Способ получения растворимого fcr в виде fc-гибрида с инертной fc-областью иммуноглобулина и их применения

Способ получения растворимого fcr в виде fc-гибрида с инертной fc-областью иммуноглобулина и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Здесь описан способ получения растворимых рецепторов Fc в виде слитого полипептида с инертной областью Fc иммуноглобулина с предотвращением самоагрегации и их применения, как, например, в хроматографических колонках с FcR, при определении взаимодействия FcR с низкоаффинными антителами.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммуноглобулин, в общем, содержит две легкие полипептидные цепи и две тяжелые полипептидные цепи. Каждая из тяжелой и легкой полипептидных цепей содержит вариабельную область (обычно аминоконцевая часть полипептидной цепи), которая содержит связывающий домен, который способен взаимодействовать с антигеном. Каждая из тяжелой и легкой полипептидных цепей также содержит константную область (обычно карбоксиконцевая часть). Константная область тяжелой цепи опосредует связывание иммуноглобулина, например, с клетками, несущими рецептор Fc гамма (FcγR), такими как фагоциты, или с клетками, несущими неонатальный рецептор Fc (FcRn), также известный как рецептор Брамбелла, и также опосредует связывание с некоторыми факторами, включая факторы классической системы комплемента, такие как компонент (C1q).

Hulett и Hogarth (Hulett, M.D. and Hogarth, P.M., Adv. Immunol. 57 (1994) 1-127) сообщали о том, что внеклеточными рецепторами в отношении Fc части иммуноглобулинов класса G является семейство трансмембранных гликопротеинов, содержащее три разных типа рецепторов, имеющих разную специфичность связывания: FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Рецепторы типа I взаимодействуют с lgG, не находящимся в составе комплекса, тогда как рецепторы типа II и III предпочтительно взаимодействуют с lgG, находящимся в составе комплекса.

Человеческий FcγRIII (CD 16) существует в двух изоформах и двух полиморфных формах. Первая изоформа FcγRIIIa представляет собой трансмембранную молекулу, кодируемую геном, отличным от гена второй изоформы FcγRIIIb, которая представляет собой мембранный белок, заякоренный GPI (гликозилфосфатидилинозитол). Полиморфная форма V159 имеет остаток валина в положении 159 аминокислотных последовательностей, тогда как полиморфная форма F159 имеет остаток фенилаланина в положении 159.

Для класса иммуноглобулинов lgG ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) и ADCP (антителозависимый клеточный фагоцитоз) управляются занятием областью Fc семейства рецепторов, названных рецепторы Fc-гамма (Fcγ) - FcγR. У человека данное семейство белков содержит FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIA, FcγRIIB и FcγRIIC, и FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIA и FcγRIIIB (Raghavan and Bjorkman, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12 (1996) 181-220; Abes, et al., Expert Reviews (2009) 735-747). FcγR экспрессируются на целом ряде иммунных клеток, и образование комплекса Fc/FcγR рекрутирует данные клетки к сайтам связанного антигена, что типично приводит к сигнализации и последующим иммунным ответам, таким как высвобождение медиаторов воспаления, активация В-клеток, эндоцитоз, фагоцитоз и цитотоксическая атака. Кроме того, в то время как FcγRI, FcγRIIA/C и FcγRIIIA представляют собой активирующие рецепторы, характеризуемые внутриклеточным иммунорецепторным активирующим мотивом на основе тирозина (ITAM), FcγRIIB имеет ингибирующий мотив (ITIM) и, следовательно, является ингибирующим. В то время как FcγRI связывается с мономерным lgG с высокой аффинностью, FcγRIII и FcγRII являются низкоаффинными рецепторами, взаимодействующими с входящими в состав комплекса или агрегированными lgG.

