител согласно второму варианту осуществления включают антитела, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из тяжелых цепей, содержащих последовательности SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO:14. Гуманизированные антитела согласно описанным вариантам осуществления представляют собой гуманизированные варианты BMA031. Их первичные структуры отличаются от структуры гуманизированного антитела EuCIV3, которое характеризуется уменьшенным связыванием с αβTCR по сравнению с BMA031.

В списке последовательностей CDR указаны посредством аннотации или подчеркивания. Все каркасные области являются последовательностями, находящимися вне CDR, которые определены в соответствии с системой нумерации «Кабат» и являются удлиненными, в соответствующих случаях, при использовании определения CDR «IMGT». Если не указано, что остаток каркасной области изменен для приведения в соответствие с донорной последовательностью, будет обычно подразумеваться, что он является остатком акцепторной последовательности.

Гуманизированные антитела могут содержать константную область. В одном варианте осуществления константная область является человеческой.

Гуманизированные антитела настоящего изобретения можно дополнительно модифицировать посредством конструирования Fc. Иммуноглобулины склонны к перекрестному связыванию с Fcγ-рецепторами, которое может приводить к значительной активации T-клеток в случае антител против T-клеток. Во избежание перекрестного связывания с Fcγ-рецепторами антитела можно модифицировать с удалением Fc-области, например, посредством создания Fab- или Fv-фрагментов; однако усеченные иммуноглобулины лишены полезных эффекторных функций и демонстрируют более короткий период полужизни в кровотоке. Следовательно, Fc-область гуманизированного антитела можно модифицировать для предотвращения перекрестного связывания с Fcγ. Приводимые в качестве примера способы включают создание негликозилированных иммуноглобулинов, например, посредством модифицирования Fc-области в результате мутации N297Q. Иммуноглобулины, которые не связываются с Fcγ, также описаны Armour et al., (1999) Eur. J. Immunol. 29: 2613-2624. Модификация, осуществленная в IgG1, известна как модификация Δab и заключается в комбинации мутации Δa, в результате которой заменены остатки IgG в положениях 327, 330 и 331, и заменены остатки IgG2 в положениях 233-236, и мутации Δb, в результате которой делетирован остаток 236. В другом варианте осуществления может быть изменен характер гликозилирования антител по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления антитело содержит одну или более мутаций S298N, T299A и Y300S.

В вариантах осуществления антитело содержит две или более мутаций N297Q, S298N, T299A и Y300S. Например, обеспечивается гуманизированное антитело, содержащее множественные мутации N297Q/S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S или S298N/Y300S.

Во втором аспекте изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу, которое содержит CDR BMA031, и у которого сохраняются присущие BMA031 способности к подавлению активности Т-клеток. Указанное гуманизированное антитело предпочтительно содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, 13, 15 или 16, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14.

В третьем аспекте изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей по меньшей мере вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного моноклонального антитела согласно предшествующим аспектам описанных вариантов осуществления. Нуклеиновая кислота может кодировать вариабельные и константные области гуманизированного антитела. Тяжелые и легкие цепи могут кодироваться различными молекулами нуклеиновых кислот или одной и той же молекулой нуклеиновой кислоты.

В соответствии с четвертым аспектом изобретение относится к клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту согласно предшествующему аспекту. Клеткой является, например, клетка, адаптированная к экспрессии молекул антител в культуре. Нуклеиновая кислота может содержать сигнальные последовательности и/или другие последовательности или модификации, которые необходимы для или которые модулируют экспрессии(ю) молекулы антитела в клетке и/или секреции(ю) молекулы антитела из клетки.

В другом варианте осуществления изобретение относится к гуманизированному антителу, описанному в предшествующих аспектах, для применения в супрессии T-клеточноопосредованного ответа у субъекта.

Например, T-клеточноопосредованный ответ может быть вовлечен в ситуацию, выбранную из трансплантации ткани, включая трансплантат цельного органа и смешанный тканевый трансплантат, пересадки ткани, рассеянного склероза и сахарного диабета типа 1.

Кроме того, другой вариант осуществления изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего заболеванием, в которое вовлечен аберрантный T-клеточноопосредованный ответ, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтически эффективной дозы антитела согласно описанным вариантам осуществления.

