Очистка полипептидов с использованием двухстадийной ультрафильтрации в тангенциальном потоке

Очистка полипептидов с использованием двухстадийной ультрафильтрации в тангенциальном потоке

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам отделения представляющей интерес молекулы от содержащего указанную молекулу раствора с помощью двухстадийной ультрафильтрации в тангенциальном потоке («TFF»). Способы, предлагаемые в изобретении, направлены, прежде всего, на обработку неочищенных питающих потоков, таких как кондиционированный супернатант клеточной культуры, с целью значительного снижения уровней загрязнителей и/или примесей перед осуществлением более поздних, т.е. последующих операций с использованием очистительных устройств. Способы, предлагаемые в изобретении, можно применять при обработке неочищенного питающего потока из биологических производственных систем, таких как система ферментации или другая система с использованием клеточных культур, и они позволяют также исключать необходимость в осуществлении требующих больших временных затрат процессов осаждения (например, регулируемого значением рН осаждения) примесей и/или фильтрации осадка перед осуществлением последующих процессов, чувствительных к высоким уровням примесей, таких как операции с использованием хроматографических устройств. Описанный двухстадийный процесс TFF объединяет по меньшей мере две операции с использованием устройства для TFF, которые можно осуществлять предпочтительно при значении рН, которое соответствует или близко к значению рН питающего потока, например, супернатанта клеточной культуры, как правило, при рН 7,5±1,0. Применение операций с использованием устройства для TFF для дополнения, усовершенствования или замены традиционных процессов очистки представляющих интерес белков для питающего потока может обеспечивать значительную экономию как прямых, так и косвенных затрат на обработку. Например, помимо косвенной экономии благодаря исключению процессов осаждения и фильтрации осадка снижение уровней примесей в результате операций с использованием устройства для двухстадийной TFF может приводить к косвенной экономии, обусловленной повышением характеристик используемых после этого колонок, например, улучшением хроматографического разделения, динамической связывающей способности, эксплуатационного срока службы и/или уменьшением требуемого размера колонок. В конкретных вариантах осуществления изобретения способы, предлагаемые в изобретении, применяют в процессах очистки молекул иммуноглобулина, например, антител, где указанные процессы не включают стадии аффинной очистки, например, аффинной хроматографической очистки с использованием белка А.

Предпосылки создания изобретения

Настоящее изобретение относится к способам отделения и/или очистки представляющих интерес молекул, прежде всего биомолекул (например, белков), от/из неочищенных и/или производственных растворов, содержащих молекулы. В качестве направления биотехнологического развития все больший интерес приобретает экономически выгодная обработка в больших масштабах биомолекул из неочищенных производственных растворов. В частности, экономические вопросы производства и обработки могут играть определяющую роль в принятии решений, касающихся разработки и получения биомолекул и/или фармацевтических средств, включая ферменты, антитела и другие специализированные белки и пептиды. Для получения большинства из таких биомолекул (например, белков, полипептидов, антител) в качестве метода производства выбирают методы на основе рекомбинантной ДНК. С помощью таких методов можно осуществлять экспрессию требуемых биомолекул в больших количествах в разнообразных биологических системах. Такие системы включают клеточные системы (такие как культуры клеток бактерий, дрожжей, насекомых и млекопитающих (например, характеризующиеся эндогенной экспрессией представляющего интерес белка или культуры трансгенных клеток)), трансгенных животных и трансгенных растений. Биомолекулярные пути, присущие системам клеточных культур или системам in vivo также стали незаменимыми компонентами, применяемыми в системах производства in vitro. Однако при использовании указанных систем производства биофармацевтическая индустрия столкнулась одновременно с необходимостью разработки усовершенствованных или новых систем выделения требуемой биомолекулы (например, белка) из неочищенных производственных растворов или производственных материалов. Неочищенные производственные растворы включают кондиционированные среды для культивирования клеток, осветленные гомогенизированные/лизированные кондиционированные клеточные культуры, общую воду организма трансгенных животных (например, кровь, сыворотку, молоко и мочу) и производственные растворы, применяемые in vitro, которые содержат исходные материалы и компоненты помимо рассматриваемой биомолекулы. Методы выделения должны не только приводить к получению выделенного продукта, удовлетворяющего утвержденным правительством стандартам чистоты и безопасности, но они должны также быть экономически выгодными.

