Антитела к теофиллину и способы их применения

Антитела к теофиллину и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к антителам к теофиллину и способам их применения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Антитела, связывающие гаптены, можно применять в терапевтических и диагностических целях в качестве компонентов, осуществляющих захват. Например, связанные с гаптенами группировки, такие как флуорофоры, хелатирующие реагенты, пептиды, нуклеиновые кислоты, белки, липиды, наночастицы и многие другие агенты, могут вступать в реакцию со связывающими гаптены антителами и производными антител. Это позволяет эффективно детектировать такой "груз", а также осуществлять захват, аккумуляцию в необходимых участках, поперечное сшивание и другие опосредованные антителами действия. Поскольку характеристики и состав гаптенов могут влиять на состав и "поведение" связанных с гаптенами группировок (в т.ч. на размер, активность, биофизические свойства, фармакокинетику, биологическое действие и т.д.), создание разнообразных связывающих гаптены группировок является очень актуальным. Следовательно, для получения оптимизированных конъюгатов гаптенов можно соединить выбранный гаптен и заданный "груз". Затем указанные конъюгаты можно скомбинировать со связывающими гаптен группировками, обладающими оптимальными свойствами, с получением оптимальных комплексов антитело-гаптен-"груз". Также необходимы гуманизированные связывающие гаптен группировки, например, производные антитела. Это позволит существенно снизить риск нежелательных явлений, таких как иммуногенность, при применении в терапевтических целях.

WO 2010/119704 описывает антитела, специфически связывающиеся с бета олигомерами и их применение. US 4855226 описывает новый конкурентный метод определения теофиллина и реагент для него. WO 2010/045388 описывает применение белков, связывающих ММР-9 и ММР-12, для лечения и предупреждения системного склероза. US 6881536 описывает электрохемилюминесцентный метод определения, основанный на использовании частиц.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В изобретении предложены антитела к теофиллину и способы их применения.

Одним объектом в данном описании является гуманизированное антитело к теофиллину, где антитело содержит (а) гипервариабельный участок тяжелой цепи HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (б) гипервариабельный участок легкой цепи HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 и (в) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

В одном воплощении антитело характеризуется константой диссоциации при связывании с человеческим теофиллином (аффинностью) 10^-12 моль/л или менее.

В одном воплощении антитело также содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09, (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 и (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

В одном воплощении антитело также содержит (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, (б) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 и (в) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.

В одном воплощении антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в положении 71 вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток аргинин (нумерация по Кабату).

В одном воплощении антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в положении 46 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток лейцин (нумерация по Кабату).

В одном воплощении антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в положении 71 вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотный остаток аргинин (нумерация по Кабату) и в положении 46 вариабельного домена легкой цепи аминокислотный остаток лейцин (нумерация по Кабату).

В одном воплощении антитело содержит (а) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи VH, идентичную по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12; (б) последовательность вариабельного домена легкой цепи VL, идентичную по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или (в) последовательность VH как в (а) и последовательность VL как в (б), где аминокислотный остаток в положении 71 вариабельного домена тяжелой цепи (нумерация по Кабату) представляет собой аргинин, а аминокислотный остаток в положении 46 вариабельного домена легкой цепи (нумерация по Кабату) представляет собой лейцин.

В одном воплощении антитело содержит VH с последовательностью SEQ ID NO: 12.

В одном воплощении антитело содержит VL с последовательностью SEQ ID NO: 16.

Одним объектом в данном описании является антитело, содержащее VH с последовательностью SEQ ID NO: 12 и VL с последовательностью SEQ ID NO: 16.

В одном воплощении антитело представляет собой полноразмерное антитело lgG1 или полноразмерное антитело lgG4.

В одном воплощении антитело представляет моноклональное антитело.

В одном воплощении антитело представляет фрагмент антитела, связывающий теофиллин.

Одним объектом данного описания является фармацевтическая композиция, содержащая антитело, описанное в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

Одним объектом данного описания является антитело, описанное в данном документе, для применения в качестве лекарственного препарата.

Одним объектом данного описания является применение антитела, описанного в данном документе, для изготовления лекарственного препарата.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1. Экспрессия химерных и гуманизированных антител, связывающих теофиллин: результаты электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДСН-ПАГ) в восстанавливающих условиях демонстрируют состав и гомогенность химерного (средняя дорожка) и гуманизированного (правая дорожка) антител после очистки с использованием белка А и эксклюзионной хроматографии. Левая дорожка - маркер молекулярного веса. Тяжелой Н-цепи (верхняя полоса на уровне 50 кДа) и легкой L-цепи (нижняя полоса на уровне 25 кДа) определяются в виде одиночных полос, дополнительных белковых загрязнений не наблюдается.