Таким образом, были созданы гуманизированные, неактивирующие антитела против αβTCR, не индуцирующие выброс цитокинов, которые способны к селективной модуляции αβTCR и индукции апоптоза активированных αβTCR-позитивных T-клеток. Эти антитела были созданы для применения в качестве иммуносупрессоров при T-клеточноопосредованных заболеваниях. Эти антитела были созданы посредством гуманизации мышиного антитела против αβTCR BMA031 и посредством конструирования Fc гуманизированных антител для предотвращения соединения с Fc-гамма рецепторами. У антител согласно описанным вариантам осуществления сохраняется аффинность BMA031, в отличие от гуманизированных вариантов BMA031, имеющихся в наличии в данной области. Кроме того, как установлено в in vitro исследованиях коммитирования, способности к иммуносупрессии антител согласно описанным вариантам осуществления превосходят таковые BMA031. Кроме того, в отличие от гуманизированных антител BMA031 предшествующего уровня, антитела согласно описанным вариантам осуществления не индуцируют выброс цитокинов в случае нормальных PBMC.

В соответствии с пятым аспектом изобретение относится к антителу, содержащему модифицированную Fc-область, в котором указанная модифицированная Fc включает в себя модифицированный характер гликозилирования, который уменьшает связывание с рецептором FcγR, включая одну или более мутаций S298N, T299A и Y300S.

В одном варианте осуществления антитело содержит две или более мутаций S297Q, S298N, T299A и Y300S.

В вариантах осуществления антитело содержит множественные мутации N297Q/S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S или S298N/Y300S.

Например, антителом может быть антитело, описанное в предшествующих аспектах настоящего изобретения.

В соответствии с шестым аспектом изобретение относится к полиспецифическому антителу, содержащему по меньшей мере тяжелую цепь первого связывающего домена, описанного в предшествующих аспектах настоящего изобретения, и второго связывающего домена, специфического в отношении опухолевоспецифического антигена.

В одном варианте осуществления первый связывающий домен включает тяжелую цепь согласно второму аспекту настоящего изобретения.

Полиспецифическое антитело может содержать множество различных конформаций; в одном варианте осуществления антитело включает scFv, направленный против TCR/CD3, и scFv, направленный против опухоли.

В одном варианте осуществления полиспецифическое антитело является биспецифическим.

Краткое описание фигур

Фиг.1. BMA031 связывается с αβTCR сильнее, чем EuCIV3.

Конкуренция за связывание между PE-меченным антителом BMA031 и антителами BMA031 MoIgG2b, BMA031 HuIgG1 и EuCIV3 HuIgG1. EuCIV3 характеризуется уменьшенной эффективностью по сравнению с BMA031.

Фиг.2. EuCIV3 является менее эффективным, чем BMA031 в in vitro анализе коммитирования (IVE).

График, демонстрирующий уменьшение эффективности гуманизированного антитела EuCIV3 в биологическом анализе по сравнению с исходным антителом BMA031. CD8+ T-клетки обрабатывали антителами против αβTCR в различных концентрациях (Х-ось) и сокультивировали с аутологичными дендритными клетками, подвергнутыми инкубации со смесью CMV (ЦМВ) пептидов 495-503 (pp65) в течение нескольких дней.

Фиг.3. HEBE1 связывается с αβTCR схоже с BMA031 в анализе конкуренции.

Конкуренция за связывание между PE-меченным антителом BMA031 и антителами BMA031 HuIgG1, HEBE1 HuIgG1 и EuCIV3 HuIgG1. EuCIV3 характеризуется уменьшенной эффективностью по сравнению с BMA031 и HEBE1.

Фиг.4. HEBE1 обладает эффективностью, схожей с эффективностью EuCIV3 в in vitro анализе коммитирования (IVE).

Анализ IVE был выполнен, как описано в связи с фиг.2.

Фиг.5. Схема, демонстрирующая повторяющиеся циклы мутагенеза вариабельных доменов антител против αβTCR.

Каркасная область в затемненном прямоугольнике представляет FR-область, в которой находятся определенные мышиные остатки. Затемненные остатки в первом ряду мутаций являются мышиными аминокислотами, которые полезны для сохранения скорости диссоциации. Затемненные остатки во втором ряду мутаций являются мышиными аминокислотами, окружающими CDR-участки, которые были сохранены во время конечного процесса приближения к зародышевому типу.