Связывание lgG с активирующими и ингибирующими рецепторами Fcγ или первым компонентом комплемента (C1q) зависит от остатков, локализованных в шарнирной области и домене СН2. Две области домена СН2 являются критически важными для связывания с FcγR и C1q комплемента и имеют уникальные последовательности. Замена остатков в положениях 233-236 человеческого lgG1 и lgG2 и остатков в положениях 327, 330 и 331 lgG4 значительно уменьшала ADCC и CDC (клеточно-опосредованная цитотоксичность) (Armour, et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624; Shields, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). Idusogie, et al. (J. Immunol 166 (2000) 2571-2575) картировали сайт связывания C1q для терапевтического антитела ритуксан® и показали, что замена Pro329Ala уменьшала способность ритуксимаба связываться с C1q и активировать комплемент. Сообщали о том, что замена Pro329 на Ala приводит к ослабленному связыванию с рецепторами FcγRI, FcγRII и FcγRIIIA (Shields, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604), но данная мутация также была описана как демонстрирующая связывание с FcγRI и FcγRII, подобное дикому типу, и лишь очень малое уменьшение связывания с рецептором FcγRIIIA (Таблица 1 и Таблица 2 в ЕР 1068241, Genentech).

В WO 2010/048313 описан рекомбинантный FcRn и его варианты для очистки слитых белков, содержащих Fc. Высокий уровень экспрессии и секреции слитых белков Fc-X в клетках млекопитающих описан Lo et al. (Lo, K-М., et al., Prot. Eng. 11 (1998) 495-500). Dumont, F.A., et al. (Biodrugs 20 (2006) 151-160) описывают мономерные слияния с Fc. Терапевтические средства на основе слияния рецептор-Fc, уловители и технология MIMETIBODYTM описаны Huang, С. (Curr. Opin. Biotechnol. 20 (2009) 592-599). В WO 01/03737 описаны слитые белки на основе иммуноглобулина. Экспрессия и экспорт белков против ожирения в виде слитых белков с Fc описаны в WO 00/40615.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Обнаружили, что можно получать растворимые рецепторы Fc путем проведения экспрессии рецептора Fc в виде слитого полипептида с областью Fc, которая по существу не связывается со слитым рецептором Fc. Применение слитого полипептида для экспрессии рецептора Fc увеличивает достижимый выход рецептора Fc либо в форме слитого полипептида, либо в виде выделенного рецептора. Кроме того, описанный здесь слитый полипептид обеспечивает повышенную гибкость для объединения более чем одной копии рецептора Fc в одной молекуле, например, для увеличения авидности, или для объединения разных рецепторов Fc (разного происхождения или разного типа, или и того, и другого) в одной молекуле.

Одним аспектом, как здесь описано, является слитый полипептид согласно формуле I

где

R1 обозначает первый рецептор Fc,

R2 обозначает второй рецептор Fc, и

FC обозначает полипептид области Fc тяжелой цепи,

в котором присутствуют R1 или R2, или оба,

в котором FC по существу не связывается с R1 и/или R2.

В одном воплощении слитый полипептид имеет формулу II

где

R1 обозначает первый рецептор Fc,

R2 обозначает второй рецептор Fc, и

FC обозначает полипептид области Fc тяжелой цепи,

CS1 обозначает первый сайт расщепления,

CS2 обозначает второй сайт расщепления,

CS3 обозначает третий сайт расщепления,

CS4 обозначает четвертый сайт расщепления,

L1 обозначает первую промежуточную аминокислотную последовательность и

L2 обозначает вторую промежуточную аминокислотную последовательность,

в котором присутствуют R1 или R2, или оба,

в котором любой из CS1, CS2, CS3, CS4, независимо от других, может присутствовать или отсутствовать,

в котором L1 и L2 могут независимо друг от друга присутствовать или отсутствовать,

в котором FC по существу не связывается с R1 и/или R2.

В одном воплощении R1 и R2 независимо друг от друга выбраны из группы человеческого рецептора Fc гамма, человеческого неонатального рецептора Fc, мышиного рецептора Fc и кроличьего неонатального рецептора Fc.

В одном воплощении человеческий рецептор Fc гамма выбран из человеческого FcγRI (CD64), человеческого FcγRII (CD32), человеческого FcγRIIA, человеческого FcγRIIB, человеческого FcγRIIC, человеческого FcγRIII (CD16), человеческого FcγRIIIA и человеческого FcγRIIIB.