Фиг. 2. Иммуноферментный анализ (ИФА) демонстрирует специфичное и эффективное связывание антитела с иммобилизованным теофиллином.

Фиг. 3. Профиль связывания антител, связывающих теофиллин, при исследовании методом SPR (от англ. surface plasmon resonance, поверхностный плазмонный резонанс).

Фиг. 4. а) Состав, структура и молекулярный вес Теофиллина-Cys-Су5; б) эксклюзионная хроматография демонстрирует чистоту и гомогенность очищенных вариантов антител, связывающих теофиллин; пик №2 соответствует очищенному продукту, отсутствие пика №1 указывает на отсутствие агрегатов в препаратах; в) образование ковалентных комплексов между антителами, связывающими теофиллин, и Теофиллином-Cys-Су5 по результатам ДСН-ПАГ в невосстанавливающих (левые дорожки) и восстанавливающих (правые дорожки) условиях; Су5 оказывается связанным с Н-цепью в невосстанавливающих условиях только в образцах, содержащих Теофиллин-Cys-Су5 и антитело с мутацией, вводящей цистеин, эти ковалентные конъюгаты распадаются при восстановлении (правые дорожки). Дорожки: 1 - маркер молекулярного веса; 2-4 - невосстанавливающие условия: 2 - антитело к теофиллину (без мутации, вводящей cys) + Теофиллин-Cys-Су5 (комплекс); 3 - cys_55-антитело к теофиллину + Теофиллин-Cys-Су5 (конъюгат); 4 - cys_54-антитело к теофиллину + Теофиллин-Cys-Су5 (конъюгат); 5-7 - восстанавливающие условия: 5 - антитело к теофиллину (без мутации, вводящей cys) + Теофиллин-Cys-Су5 (комплекс); 6 - cys_55-антитело к теофиллину + Теофиллин-Cys-Су5 (конъюгат); 7 - cys_54-антитело к теофиллину + Теофиллин-Cys-Су5 (конъюгат).

Фиг. 5. Аффинность антитела, связывающего теофиллин, оценивали методом поверхностного плазмонного резонанса в экспериментах на биосенсоре BIAcore. Fab-фрагменты антитела иммобилизовали на поверхности чипа при помощи захватывающего антитела анти-huFab и затем приводили в контакт с "грузом", соединенным с молекулой теофиллина (Тео-пептидом). Формировались комлексы 1:1 (Fab:теофиллин-"груз"). Наблюдалось быстрое связывание (высокая скорость ассоциации), при этом диссоциация не регистрировалась, т.е. значимого высвобождения связанного антигена не наблюдалось.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Определения

"Акцепторные каркасные участки человеческого происхождения" в данном описании представляют собой каркасные участки, содержащие аминокислотную последовательность каркасных участков вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасных участков вариабельного домена тяжелой цепи (VH), полученные на основе каркасных участков иммуноглобулина человека или консенсусных последовательностей каркасных участков человеческого происхождения, как описано ниже. Акцепторные каркасные участки, "полученные на основе" каркасных участков иммуноглобулина человека или консенсусных последовательностей каркасных участков человеческого происхождения, могут содержать ту же аминокислотную последовательность или могут иметь измененную аминокислотную последовательность. В некоторых воплощениях число аминокислотных замен равно 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых воплощениях последовательность человеческих акцепторных каркасных участков VL идентична последовательности каркасных участков VL иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасных участков человеческого происхождения.

"Аффинность" обозначает суммарную силу всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иначе, термин "аффинность связывания" в данном документе обозначает собственную аффинность связывания, которая отражает взаимодействие между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном) при соотношении 1:1. Аффинность молекулы X к своему партнеру Y обычно характеризуют константой диссоциации (Kd). Аффинность определяют общепринятыми способами, известными в данной области техники, включая описанные в данном документе. Некоторые типовые и приведенные в качестве примеров воплощения для измерения аффинности связывания описаны ниже.

Антитело, "подвергнутое аффинному созреванию", обозначает антитело с одной или несколькими модификациями в одном или нескольких гипервариабельных участках (HVR, от англ. hypervariable regions), по сравнению с материнским антителом, не имеющим таких модификаций, указанные модификации повышают аффинность антитела к антигену.