Процессы очистки, наиболее выгодные для выделения биомолекул из неочищенных производственных растворов, как правило, включают хроматографические процессы и/или операции с использованием устройств на основе аффинности. Хроматография на основе аффинности позволяет разделять биомолекулы на основе специфического взаимодействия представляющей интерес биомолекулы со связывающим фрагментом, иммобилизованным на твердом субстрате, таком как матрикс или гель. Таким образом, представляющая интерес биомолекула связывается с субстратом (как правило, находящимся в колонке), в то время как загрязнители и другие нежелательные компоненты питающего потока протекают через систему. Затем биомолекулу элюируют из связывающего фрагмента и/или колонки и собирают. Таким образом, колонки для аффинной хроматографии обладают очень большой специфичностью и позволяют получать продукты с очень высокой чистотой. При очистке антител, например, из сред для культивирования клеток, в качестве связывающего фрагмента для аффинной хроматографии наиболее часто применяют белок А. Аффинная хроматография на белке А характеризуется очень большой избирательностью в отношении антител и может обеспечивать чистоту продукта, получаемого из вводимого образца, такого как кондиционированные среды для клеточных культур, составляющую более 95%.

Хотя аффинная хроматография представляет собой эффективную стадию захвата и очистки, применение биоаффинных фрагментов (в данной области их называют также биоаффинными лигандами), которые связываются с требуемыми биомолекулами, также ассоциировано с высокими затратами на обработку. Например, стоимость биоаффинных лигандов (которые, как правило, сами представляют собой биомолекулы), например, белка А, в 7-15 раз выше, чем других хроматографических материалов (см. Gottschalk, Process Scale Purification of Antibodies, изд-во John Wiley & Sons, 1-е изд., 2009, глава 5.3.1). Кроме того, биоаффинные лиганды подлежат выщелачиванию из субстрата и колонки. Это не только приводит к укорачиванию срока службы колонки по сравнению с колонкой, в которой применяют, например, фильтрующие мембраны, выщелаченные лиганды обладают способностью к денатурации и могут индуцировать образование агрегатов представляющих интерес молекул. Кроме того, многие биоаффинные лиганды, такие как белок А, рассматривают/можно рассматривать как токсин, что требует осуществления непрерывного мониторинга потока продукта для выявления его присутствия. Таким образом, применение биоаффинных лигандов связано со значительными расходами, обусловленными не только прямыми затратами, например, на материалы для самой колонки, и более частым графиком замен, но также и косвенными затратами, ассоциированными с обслуживанием, мониторингом и возможными дополнительными операциями с использованием устройств (например, с необходимостью фильтрации осадка/агрегатов и/или повторного осуществления процесса). Таким образом, при любой схеме очистки биоаффинные колонки, их обслуживание и их мониторинг могут быть сопряжены с наиболее значительными затратами и их экономичная интеграция в промышленные операции может оказаться затруднительной.

Принимая во внимание высокие затраты, ассоциированные с применением биоаффинных лигандов, было изучено большое количество альтернатив для дополнения или усовершенствования методов аффинной хроматографии, включая использование синтетических аффинных лигандов и смол смешанного типа (см., Gottschalk 2009, глава 5.3.2). Кроме того, изучали также методы обработки/очистки, позволяющие полностью устранить операции с использованием устройств, функционирующих на основе аффинности. Такие методы включают фильтрацию, ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия, гель-фильтрацию и их комбинации. Например, систематическая оценка трехстадийного хроматографического процесса для очистки антитела без применения хроматографии с использованием белка А описана у Follmann и др., J. Chromatog. 1024, 2004, сс. 79-85.

