Гибридный полипептид, презентирующий аминокислотные последовательности, и его применение

Гибридный полипептид, презентирующий аминокислотные последовательности, и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Здесь предложен гибридный полипептид, содержащий один или более фрагментов одной или более пептидил-пролил цис/транс изомеразы или одного или более представителей семейства FKBP, и его применение в способах скрининга/селекции антител, картирования эпитопов, а также для применения в качестве иммуногена для получения антител, специфически связывающихся с иммуногенным пептидом или вторичной структурой, которая презентирована гибридным полипептидом.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В последние годы продукция антител, используемых в терапевтических целях, неуклонно увеличивалась, и возможно, что антитела, используемые в терапевтических целях, в ближайшем будущем станут самой большой группой терапевтических средств, предлагаемых для лечения различных заболеваний. Эффект антител, используемых в терапевтических целях, обусловлен их специфичностью, а именно функцией специфического распознавания и связывания мишеней.

Антитела можно получать с применением экспериментальных животных, которых иммунизируют иммуногеном. Иммуноген в большинстве случаев представляет собой полипептид или фрагмент полипептида. Для получения иммуногена в достаточном количестве и с достаточной степенью чистоты можно использовать иммуногены, полученные рекомбинантным способом.

Как правило, для продукции рекомбинантных полипептидов можно использовать прокариотические и эукариотические клетки. Рекомбинантные полипептиды можно получать либо в растворимой форме, либо в виде преципитата (телец включений). Перед хроматографической очисткой нерастворимые полипептиды, содержащиеся во включениях, необходимо растворить.

Как правило, иммуноген представляет собой синтетический или пептидный или рекомбинантный или гибридный или химерный или конъюгированный с носителем полипептид. Для иммунизации иммуноген можно вводить как в чистом виде, так и в сочетании с адъювантом, таким как адъювант Фрейнда.

Knappe, Т.А., et al. (J. Mol. Biol. 368 (2007) 1458-1468) показали, что участок Flap FKBP12 можно заменить IF доменом шаперона SlyD E.coli, обладающего схожей структурой. Химерный гибридный полипептид FKBP12-SlyD проявляет активность пептидил-пролил-цис/транс изомеразы, которая в 200 раз выше, чем у изолированного полипептида.

SlyD E.coli и FKBP12 (дикого типа и мутанты С23А и C23S) могут быть получены рекомбинантным путем в E.coli в растворимой форме с высоким выходом (Standaert, R.F., et al., Nature 346 (1990) 671-674).

FKBP, полученный из термофильных организмов, и SlyD E.coli можно применять в качестве шаперонов для рекомбинантной экспрессии гибридных белков в E.coli (Ideno, A., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 64 (2004) 99-105). Полипептиды SlyD E.coli и FKBP12 представляют собой полипептиды, у которых процесс фолдинга является обратимым (Scholz, С., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 12703-12707).

Аминокислотная последовательность полипептида FKBP12 содержит единственный остаток триптофана в положении 60. Таким образом, для исследования структурной целостности мутантов FKBP12 достаточно проанализировать флуоресценцию, обусловленную триптофаном (DeCenzo, M.T., et al., Protein Eng. 9 (1996) 173-180). Исследование остаточной каталитической активности мутанта FKBP12 можно выполнять путем определения остаточной активности ротамазы (Brecht, S., et al., Neuroscience 120 (2003) 1037-1048; Schories, В., et al., J. Pept. Sci. 13 (2007) 475-480; Timerman, A.P., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 2451-2459). Кроме того, можно определить структурную целостность мутантов FKBP12, определив связывание FK506- или рапамицина (DeCenzo, M.T., et al., Protein Eng. 9 (1996) 173-180).

McNamara, A., et al. (J. Org. Chem. 66 (2001) 4585-4594) описали пептиды с ограниченной конформационной свободой за счет образования алифатических связей между двумя С(альфа) сайтами: дизайн, синтез и неожиданные конформационные свойства i,(i+4)-связанного пептида.