Термины "антитело к теофиллину" и "антитело, связывающее теофиллин" обозначают антитело, способное связывать теофиллин с аффинностью, достаточной для применения антитела в качестве диагностического и/или терапевтического агента, избирательно взаимодействующего с теофиллином. В одном воплощении связывание антитела к теофиллину с неспецифическим белком, отличным от теофиллина, составляет менее 10% от связывания антитела с теофиллином, например, при определении с помощью радиоиммунологического анализа (РИА). В некоторых воплощениях константа диссоциации (Kd) антитела, связывающегося с теофиллином, составляет ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М).

Термин "антитело" в данном документе используется в широком смысле и охватывает антитела с различной структурой, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую антигенсвязывающую активность, но не ограничивается ими.

"Фрагмент антитела" обозначает молекулу, отличную от интактного антитела, содержащую часть интактного антитела, связывающую антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, но не ограничиваются ими.

"Антитело, связывающееся с тем же эпитопом", что и референтное антитело, обозначает антитело, блокирующее связывание референтного антитела с его антигеном в тестах конкурентного связывания на 50% или более, и наоборот, референтное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в тестах конкурентного связывания на 50% или более. Примеры тестов конкурентного связывания приводятся ниже.

Термин "химерное" антитело обозначает антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит от конкретного источника или биологического вида, тогда как оставшаяся часть тяжелой и/или легкой цепи происходит от другого источника или биологического вида.

"Класс" антитела обозначает тип константного домена или константной области его тяжелой цепи. У человека существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть подразделены на подклассы, например, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 и lgA2. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначаются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

Термин "цитотоксический агент" в данном документе обозначает вещество, подавляющее или предотвращающее осуществление клеточной функции и/или вызывающее гибель или разрушение клетки. Цитотоксические агенты включают радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты, ингибирующие рост; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или энзиматически активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая фрагменты и/или их варианты; и различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже, но не ограничиваются ими.

"Эффекторные функции" обозначают такие формы биологической активности, приписываемые Fc-фрагменту антитела, которые варьируются в зависимости от класса антител. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC, от англ. complement dependent cytotoxicity); связывание Fc рецептора; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC, от англ. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity); фагоцитоз; снижение экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора) и активацию В-клеток.

"Эффективное количество" агента, например, в фармацевтической композиции, обозначает количество, позволяющее достичь желаемый терапевтический или профилактический результат в необходимых дозировках и за необходимый период времени.

Термин "Fc фрагмент" в данном описании обозначает С-концевой участок тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий по меньшей мере часть константного участка. Термин включает Fc фрагменты с нативной последовательностью и варианты Fc фрагментов. В одном воплощении Fc фрагмент тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 или от Рго230 до карбокси-конца тяжелой цепи. При этом С-концевой лизин (Lys447) Fc фрагмента может присутствовать или отсутствовать. Если не указано иначе, нумерация аминокислотных остатков Fc фрагмента или константного участка соответствует системе нумерации EU, также носящей название «EU index», согласно описанию Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

"Каркасные участки" или "FR" (от.англ. "framework regions") обозначают остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельных участков (HVR, от англ. hypervariable regions). FR вариабельного домена, как правило, состоит из 4 доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR в составе VH (или VL), как правило, располагаются в следующей последовательности: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Термины "полноразмерное антитело", "интактное антитело" и "полное антитело" в данном описании используются взаимозаменяемо и обозначают антитело, имеющее структуру по существу схожую со структурой нативного антитела, или имеющее тяжелые цепи, содержащие Fc фрагмент, согласно данному описанию.

Термины "клетка-хозяин", "линия клеток-хозяев" и "культура клеток-хозяев" используются взаимозаменяемо и обозначают клетки, в которые была внедрена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформанты" и "трансформированные клетки", включающие первично трансформированные клетки и их потомков, независимо от числа пассажей. Потомство может быть не полностью идентично родительской клетке по содержанию нуклеиновой кислоты, но может иметь мутации. Сюда также включаются мутантные потомки, проявляющие при скрининге или отборе такие же функции или биологическую активность, как и исходные трансформированные клетки.

"Человеческое антитело" представляет собой антитело, имеющее аминокислотную последовательность, которая соответствует последовательности антитела, продуцируемого в организме или в клетках человека, или полученного из источника, не относящегося к человеку, но задействующего репертуар антител человека или иные последовательности, кодирующие антитела человека. Данное определение человеческого антитела в частности исключает гуманизированные антитела, содержащие антигенсвязывающие остатки, не являющиеся человеческими.