Из числа процессов биомолекулярной очистки, наиболее интенсивно изученных с целью дополнения или замены процессов на основе аффинности, несколько процессов представляют собой процессы ионообменной хроматографии. В частности, было изучено применение катионообменной хроматографии («СЕХ») для целого ряда схем очистки белков, как в сочетании с операциями с использованием устройств на основе аффинности, так и в качестве их замены (см., например, Arunakumari и др., Adv. Process Chromatog. (приложение BioPharm Int.), 2007, сс. 36-40; Arunakumari и др., BioPharm. Int. Supp. 2 марта 2009 г.; Wang и др., BioPharm. Int. Supp. 2 марта 2008 г.; Gottschalk 2009, глава 5.3.3; Pharmaceutical Process Scale-Up, под ред. Cacciuttolo, изд-во CRC Press, 2-е изд. 2006, глава 5; Morrow, Gen. Eng. Biotech. News 28, 2008; публикация доступна только в режиме онлайн). Несмотря на связанные с ней надежды, ионообменная хроматография не заменила полностью аффинную хроматографию, однако она была адаптирована для того, чтобы она служила в качестве дополнительного процесса очистки в сочетании с аффинной хроматографией при осуществлении обычных промышленных процессов очистки. Однако, в случае хроматографических процессов состав загружаемого материала (например, потока продукта, вводимого в процесс/операцию с использованием устройства/колонку) имеет решающее значение для правильного функционирования колонки. Следовательно, в методах очистки, включающих хроматографические процессы/операции с использованием устройства, важной первой стадией является обработка загружаемого материала перед осуществлением хроматографического процесса. Например, до операции с использованием хроматографического устройства значение рН питающего потока (содержащего представляющую интерес молекулу), как правило, необходимо регулировать до достижения приемлемого значения, забуферивать и обеспечивать проводимость, зависящую от изоэлектрической точки конкретной представляющей интерес молекулы и от параметров конкретной колонки. Таким образом, не только конкретный хроматографический процесс, но также и состав питающего потока определяют, какие модификации необходимо осуществлять для питающего потока. Таким образом, различные варианты питающего потока могут требовать значительной модификации операций с использованием устройства и обработки питающего потока до осуществления процесса ионообменной хроматографии.

Обработку/регулировку параметров питающего потока часто осуществляют с помощью диафильтрации/фильтрации в тангенциальном потоке («TFF»). При осуществлении этой стадии обработки растворитель в питающем потоке постепенно заменяют посредством диафильтрации в процессе осуществления TFF на буфер, пригодный для конкретной хроматографической операции. Например, в случае очистки антител с помощью СЕХ в большинстве процессов регулируют питающий поток перед осуществлением СЕХ до достижения значения рН примерно от 5 до 7 при низкой проводимости, поскольку многие антитела характеризуются изоэлектрическими точками, превышающими 7. Однако, когда питающий поток представляет собой кондиционированные содержащие клетки среды (такие, например, как супернатант или гомогенизированная клеточная культура), то доведение значения рН питающего потока до уровня ниже нейтрального посредством обмена буфера часто приводит к осаждению загрязнителей, таких как ДНК клеток-хозяев («HCDNA») и белки клеток-хозяев («НСР») (см., например, у Gottschalk 2009, глава 5.3.3; Wang и др., 2008).

Явление осаждения имеет важное экономическое значение не только потому, что требует добавления по меньшей мере одной дополнительной операции с использованием устройства (для удаления осадков), но также и потому, что процессы осаждения могут оказывать негативное влияние на саму операцию с использованием устройства для обмена буфера (например, в процессе операции колонка для диафильтрации/TFF может закупориваться осадком). Таким образом, обработка белков из рекомбинантных клеточных культур с помощью хроматографических процессов, как правило, требует применения дорогостоящих операций с использованием устройств, таких как отстойники и/или фильтрующие устройства (см., например, Wang и др., 2009).