В одном воплощении человеческий неонатальный рецептор Fc представляет собой человеческий FcRn.

В одном воплощении мышиный рецептор Fc выбран из мышиного FcγRI (CD64), мышиного FcγRII (CD32), мышиного FcγRIIB, мышиного FcγRIII (CD16), мышиного FcγRIII-2 (CD16-2), и мышиного FcγRIV.

В одном воплощении FC представляет собой вариант полипептида тяжелой цепи, выбранный из группы полипептида тяжелой цепи человеческого lgG, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG, полипептида тяжелой цепи кроличьего lgG.

В одном воплощении FC представляет собой вариант полипептида тяжелой цепи, выбранный из группы полипептида тяжелой цепи человеческого lgG1, полипептида тяжелой цепи человеческого lgG2, полипептида тяжелой цепи человеческого lgG3, полипептида тяжелой цепи человеческого lgG4, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG1, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG2, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG2a, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG3, полипептида тяжелой цепи кроличьего lgG.

В одном воплощении полипептид области Fc тяжелой цепи имеет мутацию аминокислоты в одном или более чем одном положении 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 288, 297, 298, 299, 307, 311, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 434 и 435.

В одном воплощении один или более чем один рецептор Fc представляет собой рецептор Fc гамма.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG1 имеет мутацию в одном или более чем одном положении аминокислоты 233, 234, 235, 236, 265, 297, 329 и 331.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG1 имеет одну или более чем одну мутацию аминокислот Е233Р, L234A, L235A, L235E, AG236, D265A, N297A, N297D, Р329А, P329G и P331S.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG1 имеет мутации аминокислот L234A и L235A и одну или более чем одну из Е233Р, L235E, AG236, D265A, N297A, N297D, Р329А, P329G и P331S.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG1 имеет мутации аминокислот L234A и L235A и Р329А или P329G.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG2 имеет мутации в одном или более чем одном положении аминокислоты 233, 234, 235, 236, 265 и 329.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG4 имеет мутацию в одном или более чем одном положении аминокислоты 228, 235, 265 и 329.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG4 имеет одну или более чем одну мутацию S228P, L235E, Р329А и P329G.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG4 имеет мутации S228P и L235E, и Р329А или P329G.

В одном воплощении полипептид области Fc тяжелой цепи имеет мутацию аминокислоты в одном или более чем одном положении 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 272, 285, 288, 290, 291, 308, 309, 310, 311, 314, 385, 386, 387, 428, 433, 434, 435 и 436.

В одном воплощении один или более чем один рецептор Fc представляет собой FcRn.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG имеет мутацию в одном или более чем одном положении аминокислоты 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 и/или 447.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG, который имеет ослабленное связывание с FcRn, имеет одно или более чем одно изменение аминокислот в положениях аминокислот 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 и/или 447.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG, который имеет ослабленное связывание с FcRn, имеет мутации аминокислот I253A, Н310А и Н435А.

В одном воплощении промежуточная аминокислотная последовательность выбрана из первой группы, содержащей (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G3S)6, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, (G5S)2, (G5S)3 и (G5S)4, или из второй группы, содержащей метку Arg, метку Avi, метку His-Avi, метку His, метку Flag, метку 3xFlag, метку Strep, метку Nano, метку SBP, метку с-myc, метку S, кальмодулинсвязывающий пептид, целлюлозосвязывающий домен, хитинсвязывающий домен, метку GST (глутатион-S-трансфераза), метку МВР (основной белок миелина), или из комбинаций двух элементов из данных групп.

В одном воплощении сайт расщепления выбран из сайта расщепления протеазы lgA, сайта расщепления протеазы гранзим В, сайта расщепления протеазы Tev, сайта расщепления протеазы Precision, сайта расщепления тромбина, сайта протеазы Faktor10a, сайта расщепления протеазы Ides, сайта расщепления энтерокиназы или сайта расщепления протеазы SUMO.

В одном воплощении слитый полипептид не содержит дополнительный сайт расщепления протеазы, но содержит собственный сайт расщепления протеазы, такой как, например, сайт расщепления папаином, сайт расщепления пепсином или сайт расщепления протеазой Ides.