Фиг.6. Оптимизированное гуманизированное антитело имеет уменьшенную скорость диссоциации по сравнению с BMA031.

Кинетику диссоциации антител от αβTCR на T-клетках определяли с помощью проточной цитометрии. BMA031 имел меньшую скорость диссоциации по сравнению с EuCIV3 и HEBE1. В результате оптимизации связывающего домена HEBE1 авторы настоящего изобретения смогли уменьшить скорость диссоциации HEBE1.H10 по сравнению с BMA031.

Фиг.7. Оптимизированное гуманизированное антитело имеет уменьшенную скорость диссоциации по сравнению с BMA031.

Кинетику диссоциации антител от αβTCR на T-клетках определяли с помощью проточной цитометрии. В результате оптимизации связывающего домена HEBE1 авторы настоящего изобретения смогли уменьшить скорость диссоциации HEBE1.H66 по сравнению с BMA031.

Фиг.8. Оптимизированное гуманизированное антитело имеет уменьшенную скорость диссоциации по сравнению с BMA031 и в формате Δab, и негликозилированном формате.

Кинетику диссоциации антител от αβTCR на T-клетках определяли с помощью проточной цитометрии.

Фиг.9. Оптимизация HEBE1 приводит к функциональности, эквивалентной таковой BMA031.

Анализ IVE является анализом, описанным на фиг.4. BMA031 ингибировало коммитирование CD8+ T-клеток, поскольку они были неспособны к лизису специфических мишеней в зависимости от дозы. Исходное гуманизированное антитело, HEBE1, не было столь же эффективным, как BMA031, и было способно к ингибированию коммитирования только в наибольшей дозе (схожие результаты были отмечены при использовании второго неулучшенного гуманизированного Ат, HEBE1 H13). Дальнейшие улучшения были внесены в гуманизированное антитело, HEBE1 H10, которое обладало эффективностью, эквивалентной эффективности BMA031 в этом анализе.

Фиг.10. Данные IVE, полученные при использовании антител против αβTCR.

Антитела обоих рядов HEBE1 и GL1 BM продемонстрировали улучшения в результатах IVE при сравнении с BMA031.

Фиг.11. Антиген-позитивные клетки из анализа IVE, определяемые по связыванию специфического в отношении антигена тетрамера.

Клетки, которые являются антиген-позитивными (т.е. были коммитированы в анализе IVE), способны к связыванию молекулы MHC-тетрамер. Когда анализ IVE проводили в присутствии антитела, которое было способно к предотвращению коммитирования T-клеток к антигену, отмечалось меньшее количество клеток, способных к связыванию с MHC-тетрамером в конце анализа.

Фиг.12. Пролиферация PBMC в присутствии антител против αβTCR, OKT3 и стимулирующих сфер.

Стимулирующая активность OKT3 не отмечалась у антител против αβTCR при этом сравнении.

Фиг.13. Выброс цитокинов из PBMC в присутствии антител против αβPTCR.

Профиль выброса цитокинов для антител против αβTCR был схож с профилем, продемонстрированным BMA031.

Фиг.14. Выброс IFN-гамма из T-клеток в анализе IVE.

CD8+ T-клетки обрабатывали антителами против αβTCR в различных концентрациях (см. фиг.2, Х-ось) и сокультивировали с аутологичными дендритными клетками, подвергнутыми инкубации со смесью CMV пептидов 495-503 (pp65) в течение семи дней в in vitro анализе коммитирования (IVE). В этом анализе измеряли выброс IFN-гамма.

Фиг.15. Индуцированный активацией апоптоз с помощью антител против αβTCR.

Апоптоз антиген-стимулированных CD8+ T-клеток индуцировали посредством связывания антител против αβTCR BMA031 и HEBE1 H66. Способность HEBE1 H66 к индукции апоптоза была увеличенной по сравнению с BMA031.

Фиг.16. Выделение мутантов по гликозилированию и негликозилированных антител.

Окрашенный кумасси синим гель, демонстрирующий экспрессию и очистку мутантов по гликозилированию.

Фиг.17. Связывание мутантных антител против αβTCR с FcγRIIIa человека, используя Biacore.

Biacore использовали для оценки связывания с рекомбинантным FcγIIIa человека (V158 & F158).