Таким образом, несмотря на надежды, связанные с ионообменной хроматографией, в промышленных условиях она оказалась недостаточно эффективной для того, чтобы полностью заменить операции с использованием устройств на основе аффинности, и в большинстве процессов, применяемых для коммерческого производства биофармацевтических средств, сохраняют стадию аффинной очистки, проводимую в сочетании с операцией с использованием ионообменных устройств. Однако, как более подробно отмечено выше, несколько таких операций с использованием устройств редко оказываются совместимыми, они часто требуют значительной модификации параметров буфера, что увеличивает стоимость и время при реализации схем очистки. Таким образом, существует необходимость в дальнейшей разработке процессов очистки для получаемых методами рекомбинации биомолекул, например, белков, которые позволили бы более эффективно реализовать в большей степени возможности очистки с помощью не основанных на аффинности процессов. В частности, существует необходимость в разработке стадий обработки, совместимых с широким разнообразием питающих потоков; позволяющих значительно снижать уровни загрязнителей, прежде всего загрязнителей, представляющих собой белки клеток-хозяев (НСР) и/или ДНК клеток-хозяев (HCDNA); и которые были бы совместимыми с другими операциями с использованием устройств, такими как аффинная хроматография, и с последующими процессами, такими как ионообменная хроматография.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способам отделения представляющей интерес молекулы от содержащего молекулу раствора клеточной культуры с помощью двухстадийной ультрафильтрации в тангенциальном потоке («TFF»). Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF существенно снижают уровни загрязнителей и/или примесей в питающем потоке продукта, и они наиболее пригодны в качестве предшествующих процессов, осуществляемых перед стандартными операциями с использованием устройств для очистки и выделения, которые можно применять для доведения потока продукта до конечного состава и/или чистоты, например, с помощью ионообменной хроматографии. Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF наиболее пригодны в качестве дополнения к стандартным методам очистки, таким как операции с использованием хроматографических устройств на основе аффинности и ионообменной хроматографии, и, таким образом, они должны быть совместимы с ними. Однако под объем изобретения подпадают также способы, в которых описанные способы двухстадийной TFF заменяют операции с использованием хроматографических устройств на основе аффинности при получении и/или очистке представляющей интерес молекулы. Способы, предлагаемые в изобретении, можно применять при обработке неочищенного питающего потока (т.е. раствора клеточной культуры) из любых систем клеточных культур, включая системы ферментации или другие системы с использованием клеточной культуры, для существенного снижения уровней примесей или загрязнителей, таких как белки клеток-хозяев (НСР) и ДНК клеток-хозяев (HCDNA), где выходные потоки можно затем подвергать обработке с помощью стандартных методов очистки, либо с помощью операций с использованием хроматографических устройств на основе аффинности, либо без них. Существенное снижение уровней загрязнителей и/или примесей в питающем потоке (т.е. супернатанте клеточной культуры), обеспечиваемое предложенными способами двухстадийной TFF, устраняет необходимость в осуществлении стандартных операций с использованием устройств для очистки, таких, например, как регулируемое значением рН осаждение примесей и/или фильтрация осадка (что, как правило, требуется перед осуществлением ионообменной хроматографии вследствие необходимости изменений состава буфера), и/или может повышать эффективность дорогостоящих операций с использованием устройств на основе аффинности или даже исключать их. Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF наиболее пригодны для применения в качестве предшествующих процессов перед операциями с использованием устройств, которые наиболее чувствительны к нагрузкам загрязнителями, такими как операции с использованием хроматографических устройств. Например, в случае применения последующих операций с использованием хроматографических устройств, например, колонок, существенное снижение нагрузки загрязнителями, обеспечиваемое с помощью способов, предлагаемых в изобретении, может приводить к улучшению хроматографического разделения, повышению динамической связывающей способности, эксплуатационного срока службы и/или уменьшению требуемого размера колонок, все это значительно снижает как прямые, так и косвенные затраты, ассоциированные с получением, обработкой и очисткой представляющей интерес молекулы.

В частности, способы, предлагаемые в настоящем изобретении, обеспечивают выделение представляющей интерес молекулы от содержащего молекулу раствора клеточной культуры с использованием двухстадийной TFF, указанные способы существенно снижают уровни загрязнителей и/или примесей. При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что процесс двухстадийной TFF, объединяющий по меньшей мере две операции с использованием устройства для TFF (одну, заключающуюся в обработке представляющей интерес молекулы в ретентате, и одну, заключающуюся в обработке представляющей интерес молекулы в пермеате), позволяет снижать уровни загрязнителей и/или примесей в потоке продукта (т.е. в растворе, содержащем представляющую интерес молекулу, при его обработке) до такой степени, которая позволяет минимизировать или не осуществлять последующее удаление загрязнителей с использованием стандартной обработки (такой как осаждение (прежде всего осуществляемое посредством регулирования значения рН), фильтрация осадка и разделение на основе аффинности). Таким образом, способы, предлагаемые в настоящем изобретении, наиболее пригодны для применения в процессах, включающих использование последующих хроматографических процессов, которые могут быть особенно чувствительными к составу потока продукта. В этом случае способы двухстадийной TFF, предлагаемые в настоящем изобретении, позволяют осуществлять не только существенное снижение уровней загрязнителей и/или примесей в потоке продукта, но их можно одновременно использовать также и для регулирования параметров потока продукта, например, значения рН и/или проводимости, таким образом, они являются совместимыми с последующими операциями с использованием устройств. Таким образом, способы, предлагаемые в изобретении, являются очень привлекательными в случае осуществления последующих хроматографических процессов, таких как катионообменная хроматография («СЕХ») и анионообменная хроматография («АЕХ»).