Одним аспектом, как здесь описано, является димерный слитый полипептид, содержащий два слитых полипептида, как здесь описано.

В одном воплощении первый FC содержит мутацию T366W и, возможно, мутацию S354C, и второй FC содержит мутации T366S, L368A и Y407V и, возможно, мутацию Y349C.

В одном воплощении слитый полипептид характеризуется тем, что

а) R1 и R2 первого и второго полипептида являются идентичными,

б) R1 и R2 первого слитого полипептида являются идентичными, R1 и R2 второго слитого полипептида являются идентичными, но отличными от R1 и R2 первого слитого полипептида,

в) R1 первого и второго слитого полипептида являются идентичными, и R2 первого и второго полипептида являются идентичными, но отличными от R1,

г) R1 первого и второго слитого полипептида являются идентичными, и оба R2 отсутствуют,

д) R1 первого и второго слитого полипептида являются отличными, и оба R2 отсутствуют,

е) R2 первого и второго слитого полипептида являются идентичными, и оба R1 отсутствуют,

ж) R2 первого и второго слитого полипептида являются отличными, и оба R1 отсутствуют,

з) R1 первого слитого полипептида и R2 второго слитого полипептида являются отличными, R2 первого слитого полипептида отсутствует, и R1 второго полипептида отсутствует.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения растворимого рецептора Fc, включающий следующие стадии:

а) культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый полипептид, как здесь описано,

б) выделение слитого полипептида из клетки или среды культивирования,

в) возможно расщепление слитого полипептида протеазой,

посредством этого получая растворимый рецептор Fc.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение иммобилизованного слитого полипептида или иммобилизованного димерного слитого полипептида, как здесь описано, в качестве лиганда для аффинной хроматографии.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение иммобилизованного слитого полипептида или иммобилизованного димерного слитого полипептида, как здесь описано, для определения связывания антитела с рецептором Fc.

В одном воплощении слитый полипептид связан с твердой фазой.

Одним аспектом, как здесь описано, является фармацевтическая композиция, содержащая слитый полипептид, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение слитого полипептида, как здесь описано, в изготовлении лекарственного средства.

В одном воплощении данное лекарственное средство предназначено для лечения воспалительного заболевания.

В одном воплощении данное заболевание представляет собой заболевание, характеризуемое повышенными уровнями антитела.

В одном воплощении данное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.

В одном воплощении данное заболевание представляет собой ревматоидный артрит.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описание графических материалов

Фиг. 1. Плазмидная карта плазмиды, экспрессирующей слитый полипептид.

Фиг. 2. Гель аналитического SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) расщепления папаином.

Фиг. 3. 12% Bis Tris гель плюс/минус DTT (дитиотрейтол), расщепление FcгаммаRIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G протеазой PreScission (полоса 3, 8) соответственно, протеазой lgA (полоса 2, 7): можно наблюдать неспецифичное расщепление РР (полосы 3, 8).

Фиг. 4. Разделение и количественное измерение разных гликозилированных форм антитела против Her (дикого типа, наверху) и антитела против Her с модифицированной углеводной частью.

Фиг. 5. Сравнение аффинной колонки, в которой используется FcгаммаRIIIaV158 и FcгаммаRIIIaV158, меченный Fc.

Фиг. 6. Сенсограмма BIAcore ответа слитого полипептида FcгаммаRIIIaV158-Fc LALA P329G демонстрирует более чем 100 единиц ответа по сравнению с FcгаммаRIIIaV158 с 40 RU (единицы ответа); FcgRIIIa V 158_008 обозначает нерасщепленный слитый полипептид, FcgRIIIa V 158_007 обозначает укороченный нефункциональный вариант FcgRIIIa (контроль), FcgRIIIa V 158_jf323 обозначает интактный функциональный вариант FcgRIIIa, содержащий метку HisAvi.