"Консенсусные каркасные участки человеческого происхождения" это каркасные участки, представляющие наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в наборе последовательностей каркасных участков VL или VH иммуноглобулинов человека. Как правило, последовательности VL или VH иммуноглобулинов человека выбирают из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу согласно описанию Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. В одном воплощении подгруппой для VL является подгруппа каппа I, согласно Kabat et al., см. выше. В одном воплощении подгруппой для VH является подгруппа III, согласно Kabat et al., см. выше.

"Гуманизированное" антитело обозначает химерное антитело, содержащее аминокислотные остатки гипервариабельных участков, не являющихся человеческими, и аминокислотные остатки каркасных участков человеческого происхождения. В определенных воплощениях гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все HVR (например, CDR, от англ. complementarity determining regions) соответствуют участкам антитела, не являющегося человеческим, и все или по существу все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело может содержать по меньшей мере часть константного участка антитела, полученного из антитела человека. "Гуманизированная форма" антитела, например, антитела не являющегося человеческим, обозначает антитело, прошедшее гуманизацию.

Термин "гипервариабельный участок" или "HVR" в данном описании обозначает каждый из участков вариабельного домена антитела, имеющих гипервариабельную последовательность и/или формирующих петли определенной структуры ("гипервариабельные петли"). Как правило, нативные антитела, состоящие из четырех цепей, имеют 6 HVR; три в VH (Н1, Н2, Н3), и три в VL (L1, L2, L3). Как правило, HVR содержат аминокислотные остатки гипервариабельных петель и/или "участков, определяющих комплементаность" (CDR), последние характеризуются наибольшей вариабельностью последовательности и/или задействованы в распознавании антигена. Например, гипервариабельные петли находятся между аминокислотными остатками 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3). (Chothia, С. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Например, CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) находятся между аминокислотными остатками 24-34 в L1, 50-56 в L2, 89-97 в L3, 31-35 В в Н1, 50-65 в Н2 и 95-102 в Н3. (Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.) Как правило, CDR содержат аминокислотные остатки, образующие гипервариабельные петли, за исключением CDR1 в составе VH. CDR также включают "остатки, определяющие специфичность" или "SDR" (от англ. specificity determining regions), которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR находятся в составе участков CDR, обозначаемых "укороченными CDR", или a-CDR (от англ. abbreviated CDR). Например, a-CDR (а-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) образованы аминокислотными остатками в положениях 31-34 в L1, 50-55 в L2, 89-96 в L3, 31-35 В в Н1, 50-58 в Н2 и 95-102 в Н3. (См. Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). Если не указано иначе, остатки HVR и иные остатки вариабельного домена (например, остатки каркасного участка) в данном документе пронумерованы согласно Kabat et al., см. выше.

"Иммуноконъюгат" представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более гетерологичной(ыми) молекулой(ами), включая цитотоксический агент, но не ограничиваясь им.

"Индивидуум" или "субъект" является млекопитающим. Млекопитающие включают одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и отличных от человека приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс), но не ограничиваются ими. В определенных воплощениях индивидуумом или субъектом является человек.

"Выделенное" антитело представляет собой антитело, изолированное от компонентов его естественного окружения. В некоторых воплощениях антитело очищено до степени чистоты более чем 95% или 99%, при определении, например, с помощью электрофоретических (например, с помощью ДСН-ПАГ, изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), капиллярного электрофореза) или хроматографических методов (например, с помощью ионообменной или обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)). Обзор способов оценки чистоты антител представлен, например, Flatman, S. et al., J. Chrom. В 848 (2007) 79-87.

"Выделенная" нуклеиновая кислота обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, изолированную от компонентов ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, обычно содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты находится внехромосомно или в участке хромосомы, отличном от естественного положения на хромосоме.

"Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к теофиллину" обозначает одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая такую(ие) молекулу(ы) нуклеиновой кислоты в составе одного вектора или в отдельных векторах, при этом такая(ие) молекула(ы) нуклеиновой кислоты находи(я)тся в одном или нескольких местоположениях в клетке-хозяине.

Термин "моноклональное антитело" в данном документе обозначает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связывают один эпитоп, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих мутации, которые возникают естественным путем или в ходе получения препарата моноклонального антитела, при этом подобные варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В противоположность препаратам поликлональных антител, обычно содержащим различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против единственной детерминанты или антигена. Таким образом, определение "моноклональное" указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как необходимость получения антитела определенным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения в соответствии с настоящим изобретением, могут быть произведены с помощью различных технологий, включая гибридомную технологию, технологию рекомбинантной ДНК, технологию фагового дисплея и технологии с использованием трансгенных животных, имеющих все локусы человеческих иммуноглобулинов или их часть; данные способы и другие типовые способы производства моноклональных антител описаны в данном документе.