Suzuki, et al. (Suzuki, R., et al., J. Mol. Biol. 328 (2003) 1149-1160) описали трехмерную структуру FKBP архебактерий в растворе, обладающего как функцией пептидил-пролил-цис-транс изомеразы, так и шапероноподобной активностью. Вектор экспрессии, хозяин, гибридный белок, способ получения гибридного белка и способ получения белка описаны в ЕР 1516928. Knappe, Т.A., et al., продемонстрировали, что вставка домена шаперона превращает FKBP12 в мощный катализатор фолдинга белков (J. Mol. Biol. 368 (2007) 1458-1468). Химерный гибридный белок с улучшенной шаперонной активностью и способностью обеспечивать фолдинг описан в WO 2007/077008. В WO 03/000878 описано применение шаперонов FKBP в качестве средства экспрессии. В ЕР 1621555 описаны иммуноген, композиция для иммунологического применения и способ получения антитела с его применением. Rebuzzini, G. (диссертационная работа, выполненная в университете Milano-Bicocca (Италия) (2009)) описал исследование домена NS3 хеликазы вируса гепатита C с целью применения в хемилюминесцентном иммунологическом анализе.

В WO 2007/077008 описаны химерные гибридные белки с улучшенной шаперонной активностью и способностью обеспечивать фолдинг. Превращение FKBP12 в мощный катализатор фолдинга белков за счет вставки домена шаперона описано Knappe et al. (Knappe, T.A., et al., J. Mol. Biol. 368 (2007) 1458-1468).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описанные здесь гибридные полипептиды представляют собой гибридные полипептиды, содержащие i) одну или более частей, полученных из одного, т.е. того же самого, или из разных полипептидов, обладающих активностью PPI или принадлежащих семейству FKBP, и ii) иммуногенного полипептида, встроенного между ними.

Описанные здесь гибридные полипептиды можно применять для иммунизации животного с целью получения антител, специфически связывающихся с иммуногенным полипептидом, встроенным в один или несколько участков одного или более полипептидов, обладающих активностью PPI или принадлежащих семейству FKBP.

Один из аспектов данного описания представляет собой гибридный полипептид согласно формуле I

где

X₁ содержит либо произвольно составленную аминокислотную последовательность, либо аминокислотную последовательность, полученную из первого полипептида,

S₂ и S₁ представляют собой неперекрывающиеся аминокислотные последовательности, полученные из второго полипептида, и

- обозначает пептидную связь,

где второй полипептид представляет собой полипептид, обладающий активностью пептидил-пролил цис/транс-изомеразы (активность PPI) или полученный из полипептидов семейства, имеющих домен FKBP.

Было обнаружено, что с использованием гибридных полипептидов, описанных здесь, можно получить антитела, которые специфически связываются с внутренними (так называемыми скрытыми или погруженными) эпитопами (естественного происхождения) аминокислотной последовательности. Внутренние эпитопы недоступны при иммунизации по классическим протоколам, поскольку они становятся доступны, например, только после активации и последующих конформационных перестроек антигенного полипептида (такого, как рецептор). Более того, можно получить антитела, которые специфически связываются с иммуногенными полипептидами, которые получены на основе структур, которые иначе трудно получить в достаточном количестве или с достаточным качеством.

Гибридные полипептиды, описанные здесь, представляют собой химерные рекомбинантные полипептиды, которые можно использовать для экспонирования вторичной и третичной структуры пептидов, например, в способах скрининга/селекции антител или для картирования эпитопов, а также в качестве иммуногенов для получения антител, специфически связывающихся с презентированной аминокислотной последовательностью или вторичной структурой антигена. Полипептиды, описанные здесь, могут быть получены рекомбинантным способом, являются термодинамически стабильными, мономерными и растворимыми в водных растворах.

Один из аспектов данного описания представляет собой гибридный полипептид согласно формуле II

где

X₁ содержит либо произвольно составленную аминокислотную последовательность, либо аминокислотную последовательность, полученную из первого полипептида,

S₂ и S₁ представляют собой неперекрывающиеся аминокислотные последовательности, полученные из второго полипептида, и

S₃ и S₀ либо отсутствуют, либо представляют собой неперекрывающиеся аминокислотные последовательности, полученные из третьего полипептида,

S₄ либо отсутствует, либо представляет собой аминокислотную последовательность, полученную из четвертого полипептида,

Х₂ либо отсутствует, либо представляет собой линкерную пептидную последовательность, и

- обозначает пептидную связь,

где второй полипептид и третий полипептид и четвертый полипептид отличаются друг от друга и представляют собой полипептиды, обладающие активностью пептидил-пролил цис/транс-изомеразы (активность PPI) или полученные полипептидов семейства, имеющих домен FKBP.