Фиг. 7. Сенсограммы слитого полипептида рецептор Fcгамма V158-Fc LALA P329G (Фиг. 7а), рецептора Fcгамма V158 (Фиг. 7b), расщепленного слитого полипептида рецептор Fcгамма V158-Fc LALA P329G (Фиг. 7c), нефункционального слитого полипептида рецептор Fcгамма V158-Fc LALA P329G (Фиг. 7d) (контроль).

Определения

Термин «связывание с рецептором Fc» обозначает связывание области Fc с рецептором Fc, например, в анализе BIAcore® (Pharmacia Biosensor АВ, Уппсала, Швеция).

В анализе BIAcore® рецептор Fc связывают с поверхностью, и связывание аналита, например, слитого полипептида, содержащего область Fc, или антитела измеряют поверхностным плазмонным резонансом (SPR). Аффинность связывания определяется значениями kа (константа ассоциации: константа скорости ассоциации слитого полипептида, содержащего область Fc, или конъюгата с образованием комплекса область Fc/рецептор Fc), kd (константа диссоциации: константа скорости диссоциации слитого полипептида, содержащего область Fc, или конъюгата от комплекса область Fc/рецептор Fc) и KD (kd/ka). В качестве альтернативы, сигнал связывания сенсограммы SPR можно непосредственно сравнивать с сигналом ответа контроля по отношению к высоте сигнала резонанса и характеристикам диссоциации.

Термин «домен СН2» обозначает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается приблизительно от положения 231 по EU до положения 340 по EU (система нумерации EU (Европейский союз) согласно Kabat). В одном воплощении домен СН2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01 Домен СН2 уникален в том, что он не вступает в тесное парное взаимодействие с другим доменом. Скорее две N-связанных разветвленных углеводных цепи вклиниваются между двумя доменами СН2 интактной нативной области Fc. Высказывали предположение о том, что данный углевод может обеспечивать замену парного взаимодействия домен-домен и помогать стабилизировать домен СН2. Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206.

Термин «домен СН3» обозначает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается приблизительно от положения 341 по EU до положения 446 по EU. В одном воплощении домен СН3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02

Термин «класс» антитела обозначает тип константного домена или константной области, которыми обладает его тяжелая цепь. Существуют пять главных классов антител: lgA, lgD, lgE, lgG и lgM, и несколько из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например, lgG₁, lgG₂, lgG₃, lgG₄, lgA₁ и lgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ соответственно.

Термин «область Fc» обозначает С-концевую область иммуноглобулина. Область Fc представляет собой димерную молекулу, содержащую два полипептида области Fc тяжелой цепи антитела, связанные дисульфидной связью (полипептидные цепи области Fc). Область Fc может быть получена расщеплением папаином или расщеплением IdeS, или расщеплением трипсином интактного (полноразмерного антитела), или может быть получена рекомбинантно.

Область Fc, которую можно получать из полноразмерного антитела или иммуноглобулина, содержит остатки от положения 226 (Cys) до С-конца полноразмерной тяжелой цепи и, таким образом, она содержит часть шарнирной области и два или три константных домена, т.е. домен СН2, домен СН3 и, возможно, домен СН4. Из US 5648260 и US 5624821 известно, что модификация определенных аминокислотных остатков в области Fc приводит к фенотипическим эффектам.

Образование димерной области Fc, содержащей два идентичных или неидентичных фрагмента тяжелой цепи антитела, опосредовано нековалентной димеризацией содержащихся в них доменов СН3 (относительно участвующих аминокислотных остатков, см., например, Dall'Acqua, Biochem. 37 (1998) 9266-9273). Область Fc ковалентно стабилизирована образованием дисульфидных связей в шарнирной области (см., например, Huber, et al., Nature 264 (1976) 415-420; Thies, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79). Введение замен аминокислотных остатков в домен СН3 для того, чтобы нарушить димеризацию посредством взаимодействий доменов СН3-СН3, не оказывает вредного влияния на связывание с FcRn из-за локализации остатков, участвующих в димеризации доменов СН3-СН3, на внутренней поверхности домена СН3, тогда как остатки, участвующие во взаимодействии область Fc-FcRn, расположены снаружи домена СН2-СН3.