"Голое антитело" обозначает антитело, не конъюгированное с гетерологичным компонентом (например, цитотоксическим компонентом) или радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтической композиции.

"Нативные антитела" обозначают молекулы иммуноглобулинов, возникающие естественным образом и имеющие различные структуры. Например, нативные антитела класса IgG являются гетеротетрамерными гликопротеинами весом приблизительно 150000 дальтон, состоящими из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидной связью. В направлении от N- к С-концу каждой тяжелой цепи расположен вариабельный участок (VH), также обозначаемый вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которым следуют три константных домена (СН1, СН2 и СН3). Аналогично, в направлении от N- к С-концу каждой легкой цепи расположен вариабельный участок (VL), также обозначаемый вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которым расположен константный легкий домен (CL). Легкая цепь антитела может относиться к одному из двух типов, обозначаемых каппа (κ) и лямбда (λ), в зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена.

Термин "листовка-вкладыш" обозначает инструкции, обычно вкладываемые в коммерческую упаковку терапевтических продуктов, содержащие информацию о показаниях к применению, способах применения, дозировках, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.

"Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" относительно референтной полипептидной последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в референтной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и расстановки пропусков (гэпов), если это необходимо для достижения наибольшего процента идентичности последовательностей, и без принятия каких-либо консервативных замен за часть идентичной последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности выполняют различными способами, известными в данной области техники, например, с помощью общедоступных компьютерных программ, таких как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут выбрать нужные параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. В данном документе значения % идентичности аминокислотной последовательности получены при помощи компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана в компании Genentech, Inc., исходный код был представлен вместе с пользовательской документацией в бюро по охране авторских прав США, Washington D.C., 20559, где было зарегистрировано авторское право под номером TXU510087. Доступ к программе ALIGN-2 можно получить в компании Genentech, Inc., South San Francisco, California, или скомпилировать код программы на основе исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для работы на платформе UNIX, включая платформу digital UNIX V4.0D. Все параметры для сравнения последовательностей заданы программой ALIGN-2 и остаются неизменными.

В случаях, когда для сравнения аминокислотных последовательностей используют ALIGN-2, процент идентичности заданной аминокислотной последовательности А к последовательности В, с последовательностью В, или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью В (что можно также сформулировать как заданная аминокислотная последовательность А, имеющая или содержащая определенный процент идентичной аминокислотной последовательности к последовательности В, с последовательностью В, или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью В) рассчитывают по формуле:

где X - это число аминокислотных остатков, которые были расценены программой для выравнивания последовательностей ALIGN-2 как абсолютные совпадения при выравнивании А и В в рамках этой программы, и где Y - это общее число аминокислотных остатков в В. Следует принимать во внимание, что когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, процент идентичности аминокислотной последовательности А с последовательностью В не будет равен проценту идентичности аминокислотной последовательности В с последовательностью А. Если не указано иначе, все значения % идентичности аминокислотных последовательностей, приведенные в данном документе, получены, как описано в предыдущем параграфе о применении компьютерной программы ALIGN-2.

Термин "фармацевтическая композиция" обозначает препарат, который находится в такой форме, которая обеспечивает эффективное проявление биологической активности содержащегося в нем активного ингредиента, и не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому предстоит введение композиции.

"Фармацевтически приемлемый носитель" обозначает ингредиент в фармацевтической композиции, отличный от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.

Термин "теофиллин", сокращенно "Тео", обозначает 1,3-диметил-7Н-пурин-2,6-дион. Теофиллин также известен под названием диметилксантин.

Используемый в данном документе термин "лечение" (и его грамматические производные, такие как "лечить" или "проводить лечение") обозначает клиническое вмешательство в попытке изменить естественный ход заболевания у индивида, получающего лечение, и может осуществляться как для профилактики, так и при наличии патологического состояния. Желательные эффекты от лечения включают предупреждение возникновения или повторного проявления заболевания, смягчение симптомов, уменьшение любых прямых или непрямых патологических последствий заболевания, предупреждение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение состояния, а также ремиссию или улучшение прогноза, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях антитела по изобретению применяют, чтобы отсрочить развитие заболевания или чтобы замедлить прогрессирование заболевания.