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид, обладающий активностью пептидил-пролил цис/транс-изомеразы или полученный из полипептидов семейства, имеющих домен FKBP, представляет собой SlyD.

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой полипептид термофила.

В одном воплощении термофил представляет собой термофильную бактерию. В одном воплощении термофильная бактерия принадлежит семейству Thermaceae. В одном воплощении термофил представляет собой Thermus thermophilus.

В одном воплощении термофил представляет собой термофильную архебактерию. В одном воплощении термофильная архебактерия представляет собой гипертермофильную архебактерию. В одном воплощении термофил принадлежит классу Thermococci. В одном воплощении термофил представляет собой Thermococcus gammatolerans.

В одном воплощении оптимальная температура роста термофила составляет по меньшей мере 60°С.

В одном воплощении всех аспектов данного описания в составе аминокислотной последовательности X₁ содержится иммуногенная последовательность. В одном воплощении аминокислотная последовательность X₁ содержит иммуногенную последовательность и один или более участков, полученных из дополнительного полипептида, обладающего активностью пептидил-пролил цис/транс-изомеразы (активностью PPI), или полученных из дополнительного полипептида из семейства имеющих домен FKBP полипептидов, обеспечивающих фолдинг белков, где дополнительный полипептид отличается от второго полипептида.

Аминокислотная последовательность X₁ встроена вместо IF-домена (от англ. «insert-in-flap») второго полипептида. Таким образом, если X₁ идентичен IF-домену, т.е. имеет аминокислотную последовательность IF-домена, гибридный полипептид S₂-X₁-S₁ идентичен соответствующей части второго полипептида естественного происхождения.

В одном воплощении всех аспектов данного описания аминокислотные последовательности S₂ и S₁, полученные из второго полипептида, связаны друг с другом (непосредственно) через IF-домен второго полипептида дикого типа (естественного происхождения).

В одном воплощении всех аспектов данного описания X₁ встроен вместо IF-домена (от англ. «insert-in-flap») второго полипептида.

Один аспект данного описания представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 70% идентичную таковой полипептида описываемого формулой I, при исключении из анализа X₁, или формулой II, при исключении из анализа X₁, X₂ и отсутствующих последовательностей. В одном воплощении полипептид имеет аминокислотную последовательность идентичную по меньшей мере на 80%. В одном воплощении полипептид имеет аминокислотную последовательность идентичную по меньшей мере на 90%. В одном воплощении полипептид имеет аминокислотную последовательность идентичную по меньшей мере на 95%. В одном воплощении полипептид имеет аминокислотную последовательность идентичную по меньшей мере на 98%.

В одном воплощении всех аспектов данного описания X₁ содержит аминокислотную последовательность, которая соответствует скрытому эпитопу.

В одном воплощении всех аспектов данного описания X₁ имеет аминокислотную последовательность размером от 4 до приблизительно 500 аминокислотных остатков. В одном воплощении X₁ имеет аминокислотную последовательность размером от 5 до приблизительно 100 аминокислотных остатков. В одном воплощении X₁ имеет аминокислотную последовательность размером от приблизительно 7 до приблизительно 60 аминокислотных остатков.

В одном воплощении всех аспектов данного описания по меньшей мере один аминокислотный остаток X₁ имеет пост-трансляционные модификации. В одном воплощении один, или два, или три, или четыре, или пять, или шесть, или семь, или восемь, или девять, или десять аминокислотных остатков X₁ имеют посттрансляционные модификации.

В одном воплощении гибридный полипептид описывается следующей формулой

NH₂-S₃-S₂-X₁-S₁-S₀-COOH

где

X₁ содержит либо произвольно составленную аминокислотную последовательность, либо аминокислотную последовательность, полученную из первого полипептида,

S₂ и S₁ представляют собой неперекрывающиеся аминокислотные последовательности, полученные из второго полипептида,

S₃ и S₀ либо отсутствуют, либо представляют собой неперекрывающиеся аминокислотные последовательности, полученные из третьего полипептида, и

- обозначает пептидную связь,

где второй полипептид и третий полипептид отличаются друг от друга и представляют собой полипептиды, обладающие активностью пептидил-пролил цис/транс-изомеразы (активность PPI) или полученные из полипептидов семейства, имеющих домен FKBP.

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид и третий полипептид и четвертый полипептид происходят из различных биологических видов.

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой человеческий полипептид или растительный полипептид или бактериальный полипептид или полипептид архебактерий.