Эффекторные функции, ассоциированные с областью Fc, инициируются взаимодействием области Fc с рецепторами клеточной поверхности, специфичными в отношении эффекторной функции. Активацию рецептора, главным образом, могут осуществлять антитела изотипа lgG1, тогда как антитела изотипа lgG2 и lgG4 не имеют эффекторной функции или имеют ограниченную эффекторную функцию.

Рецепторами, индуцирующими эффекторную функцию, являются рецепторы Fc типов (и подтипов) FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Эффекторные функции, ассоциированные с изотипом lgG1, могут быть снижены введением специфических аминокислотных замен в нижней шарнирной области, таких как L234A и/или L235A, которая участвует в связывании с FcγR и C1q. Определенные аминокислотные остатки, особенно локализованные в домене СН2 и/или СН3, также ассоциированы с периодом полувыведения молекулы антитела или слитого полипептида с областью Fc в системе кровообращения. Период полувыведения в системе кровообращения определяется связыванием области Fc с неонатальным рецептором Fc (FcRn).

Нумерация аминокислотных остатков в константной области антитела осуществляется согласно индексу EU по Kabat (Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.).

Термин «область Fc человеческого происхождения» обозначает С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина человеческого происхождения, которая содержит по меньшей мере часть шарнирной области, домен СН2 и домен СН3. В одном воплощении область Fc тяжелой цепи человеческого lgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) области Fc может присутствовать или может не присутствовать. Если здесь не определено иначе, нумерация аминокислотных остатков в области Fc или константной области осуществляется согласно системе нумерации EU, также именуемой индекс EU, как описано в Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

Термин «часть области Fc, связывающаяся с FcRn» обозначает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается приблизительно от положения 243 по EU до положения 261 по EU и приблизительно от положения 275 по EU до положения 293 по EU, и приблизительно от положения 302 по EU до положения 319 по EU, и приблизительно от положения 336 по EU до положения 348 по EU, и приблизительно от положения 367 по EU до положения 393 по EU и положения 408 по EU, и приблизительно от положения 424 по EU до положения 440 по EU. В одном воплощении изменен один или более чем один из следующих аминокислотных остатков согласно нумерации EU по Kabat: F243, Р244, Р245 Р,

Полипептидная цепь человеческой области Fc дикого типа изотипа lgG1 имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутациями L234A, L235A имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутациями T366S, L368A и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутациями L234A, L235A и T366S, L368A и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией L234A, L235A и T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией L234A, L235A и P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией P239G и T366S, L368A и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией P329G и T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией L234A, L235A, P329G и T366S, L368A и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией L234A, L235A, P329G и T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь человеческой области Fc дикого типа изотипа lgG4 имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG4 с мутацией S228P и L235E имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG4 с мутацией S228P, L235E и P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

Термин «рецептор Fc», сокращенно: «FcR», обозначает рецептор, который связывается с областью Fc. В одном воплощении FcR представляет собой человеческий FcR с нативной последовательностью. Кроме того, в одном воплощении FcR представляет собой FcR, который связывается с антителом lgG (рецептор Fc гамма), и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая их аллельные варианты и формы, образовавшиея в результате альтернативного сплайсинга. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют аналогичные аминокислотные последовательности, которые отличаются, главным образом, в их цитоплазматических доменах. Обзор FcR делается в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492, Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34, de Haas, et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341. Термином «FcR» здесь охватываются и другие FcR. Данный термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских lgG в плод (см., например, Guyer, et al., J. Immunol. 117 (1976) 587; Kim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249).