Способы двухстадийной TFF наиболее пригодны для обработки содержащих клеточные культуры растворов перед осуществлением последующих процессов, например, хроматографии, очистки и выделения, которые применяют для доведения потока продукта до конечного состава и/или конечной чистоты. Представленный в настоящем описании способ TFF можно успешно осуществлять при значении рН, которое соответствует или примерно равно значению рН типичного неочищенного потока продукта/содержащего клеточную культуру раствора, полученного в результате биологического процесса (например, кондиционированных сред для клеточных культур, лизатов клеточных культур, кондиционированных ферментационных сред и т.д.). Как правило, представленные в настоящем описании способы TFF осуществляют при значении рН, составляющем 7,5±1,0 или 7,5±0,5. Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF можно объединять с последующими стандартными процессами очистки, известными в данной области, такими как аффинная очистка, или, в частности, с последующими процессами очистки, которые не основаны на аффинных методах выделения, например, с хроматографическими процессами. В частности, представленные в настоящем описании способы позволяют снижать уровни загрязнителей, в результате чего после этого можно модифицировать значение рН потока продукта, например, понижать его по меньшей мере примерно до 5, без осаждения любых оставшихся загрязнителей, таких как белки клеток-хозяев (НСР) и/или ДНК клеток-хозяев (HCDNA), которые могут присутствовать в потоке продукта.

Способы, предлагаемые в изобретении, можно применять для любых видов молекул, и они представлены в настоящем описании в предпочтительном варианте осуществления изобретения на примере выделения белка из содержащего белок раствора. Представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF представляют собой робастные и масштабируемые процессы, применимые в целом для белков в широком диапазоне размеров и молекулярных масс (например, полипептидов, пептидов, иммуноглобулинов, антител, ферментов). Представленные в настоящем описании способы в целом позволяют осуществлять отделение представляющего интерес белка от раствора на основе его размера. Иными словами, способы, предлагаемые в изобретении, не основаны на каком-либо специфическом аффинном или основанном на аффинности процессе очистки и, следовательно, они позволяют осуществлять экономичную и ускоренную обработку различных белков в разнообразных питающих потоках растворов клеточных культур. Таким образом, способы, предлагаемые в изобретении, могут приводить к экономии непосредственных затрат, ассоциированных с обработкой, получением и/или очисткой белков, например, экономии затрат, ассоциированных с анализом питающего потока или предварительной обработкой питающего потока для обеспечения совместимости с существующими системами.

Способы, предлагаемые в изобретении, наиболее пригодны для отделения представляющего интерес белка от питающего потока, представляющего собой раствор клеточной культуры. В контексте настоящего описания понятие раствор клеточной культуры и аналогичные понятия относятся к любому раствору, присутствующему в биологическом процессе или системе, который, как ожидается, содержит представляющий интерес белок. Следовательно, понятие «раствор клеточной культуры» может обозначать все содержимое резервуара, в котором осуществляли ферментацию клеточной культуры, т.е. получали гетерологичный или эндогенный белок. Раствор клеточной культуры, предлагаемый в изобретении, может содержать не только представляющий интерес белок, но также и другие белки или фрагменты белков (например, эндогенно или гетерологично продуцируемых клеточной культурой или присутствующих в среде по иной причине (например, в результате внесения)); клетки клеточной культуры; фрагменты клеток; и/или другие компоненты, внесенные вместе с питательной средой для поддержания клеточного роста и производства белка, или компоненты, продуцируемые клетками-хозяевами в процессе культивирования. Таким образом, растворы клеточной культуры, предлагаемые в изобретении, включают (но не ограничиваясь только ими) кондиционированные супернатанты клеточной культуры; осветленные кондиционированные супернатанты клеточной культуры (например, кондиционированные супернатанты клеточной культуры, из которых с помощью известных в данной области методов удалены представляющие собой частицы ингредиенты); и осветленные гомогенизированные/лизированные клеточные культуры. Во всех случаях подразумевается, что раствор клеточной культуры должен содержать представляющую интерес молекулу; это означает, что он должен представлять собой кондиционированный раствор клеточной культуры, например, кондиционированный супернатант клеточной культуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения питающий поток для двухстадийной TFF представляет собой супернатант клеточной культуры, полученной в результате реакции ферментации.