В одном воплощении всех аспектов данного описания третий полипептид представляет собой человеческий полипептид или бактериальный полипептид или полипептид архебактерий.

В одном воплощении всех аспектов данного описания четвертый полипептид представляет собой бактериальный полипептид или полипептид архебактерий.

В одном воплощении всех аспектов данного описания четвертый полипептид представляет собой бактериальный полипептид. В одном воплощении бактериальный полипептид представляет собой полипептид термофильных бактерий. В одном воплощении термофиль относится к семейству Thermaceae. В одном воплощении термофил представляет собой Thermus thermophilus.

В одном воплощении всех аспектов данного описания четвертый полипептид представляет собой полипептид архебактерий. В одном воплощении полипептид архебактерий представляет собой полипептид гипертермофильных архебактерий. В одном воплощении термофил относится к классу Thermococci. В одном воплощении организм архебактерий представляет собой Thermococcus gammatolerans.

В одном воплощении всех аспектов данного описания оптимальная температура роста термофила составляет по меньшей мере 60°С.

В одном воплощении всех аспектов данного описания первый полипептид представляет собой человеческий полипептид.

В одном воплощении всех аспектов данного описания X₁ либо представляет собой произвольно составленную аминокислотную последовательность, либо аминокислотную последовательность, полученную из первого полипептида, где на N-конце добавлен дипептид GS и на С-конце добавлен трипептид GSS.

В одном воплощении всех аспектов данного описания X₁ представляет собой полипептид согласно формуле III

где Х₀ либо представляет собой произвольно составленную аминокислотную последовательность, либо аминокислотную последовательность первого полипептида, и

где каждый из X_a до X_h обозначает аминокислотный остаток (естественного происхождения) и любой из X_a-h в отдельности может присутствовать или отсутствовать.

В одном воплощении всех аспектов данного описания X₁ представляет собой полипептид, выбранный из группы, представленной формулами с IV по XIII,

где Х₀ либо представляет собой произвольно составленную аминокислотную последовательность, либо аминокислотную последовательность, полученную из первого полипептида.

В одном воплощении Х₀ по N- и С-концам фланкирован отдельными (одиночными) остатками цистеина.

В одном воплощении X₁ содержит остаток цистеина в составе N-концевых аминокислотных остатков и остаток цистеина в составе C-концевых аминокислотных остатков. В одном воплощении N- или C-концевые аминокислотные остатки составляют восемь концевых остатков. В одном воплощении X₁ содержит один остаток цистеина на своем N-конце и один остаток цистеина на своем С-конце.

В одном воплощении X₁ представляет собой замкнутый в кольцо полипептид с ограниченной конформационной свободой.

В одном воплощении X₁ представляет собой замкнутый в кольцо полипептид.

В одном воплощении расстояние между альфа-углеродными атомами остатков цистеина X₁ составляет от 4,3 ангстрема до 6,5 ангстрема. В одном воплощении расстояние между альфа-углеродными атомами остатков цистеина X₁ составляет 4,5 ангстрема. В одном воплощении среднее расстояние между альфа-углеродными атомами остатков цистеина X₁ составляет 5,6 ангстрема.

В одном воплощении всех аспектов данного описания X₁ или Х₀ имеют размер, составляющий от 4 до приблизительно 500 аминокислотных остатков.

В одном воплощении всех аспектов данного описания Х₂ представляет собой линкерную аминокислотную последовательность, имеющую приблизительно от 10 до приблизительно 30 аминокислотных остатков.

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой FKBP13 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:01), или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, при этом S₄, X₂, S₃ и S₀ отсутствуют. В одном воплощении S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:02 (DRGAGC), a S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:03 (CLIPPASV), при этом S₄, X₂, S₃ и S₀ отсутствуют. В одном воплощении S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:04, при этом S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:05, S₄, X₂, S₃, при этом 8о отсутствует, а X₁ представляет собой полипептид согласно формуле IV (GS-X₀-GSS).

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой человеческий FKBP12 (SEQ ID NO:06), или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а S₄, X₂, S₃ и S₀ отсутствуют. В одном воплощении S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:07, а S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:08 (LVFDVELLKLE), a S₄, X₂, S₃ и S₀ отсутствуют, а X₁ представляет собой полипептид согласно формуле III (GS-X₀-GSS) или формуле VI ((P)CG-X₀-GC).