Термин «рецептор Fc гамма», сокращенно: «FcγR» или «FcгаммаR» обозначает любого члена семейства белков, которые связываются с областью Fc антитела lgG и кодируются геном FcγR. У человека данное семейство включает, но не ограничивается, FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIA, FcγRIB и FcγRIC, FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIA (включая аллотипы Н131 и R131), FcγRIIB (включая FcγRIIB-1 и FcγRIIB-2), и FcγRIIc, и FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIA (включая аллотипы V158 и F158; запись Р08637 Swiss-Prot; N-конец-

и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIB-NA1 и FcγRIIB-NA2) (см., например, Jefferis et al., Immunol. Lett. 82 (2002) 57-65, полностью включенную посредством ссылки), а также изоформы или аллотипы FcγR. FcγR может происходить из любого организма, включая людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян, но не ограничиваясь ими. Мышиные FcγR включают FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIII-2 (CD16-2), а также изоформы или аллотипы FcγR, но не ограничиваются ими. Во взаимодействии область Fc-FcγR участвуют аминокислотные остатки 234-239 (нижняя шарнирная область), 265-269 (петля В/С), 297-299 (петля D/E) и 327-332 (петля F/G) (Sondermann, et al., Nature 406 (2000) 267-273). Мутации аминокислот, которые приводят к ослабленному связыванию/аффинности в отношении FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB и/или FcγRIIIA, включают N297A (сопутствуют пониженной иммуногенности и продленному полупериоду связывания/аффинности) (Routledge, et al., Transplantation 60 (1995) 847; Friend et al., Transplantation 68 (1999) 1632; Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (1995) 6591), остатки 233-236 (Ward and Ghetie, Ther. Immunol. 2 (1995) 77; Armour et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613). Некоторые типичные аминокислотные замены описаны в US 7355008 и US 7381408.

Термин «неонатальный рецептор Fc», сокращенно: «FcRn», обозначает белок, который связывается с областью Fc антитела lgG и кодируется, по меньшей мере частично, геном FcRn. FcRn может происходить из любого организма, включая людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян, но не ограничиваясь ими. Как известно в данной области, функциональный белок FcRn содержит два полипептида, часто называемых тяжелой цепью и легкой цепью. Легкая цепь представляет собой бета-2-микроглобулин, и тяжелая цепь кодируется геном FcRn. Если здесь не отмечено иное, термин «FcRn» или «белок FcRn» относится к комплексу тяжелой цепи FcRn с бета-2-микроглобулином. Взаимодействующие аминокислотные остатки области Fc с FcRn располагаются около соединения доменов СН2 и СН3. Все остатки, образующие контакт область Fc-FcRn, находятся в пределах одной тяжелой цепи lgG. Участвующими аминокислотными остатками являются 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 (все в домене СН2) и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 (все в домене СН3). Мутации аминокислот, которые приводят к усиленному связыванию/аффинности в отношении FcRn, включают Т256А, Т307А, Е380А и N434A (Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591).

Аминокислотные остатки неонатального рецептора Fc, которые являются консервативными у разных видов, представляют собой остатки гистидина в положении 310 и 435 в области Fc. Данные остатки ответственны за рН-зависимость взаимодействия область Fc-Fc-Rn (см., например, Victor, G., et al., Nature Biotechnol. 15 (1997) 637-640); Dall'Acqua, W. F., et al. J. Immunol. 169 (2002) 5171-5180). Мутации области Fc, которые ослабляют взаимодействие с FcRn, могут уменьшать период полувыведения антитела.

Термин «шарнирная область» обозначает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая соединяет домен СН1 и домен СН2, например, примерно от положения 216 до примерно положения 230 согласно системе нумерации EU по Kabat. Шарнирная область обычно представляет собой димерную молекулу, состоящую из двух полипептидов с идентичной аминокислотной последовательностью. Шарнирная область обычно содержит примерно 25 аминокислотных остатков и является гибкой, обеспечивая независимое движение антигенсвязывающих областей. Шарнирная область может подразделяться на три домена: верхний, средний и нижний шарнирный домен (Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083).

Термин «нижняя шарнирная область» области Fc обозначает отрезок аминокислотных остатков, расположенный непосредственно С-терминально по отношению к шарнирной области, т.е. отрезки 233-239 области Fc согласно нумерации EU по Kabat.

Термин «область Fc дикого типа» обозначает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности области Fc, встречающейся в природе. Человеческие области Fc дикого типа включают нативную область Fc человеческого lgG1 (не-А и А аллотипов), нативную область Fc человеческого lgG2, нативную область Fc человеческого lgG3 и нативную область Fc человеческого lgG4, а также их варианты, встречающиеся в природе.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечивать эффективную биологическую активность содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому вводилась бы композиция.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.