Как известно в данной области и представлено в настоящем описании, раствор клеточной культуры, как правило, в качестве первой стадии при любой схеме обработки осветляют или стерилизуют путем фильтрации через фильтр с размером пор от 0,1 до 0,45 мкм, предпочтительно через фильтр с размером пор 0,2 мкм или 0,22 мкм. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения представленные в настоящем описании способы двухстадийной TFF предусматривают фильтрацию раствора клеточной культуры через пригодный фильтр для стерилизации, например, имеющий размер пор от 0,1 мкм до 0,45 мкм, предпочтительно размер пор, составляющий 0,2 мкм или 0,22 мкм, до осуществления предлагаемого в изобретении способа двухстадийной TFF (т.е. до осуществления указанных по меньшей мере двух операций с использованием устройства для TFF). Применение фильтров других размеров, выходящих за указанные в настоящем описании рамки, вне зависимости от того, являются ли они предпочтительными или нет, для стерилизации раствора клеточной культуры, как это известно или подразумевается в данной области, также подпадает под объем настоящего изобретения. Под объем настоящего изобретения не подпадают молоко, фракционированный раствор, полученный из молока и/или молочный продукт, такой как выделенный из сыворотки белок. Таким образом, во всех вариантах осуществления изобретения, представленных в настоящем описании, питающий поток и/или поток продукта, содержащий представляющие интерес молекулу, например, белок, не представляет собой молоко, фракционированный раствор, полученный из молока и/или молочный продукт, такой как выделенный из сыворотки белок.

В настоящем изобретении предложен способ отделения представляющего интерес белка от раствора клеточной культуры, содержащего указанный белок, с помощью двухстадийной TFF, в котором двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF, и в котором

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащий указанный белок, таким образом, чтобы указанный белок собирался в ретентате, полученном после первой операции с использованием устройства для TFF; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащий указанный белок, таким образом, чтобы указанный белок собирался в пермеате, полученном после второй операции с использованием устройства для TFF.

В контексте настоящего описания операции с использованием устройства для TFF, предлагаемые в изобретении, включают применение ультрафильтрационных мембран. Таким образом, следует понимать, что в настоящем описании сокращение «TFF», когда оно используется в контексте изобретения, обозначает ультрафильтрацию в тангенциальном потоке в том смысле, в каком указанную операцию с использованием устройства обычно понимают в данной области. Границы отсечки мембран при осуществлении по меньшей мере двух операций с использованием устройства для TFF (т.е. первой и второй операций с использованием устройства для TFF) выбирают таким образом, чтобы представляющая интерес молекула, например, белок, (I) не проходила через мембрану при осуществлении первой операции с использованием устройства для TFF (т.е. собиралась в ретентате, полученном после первой операции с использованием устройства для TFF), и (II) проходила через мембрану при осуществлении второй операции с использованием устройства для TFF (т.е. собиралась в пермеате, полученном после второй операции с использованием устройства для TFF). Следовательно, изобретение можно охарактеризовать также как способ отделения представляющего интерес белка от раствора, содержащего белок, с помощью двухстадийной TFF, в котором двухстадийная TFF заключается в том, что осуществляют первую операцию с использованием устройства для TFF и вторую операцию с использованием устройства для TFF, и в котором

(I) при указанной первой операции с использованием устройства для TFF фильтруют первый поток продукта, содержащий белок, с использованием первой ультрафильтрационной мембраны, имеющей такую границу отсечки, чтобы представляющий интерес белок собирался в ретентате, полученном после первой операции с использованием устройства для TFF; и

(II) при указанной второй операции с использованием устройства для TFF фильтруют второй поток продукта, содержащий белок, через вторую ультрафильтрационную мембрану, имеющую такую границу отсечки, чтобы указанный белок собирался в пермеате, полученном после второй операции с использованием устройства для TFF.