Фиг.18. Связывание мутантных антител против αβTCR с FcγRI человека, используя Biacore.

Biacore использовали для оценки связывания с рекомбинантным FcγRI человека.

Фиг.19. Выброс цитокинов из PBMC в присутствии являющихся мутантами по гликозилированию антител против αβTCR (день 2).

Профиль выброса цитокинов TNFα, GM-CSF, IFNγ и IL10 для антител против αβTCR был схож с профилем, продемонстрированным BMA031 и H66 дельта AB.

Фиг.20. Выброс цитокинов из PBMC в присутствии являющихся мутантами по гликозилированию антител против αβTCR (день 2).

Профиль выброса цитокинов IL6, IL4 и IL2 для антител против αβTCR был схож с профилем, продемонстрированным BMA031 и H66 дельта AB.

Фиг.21. Выброс цитокинов из PBMC в присутствии являющихся мутантами по гликозилированию антител против αβTCR (день 4).

Профиль выброса цитокинов TNFα, GM-CSF, IFNγ и IL10 для антител против αβTCR был схож с профилем, продемонстрированным BMA031 и H66 дельта AB.

Фиг.22. Выброс цитокинов из PBMC в присутствии являющихся мутантами по гликозилированию антител против αβTCR (день 4).

Профиль выброса цитокинов IL6, IL4 и IL2 для антител против αβTCR был схож с профилем, продемонстрированным BMA031 и H66 дельта AB.

Фиг.23: Профили связывания TRACER.

Профили связывания биспецифических антител и с опухолевыми клетками-мишенями, и с T-клетками человека, определенные с помощью проточной цитометрии.

Фиг.24: Цитотоксическая активность различных плечей для рекрутинга T-клеток.

Была создана панель гуманизированных антител BMA031, и из этой панели был отобран ряд антител, которые демонстрируют цитотоксическую активность в отношении линий клеток, экспрессирующих опухолевоспецифический антиген.

Фиг.25: Профиль выброса цитокинов в случае различных плечей для рекрутинга T-клеток.

Панель TRACER с различными плечами для рекрутинга T-клеток демонстрирует схожие профили выброса цитокинов. Большое количество цитокинов выявляется после активации T-клеток в присутствии клеток-мишеней, тогда как в присутствии только не подвергнутых стимуляции PBMC человека отмечаемые уровни цитокинов значительно ниже.

Фиг.26: Связывание мутантных антител против CD52 с FcγRIII человека, используя Biacore.

Biacore использовали для оценки связывания модифицированных антител против CD52 с рекомбинантным FcγRIII (V158) человека. Антитела против CD52, включающие мутации S298N/Y300S в Fc-домене, использовали для оценки эффекторной функции модифицированной молекулы. A: связывание с пептидом CD52. B: связывание с FcγRIII (V158). C: контрольное связывание с FcRn мыши.

Подробное описание настоящего изобретения

Кроме случаев, оговоренных особо, все технические и научные термины, использованные в данном описании, имеют такие же значения, которые обычно понятны специалисту в области, к которой относится данное изобретение. Любые способы и материалы, которые сходны с описанными в данном описании способами и материалами или эквивалентны им, могут использоваться в способах или методах настоящего изобретения. Все публикации, на которые ссылаются в данном описании, включены посредством ссылки во всей их полноте с целью описания и раскрытия методологий, реагентов и средств, сообщенных в публикациях, которые могли бы использоваться в связи с настоящим изобретением.

Способы и методологии настоящего изобретения, как правило, проводят в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области и описанными в различных общих и более конкретных ссылках, которые приводятся и обсуждаются на всем протяжении настоящего описания, кроме особо оговоренных случаев. См., например, Gennaro, A.R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Hardman, J.G., Limbird, L.E., and Gilman, A.G., eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D.M. and Blackwell, C.C., eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, Vols. l-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C.R. and Graham, A., eds. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed., Springer-Verlag.