Термин «полипептид» обозначает полимер, состоящий из аминокислот, соединенных пептидными связями, независимо от того, продуцируется ли он в природе или синтетически. Полипептиды из менее чем примерно 20 аминокислотных остатков можно называть «пептидами», тогда как молекулы, состоящие из двух или более чем двух полипептидов, или содержащие один полипептид из более чем 100 аминокислотных остатков можно называть «белками». Полипептид также может содержать неаминокислотные компоненты, такие как углеводные группы, ионы металлов или сложные эфиры карбоновых кислот. Неаминокислотные компоненты могут добавляться клеткой, в которой экспрессируется полипептид, и могут варьировать в зависимости от типа клетки. Полипептиды определяются здесь в терминах структуры их аминокислотного остова или кодирующей их нуклеиновой кислоты. Присоединенные компоненты, такие как углеводные группы, обычно не определены, но, тем не менее, могут присутствовать.

Термин «метка в виде аминокислотной последовательности» обозначает последовательность аминокислотных остатков, соединенных друг с другом пептидными связями, которые имеют специфичные свойства связывания. В одном воплощении метка в виде аминокислотной последовательности представляет собой аффинную метку или метку для очистки. В одном воплощении метка в виде аминокислотной последовательности выбрана из группы, содержащей метку Arg, метку His, метку Avi, метку His-Avi, метку Flag, метку 3xFlag, метку Strep, метку Nano, метку SBP, метку с-myc, метку S, кальмодулинсвязывающий пептид, целлюлозосвязывающий домен, хитинсвязывающий домен, метку GST и метку МВР. В одном воплощении метка в виде аминокислотной последовательности выбрана из группы, содержащей

Термин «ферментативный сайт расщепления» обозначает последовательность аминокислотных остатков, соединенных друг с другом пептидными связями, которые могут специфично расщепляться протеазой. В одном воплощении протеаза представляет собой протеазу lgA, гранзим В, протеазу Tev, протеазу PreScission, тромбин, Faktor10a, протеазу Ides или энтерокиназу.

Термин «протеаза lgA» обозначает протеазу, происходящую из Neisseria gonorrhoeae, с сайтом распознавания, содержащим одну из следующих последовательностей, где «Ф» обозначает положение расщепляемой связи:

Термин «линкер» или «пептидный линкер» в том виде, в котором он используется в пределах данной заявки, обозначает пептидные линкеры природного и/или синтетического происхождения. Они состоят из линейной аминокислотной цепи, в которой мономерными строительными блоками являются 20 встречающихся в природе аминокислот. Данная цепь имеет длину от 1 до 50 аминокислот, предпочтительно от 1 до 28 аминокислот, особенно предпочтительно от 3 до 25 аминокислот. Линкер может содержать повторяющиеся аминокислотные последовательности или последовательности встречающихся в природе полипептидов, таких как полипептиды с функцией шарнира. Данный линкер имеет функцию обеспечения того, что пептид, конъюгированный с антителом против CD4, может выполнять его биологическую функцию, обеспечивая правильное сворачивание пептида и правильную презентацию. Предпочтительно линкер представляет собой «синтетический пептидный линкер», который разработан так, чтобы он был обогащен остатками глицина, глутамина и/или серина. Данные остатки организованы, например, в маленькие повторяющиеся единицы из вплоть до пяти аминокислот, такие как GGGGS, QQQQG или SSSSG. Эта маленькая повторяющаяся единица может повторяться от двух до пяти раз с образованием мультимерной единицы. На амино- и/или карбоксиконцах мультимерной единицы могут быть добавлены вплоть до шести дополнительных, произвольных, встречающихся в природе аминокислот. Другие синтетические пептидные линкеры состоят из одной аминокислоты, которая повторяется от 10 до 20 раз, и могут содержать на амино- и/или карбоксиконце вплоть до шести дополнительных, произвольных, встречающихся в природе аминокислот. Все пептидные линкеры мог