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой SlyD Thermus thermophilus (SEQ ID NO:09) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а S₄, X₂, S₃ и S₀ отсутствуют. В одном воплощении S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, a S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, а S₄, X₂, S₃ и S₀ отсутствуют, a X₁ представляет собой полипептид согласно формуле V (AGS-X₀-GSS) или формуле VI ((P)CG-X₀-GC).

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой FKBP13 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:01), или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а третий полипептид представляет собой человеческий FKBP12 (SEQ ID NO:06) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а S₄ и Х₂ отсутствуют. В одном воплощении S₃ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:07, S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:02 (DRGAGC), S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:03 (CLIPPASV), S₀ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:08 (LVFDVELLKLE), S₄ и X₂ отсутствуют, а X₁ представляет собой полипептид согласно формуле IV (GS-X₀-GSS) или формуле VI ((P)CG-X₀-GC).

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой FKBP13 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:01) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а третий полипептид представляет собой SlyD Thermus thermophilus (SEQ ID NO:09) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а S₄ и Х₂ отсутствуют. В одном воплощении S₃ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:02 (DRGAGC), S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:03 (CLIPPASV), S₀ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 (LVFDVELLKLE), S₄ и Х₂ отсутствуют, a X₁ представляет собой полипептид согласно формуле IV (GS-X₀-GSS) или формуле VI ((P)CG-X₀-GC).

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой FKBP13 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:01) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а третий полипептид представляет собой человеческий FKBP12 (SEQ ID NO:06) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а S₄ и X₂ отсутствуют. В одном воплощении S₃ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:07, S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:02 (DRGAGC), S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:03 (CLIPPASV), S₀ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:08 (LVFDVELLKLE), S₄ и Х₂ отсутствуют, а X₁ представляет собой полипептид согласно формуле IV (GS-X₀-GSS) или формуле VI ((P)CG-X₀-GC).

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой FKBP13 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:01) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, третий полипептид представляет собой человеческий FKBP12 (SEQ ID NO:06) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а четвертый полипептид представляет собой SlyD E.coli (SEQ ID NO:12) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%. В одном воплощении S₄ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:12, Х₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, S₃ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:07, S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:02 (DRGAGC), S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:03 (CLIPPASV), S₀ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:08 (LVFDVELLKLE), a X₁ представляет собой полипептид согласно формуле IV (GS-X₀-GSS) или формуле VI ((P)CG-X₀-GC).

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой FKBP13 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:01) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, третий полипептид представляет собой SlyD Thermus thermophilus (SEQ ID NO:09) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а четвертый полипептид представляет собой SlyD E.coli (SEQ ID NO:12), или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%. В одном воплощении S₄ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:12, Х₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, S₃ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:02 (DRGAGC), S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:03 (CLIPPASV), S₀ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 (LVFDVELLKLE), a X₁ представляет собой полипептид согласно формуле IV (GS-X₀-GSS) или формуле VI ((P)CG-X₀-GC).

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой SlyD Thermus thermophilus (SEQ ID NO:09) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а четвертый полипептид представляет собой SlyD E.coli (SEQ ID NO:12) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, a S₃ и S₀ отсутствуют. В одном воплощении S₄ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, Х₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, S₃ и S₀ отсутствуют, a X₁ представляет собой полипептид согласно формуле V (AGS-X₀-GSS) или формуле VI ((P)CG-X₀-GC).

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой FKBP13 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:01) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а четвертый полипептид представляет собой SlyD E.coli (SEQ ID NO:12) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, a S₃ и S₀ отсутствуют. В одном воплощении S₄ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, Х₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:04, S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:05, S₃ и S₀ отсутствуют, а X₁ представляет собой полипептид согласно формуле IV (GS-X₀-GSS) или формуле VI ((P)CG-X₀-GC).

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой SlyD Thermococcus gammatolerans (SEQ ID NO:106) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, a S₄, X₂, S₃ и S₀ отсутствуют. В одном воплощении S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:107, S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:108, S₄, X₂, S₃ и S₀ отсутствуют, а X₁ представляет собой полипептид, выбранный из формул с IV по XIII.

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой FKBP13 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:01) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а третий полипептид представляет собой SlyD Thermococcus gammatolerans (SEQ ID NO:106) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а S₄ и Х₂ отсутствуют. В одном воплощении Sa имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:107, S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:02 (DRGAGC), S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:03 (CLIPPASV), S₀ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:108, S₄ и Х₂ отсутствуют, a X₁ представляет собой полипептид, выбранный из формул с IV по XIII.