Гуманизированное моноклональное антитело, на которое ссылаются в данном описании, является антителом, которое состоит из каркасной области антитела человека, в которую были пересажены определяющие комплементарность участки (CDR) из нечеловеческого антитела. Могут быть также внесены изменения в человеческую акцепторную каркасную область. Методики конструирования и продукции гуманизированных антител хорошо известны в данной области и описаны, например, Cabilly et al., в патенте США 4816567; Cabilly et al., в Европейской патентной заявке № 0125023; Boss et al., в патенте США 4816397; Boss et al., в Европейской патентной заявке № 0120694; Neuberger, M.S. et al., в WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., в Европейской патентной заявке № 0194276 B1; Winter, в патенте США 5225539; Winter, в Европейской патентной заявке № 0239400; Padlan, E.A. et al., в Европейской патентной заявке № 0519596. Дополнительные подробности в отношении антител, гуманизированных антител, сконструированных антител человека и способов их получения можно найти в Kontermann, R. and Diibel, S. eds. (2001, 2010) Antibody Engineering, 2nd ed., Springer-Verlag, New York, NY.

Термин «антитело», кроме особо оговоренных случаев, используется для ссылки на целые антитела, а также на антигенсвязывающие фрагменты таких антител. Например, этот термин охватывает четырехцепочечные IgG молекулы, а также фрагменты антитела.

Как используется в рамках настоящего описания, термин «фрагменты антитела» относится к частям интактного полноразмерного антитела, например, которые, кроме того, описаны ниже.

Антитела могут быть любого класса, например, IgG, IgA или IgM; и любого подкласса, например, IgG1 или IgG4. Различные классы и подклассы иммуноглобулина обладают различными свойствами, которые могут быть выгодны при различных применениях. Например, антитела подкласса IgG4 характеризуются уменьшенным связыванием с Fc-рецепторами.

Специфичность, применительно к описываемым в настоящем описании антителам, означает, что заявленное антитело способно к селективному связыванию с распознаваемым им определенным антигеном, которым является комплекс αβTCR^.CD3. Антитела настоящего изобретения связываются с комплексом αβTCR^.CD3, представленным на поверхности клеток.

Комплекс αβTCR/CD3 человека является T-клеточным рецепторным комплексом, представленным на поверхности T-клеток. См. Kuhns ef al., (2006) Immunity 24: 133-139. На этот комплекс направлено моноклональное антитело мыши BMA031 (см. Европейскую патентную заявку № EP 0403156; SEQ ID NO:1 и 2).

Природные иммуноглобулины имеют общую основную структуру, в которой две идентичные легкие цепи (приблизительно 24 кДа) и две идентичные тяжелые цепи (приблизительно 55 или 70 кДа) образуют тетрамер. Амино-концевая часть каждой цепи известна как вариабельная (V) область, и ее можно отличить от более консервативных константных (C) областей остальной части каждой цепи. В вариабельной области легкой цепи (также называемой V_L-доменом) находится C-концевая часть, известная как J-фрагмент. В вариабельной области тяжелой цепи (также называемой V_H-доменом) находится D-фрагмент помимо J-фрагмента. Большая часть вариаций в аминокислотных последовательностях иммуноглобулинов локализуется в трех различных местах в V-областях, известных как гипервариабельные участки или определяющие комплементарность участки (CDR), которые непосредственно участвуют в связывании антигена. Начиная с амино-конца, эти участки обозначают как CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно. Положения CDR фиксируются с помощью более консервативных каркасных областей (FR). Начиная с амино-конца, эти области обозначают как FR1, FR2, FR3 и FR4, соответственно. Местонахождения CDR и FR-областей и система нумерации были определены Kabat et al. (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991), и его обновления, которые можно найти онлайн). Кроме того, границы CDR-участков были также определены в соответствии с номенклатурой IMGT.

Вариабельные области антител согласно описанным вариантам осуществления можно найти в SEQ ID NO:5-7 и 12-16, и их можно получить посредством гуманизации BMA031, т.е. посредством переноса CDR BMA031 в каркасную область человека. Описаны два ряда гуманизированных антител: ряд HEBE1, включающий SEQ ID NO:5-7, 12 и 13, и ряд GL1BM, включающий вариабельные области тяжелых цепей, представленные в SEQ ID NO:8, 15 и 16. В обоих случаях используемой вариабельной областью легкой цепи является та, которая представлена в SEQ ID NO:14 (GL1BM VK43).

Используемыми каркасными областями человека являются IGH3-23, в случае HEBE1 и IGHV1-3*01, и IGKV3-11*01, в случае GL1BM.