Термин "вариабельный участок" или "вариабельный домен" обозначает домен легкой или тяжелой цепи антитела, задействованный в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей нативного антитела (VH и VL, соответственно), как правило, имеют схожую структуру, каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например., Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), c. 91). Для обеспечения специфичности связывания антигена может быть достаточно одного VH или VL домена. Кроме того, антитела, связывающиеся с конкретным антигеном, можно выделить с использованием VH или VL домена антитела, связывающегося с антигеном, при скрининге библиотеки комплементарных доменов VL или VH, соответственно. См., например, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

Термин "вектор", используемый в данном документе, обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, обеспечивающую передачу другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Термин включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, инкорпорированный в состав генома клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы здесь обозначаются "экспрессирующие векторы".

Термин "гаптен" обозначает низкомолекулярную молекулу, которая способна вызывать иммунный ответ только будучи присоединенной к высокомолекулярному носителю, такому как белок. Примерами гаптенов являются анилин, о-, м- и п-аминобензойная кислота, хинон, гидралазин, галотан, флуоресцеин, биотин, дигоксигенин, теофиллин и динитрофенол. В одном воплощении гаптен представляет собой биотин или дигоксигенин, или теофиллин, или карборан.

Термин "гаптен, конъюгированный с" или "конъюгированное с гаптеном соединение" обозначает гаптен, ковалентно связанный с другим компонентом, таким как полипептид или метка. Активированные производные гаптена часто используют в качестве исходного материала для получения таких конъюгатов. В одном воплощении гаптен представляет собой дигоксигенин и конюгирован с компонентом при помощи линкера (в одном воплощении через свою 3-гидрокси группу). В одном воплощении линкер содержит: а) одну или несколько (в одном воплощении от трех до шести) метилен-карбоксиметильных групп (-СН₂-С(O)-) и/или б) от 1 до 10 (в одном воплощении от 1 до 5) аминокислотных остатков (в одном воплощении выбранных из глицина, серина, глутмата, β-аланина, γ-аминобутировой кислоты, ε-аминокапроновой кислоты или лизина) и/или в) одно или несколько соединений (в одном воплощении одно или два соединения), имеющих структурную формулу NH₂-[(CH₂)_nO]_xCH₂-CH₂-COOH, где n равно 2 или 3, а х принимает значения от 1 до 10, в одном воплощении от 1 до 7. Последний элемент формирует (по меньшей мере частично) линкер (часть линкера), имеющего формулу -NH-[(CH₂)_nO]_xCH₂-CH₂-C(O)-. Одним из примеров таких соединений является 12-амино-4,7,10-триоксадодекановая кислота (формирует триэтиленгликолевый (ТЭГ) линкер). В одном воплощении линкер также содержит малеимидную группу. Линкер оказывает стабилизирующее и солюбилизирующее действие, поскольку несет заряд и/или может образовывать водородные связи. Кроме того, он стерически способствует связыванию между антителом к гаптену и полипептидом, конъюгированным с гаптеном. В одном воплощении линкер расположен на боковой цепи аминокислоты полипептида (например, конъюгирован с боковой цепью лизина или цистеина через аминогруппу или тиоловую группу). В одном воплощении линкер расположен на амино-конце или карбокси-конце полипептида. Участок полипептида, в котором будет располагаться линкер, обычно подбирают таким образом, чтобы расположение линкера не влияло на биологическую активность полипептида. Таким образом, точка присоединения линкера зависит от природы полипептида и соответствующих структурных элементов, отвечающих за биологическую активность. Биологическую активность полипептида, к которому присоединяют гаптен, можно исследовать in vitro.

Термин "образование ковалентного комплекса" означает, что после формирования нековалентного комплекса, например, между антителом к теофиллину и теофиллином, образуется ковалентная связь между двумя партнерами, входящими в состав комплекса. Образование ковалентной связи не требует добавления дополнительных реагентов.

II. Композиции и способы

В одном аспекте изобретение основано на антителах, которые связываются с теофиллином. Такие антитела описаны в данном документе. Антитела по изобретению могут найти применение, например, в качестве моноспецифических антител для связывания конъюгированных с теофиллином соединений и в качестве мультиспецифических антител в диагностике или лечении всевозможных заболеваний, благодаря специфичному связыванию конъюгированного с теофиллином соединения и универсальной способности антитела переносить связанные с ним молекулы.

А. Примеры антител к теофиллину

В одном аспекте изобретения предложены выделенные антитела, которые связываются с теофиллином. В некоторых воплощениях антитела к теофилину представляют собой гума