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой FKBP13 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:01) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, третий полипептид представляет собой человеческий FKBP12 (SEQ ID NO:06) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а четвертый полипептид представляет собой SlyD Thermococcus gammatolerans (SEQ ID NO:106) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%. В одном воплощении S₄ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:106, Х₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, S₃ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:07, S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:02 (DRGAGC), S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:03 (CLIPPASV), S₀ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:08 (LVFDVELLKLE), a X₁ представляет собой полипептид, выбранный из формул с IV по XIII.

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой FKBP13 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:01) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, третий полипептид представляет собой SlyD Thermococcus gammatolerans (SEQ ID NO:106) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а четвертый полипептид представляет собой E.coli SlyD (SEQ ID NO:12), или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%. В определенном воплощении S₄ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, X₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, S₃ имеет аминокислотную последовательность of SEQ ID NO:107, S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:02 (DRGAGC), S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:03 (CLIPPASV), S₀ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:108, a X₁ представляет собой полипептид, выбранный из формул с IV по XIII.

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой SlyD Thermococcus gammatolerans (SEQ ID NO:106) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а четвертый полипептид представляет собой SlyD E.coli (SEQ ID NO:12), или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, a S₃ и S₀ отсутствуют. В одном воплощении S₄ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, Х₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:107, S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:108, S₃ и S₀ отсутствуют, а X₁ представляет собой полипептид, выбранный из формул с IV по XIII.

В одном воплощении всех аспектов данного описания второй полипептид представляет собой FKBP13 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:01) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, а четвертый полипептид представляет собой SlyD Thermococcus gammatolerans (SEQ ID NO:106) или полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, a S₃ и S₀ отсутствуют. В одном воплощении S₄ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:107, Х₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, S₂ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:04, S₁ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:05, S₃ и S₀ отсутствуют, a X₁ представляет собой полипептид, выбранный из формул с IV по XIII.

Гибридные полипептиды в аспектах данного описания имеют множество применений, поскольку их можно получать рекомбинантным способом с хорошим выходом, например, в E.coli. Например, гибридные полипептиды можно применять для презентирования аминокислотных последовательностей для иммунизации, получения антител, скрининга антител, картирования эпитопов антител или иммуногистохимического скрининга.

В одном воплощении всех аспектов данного описания Хз имеет аминокислотную последовательность GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:14).

В одном воплощении всех аспектов данного описания X₁ имеет аминокислотную последовательность GGGSGGNPX₀GPTGGGS (SEQ ID NO:32), где X₀ представляет собой аминокислотную последовательность размером от 4 до 85 аминокислотных остатков.

В одном воплощении гибридный полипептид, содержащий аминокислотные последовательности SlyD E.coli и человеческого FKBP12, применяют для презентирования полипептидов с нестабильной конформацией.

В одном воплощении гибридный полипептид, содержащий аминокислотные последовательности человеческого FKBP12 и FKBP13 Arabidopsis thaliana, или только SlyD Thermus thermophilus, или SlyD Thermus thermophilus и FKBP13 Arabidopsis thaliana, или только SlyD Thermococcus gammatolerans, или SlyD Thermococcus gammatolerans и FKBP13 Arabidopsis thaliana, применяют для презентирования стабильных вторичных структур.

Один аспект данного описания представляет собой применение гибридного полипептида согласно данному описанию для индукции у животного иммунного ответа против X₁ или Х₀.

Один аспект данного описания представляет собой способ индукции у животного иммунного ответа против полипептида, включающий этап введения животному гибридного полипептида согласно данному описанию, по меньшей мере однократно, при этом Х₀ представляет собой иммуногенную аминокислотную последовательность.

Один аспект данного описания представляет собой способ получения нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, специфически связывающееся с целевым антигеном, включающий следующие этапы:

a) по меньшей мере однократное введение животному гибридного полипептида согласно данному описанию, у которого аминокислотная последовательность X₁ содержит аминокислотную последовательность целевого антигена,

b) выделение В-клеток животного продуцирующих антитело, специфически связывающееся с целевым антигеном, через 3-10 дней после последнего введения полипептида, и

c) получение из В-клеток нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, специфически связывающееся с целевым антигеном.

Один аспект данного описания представляет собой способ получения антитела, специфически связывающегося с целевым антигеном, включающий след