Константные области могут быть получены из константных областей любых антител человека. Гены вариабельных областей можно клонировать в экспрессионные векторы в рамке считывания с генами константных областей для экспрессии тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Такие экспрессионные векторы можно трансфицировать в продуцирующие антитела клетки-хозяев для синтеза антител.

Вариабельные и константные области антител человека можно получить из баз данных, касающихся последовательностей. Например, последовательности иммуноглобулинов имеются в базе данных IMGT/LIGM (Giudicelli et al., (2006) Nucleic Acids Res. 34:(suppl. 1):D781-D784) или VBase (vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk).

Негликозилированные антитела могут обладать в значительной степени модифицированной функцией; см. Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318. Модификация «дельта ab» или Δab, приведенная в данном описании, является модификацией Fc, которая описана в Armour et al., (1999) Eur. J. Immunol. 29: 2613-2624. Способы изменения гликозилирования Fc-областей антител известны в данной области и включают химические, ферментативные и мутационные способы, например, мутацию положения N297 в CH₂-домене. Способы мутирования генов антител для получения негликозилированных IgG молекул описаны в Tao and Morrison (1989) J. Immunol. 143: 2595-2601.

«Нуклеиновые кислоты», приведенные в данном описании, включают молекулы ДНК, которые кодируют антитела настоящего изобретения. Предпочтительными являются экспрессионные векторы, которые подходят для экспрессии генов антител в клетке-хозяине. Экспрессионные векторы и клетки-хозяева для экспрессии генов антител известны в данной области; см., например, Morrow, K.J. Genetic Engineering & Biotechnology News (June 15, 2008) 28(12), и Backliwal, G. et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36(15):e96-e96.

1. Антитела

Настоящее изобретение охватывает антигенсвязывающие фрагменты гуманизированных антител против αβTCR. Фрагменты антител способны к связыванию с комплексом αβTCR^.CD3. Они охватывают Fab-, Fab'-, F(ab')₂ и F(v)-фрагменты или отдельные вариабельные области легких или тяжелых цепей или их части. Фрагменты включают, например, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv и scFv. В их фрагментах отсутствует Fc-часть интактного антитела, они подвержены более быстрому клиренсу из кровотока и могут характеризоваться менее неспецифическим связыванием с тканями, чем интактное антитело. Эти фрагменты можно получить из интактных антител, используя хорошо известные способы, например, протеолитическое расщепление такими ферментами, как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')₂-фрагментов).

Антитела и фрагменты также охватывают одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv), которые связываются с комплексом αβTCR^.CD3. scFv включает вариабельную область тяжелой цепи антитела (V_H), функционально связанную с вариабельной областью легкой цепи антитела (V_L), причем вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи, вместе или по отдельности, образуют сайт связывания, который связывается с αβTCR. scFv может включать V_H-область на амино-конце и V_L-область на карбоксильном конце. Альтернативно, scFv может включать V_L-область на амино-конце и V_H-область на карбоксильном конце. Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, V_L и V_H, кодируются различными генами, их можно соединить, используя методы рекомбинантных молекул, с помощью синтетического линкера, который делает возможным их создание в виде одной белковой цепи, в которой V_L- и V_H-области спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv)). scFv может, кроме того, необязательно включать линкер-полипептид между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи.

Антитела и фрагменты также охватывают фрагменты-домены антител (dAb), описанные в Ward, E.S. et al. (1989) Nature 341: 544-546, которые состоят из V_H-домена.

Антитела и фрагменты также охватывают антитела-тяжелые цепи (HCAb). Согласно сообщениям, эти антитела образуют антигенсвязывающие области, используя только вариабельную область тяжелой цепи, поскольку эти функциональные антитела являются димерами только тяжелых цепей (называемыми «антителами-тяжелыми цепями» или «HCAb»). Соответственно, антитела и фрагменты могут быть антителами-тяжелыми цепями (HCAb), которые специфически связываются с комплексом αβTCR^.CD3.

Антитела и фрагменты также охватывают антитела, которые представляют собой SMIP или гибридные белки связывающий домен-домены иммуглобулинов, специфические в отношении комплекса αβTCR^.CD3. Эти конструкции представляют собой одноцепочечные полипептиды, включающие антигенсвязывающие домены, слитые с доменами иммуноглобулинов, необходимыми для выполнения эффекторных функций антител (см. WO 2005/017148).

Антитела и фрагменты также охватываю