Как указано в настоящем описании, ультрафильтрационную мембрану для первой операции с использованием устройства для TFF выбирают таким образом, чтобы представляющая интерес молекула не проходила через мембрану при осуществлении первой TFF-операции (т.е. так, чтобы белок собирался в ретентате, полученном после первой операции с использованием устройства для TFF), и ультрафильтрационную мембрану для второй операции с использованием устройства для TFF выбирают таким образом, чтобы представляющая интерес молекула проходила через мембрану при осуществлении второй TFF-операции (т.е. так, чтобы белок собирался в пермеате, полученном после второй операции с использованием устройства для TFF). Как правило, фильтрационные мембраны классифицируют по размеру пор или границам отсечки, которые определяют характеристики мембраны на основе максимального размера пор мембраны и/или максимальной молекулярной массы (в кДа) молекулы, свободно проникающей через нее; таким образом, молекулы с размером, превышающим границу отсечки, определяемую максимальным размером пор, и/или с массой, превышающей максимальную молекулярную массу, не должны проходить через мембрану. Однако, как известно в данной области, поскольку фильтрационные характеристики мембраны могут зависеть не только от точного размера молекулы, но также и от других факторов, таких, например, как заряд молекулы, то настоящее описание не накладывает ограничения на критерии, согласно которым можно выбирать мембрану, при условии, что представляющая интерес молекула, например, белок, не проходит через первую мембрану при осуществлении первой операции с использованием устройства для TFF и проходит через вторую мембрану при осуществлении второй операции с использованием устройства для TFF. Таким образом, границы отсечки мембран, которые применяют согласно способам двухстадийной TFF, представленным в настоящем описании, можно выбирать на основе характеристик мембраны, а не только на основе заявленных границ отсечки или размера пор (например, согласно спецификациям производителя). Способы определения характеристик мембраны и, более конкретно, определения проницаемости мембраны для представляющей интерес молекулы, например, белка, хорошо известны и широко применяются в данной области.

В контексте операций с использованием устройства для TFF, предлагаемых в изобретении, например, первой операции с использованием устройства для TFF, как она описана в контексте настоящего изобретения, выражения «не проходит через мембрану» и «находится в ретентате после операции с использованием устройства для TFF» являются эквивалентными, и они указывают на то, что мембрана, применяемая для операции с использованием устройства для TFF, практически непроницаема для представляющей интерес молекулы, например, белка. Кроме того, поскольку, как известно в данной области, характеристики мембраны могут варьироваться в зависимости от биологических растворов и молекул (например, белков), то следует иметь в виду, что фразы «не проходит через мембрану», «находится в ретентате после операции с использованием устройства для TFF» и/или «практически непроницаема», представляющие собой понятия и фразы, используемые в настоящем описании, не следует интерпретировать как выражения в их буквальном смысле. Скорее, как это следует из контекста настоящего описания и как это понимают в данной области, эти фразы используют с учетом того, что для первой фильтрационной мембраны может иметь место «прорыв» (т.е. представляющая интерес молекула в минимальном количестве может проникать через мембрану), но при этом по меньшей мере 90% от количества представляющей интерес молекулы, подвергнутой первой операции с использованием устройства для TFF, собирается или может собираться в ретентате.

Аналогично этому, в контексте операций с использованием устройства для TFF, предлагаемых в изобретении, например, второй операции с использованием устройства для TFF, как она описана в контексте настоящего изобретения, выражения «проходит через мембрану» и «находится в пермеате после операции с использованием устройства для TFF» являются эквивалентными, и они указывают на то, что мембрана, применяемая для операции с использованием устройства для TFF, практически полностью проницаема для представляющей интерес молекулы, например, белка. Кроме того, поскольку, как известно в данной области, характеристики мембраны могут варьироваться в зависимости от биологических растворов и молекул (например, белков), то следует иметь в виду, что фразы «проходит через мембрану», «находится в пермеате после операции с использованием устройства для TFF» и/или «практически полностью проницаема», представляющие собой понятия и фразы, используемые в настоящем описании, не следует интерпретировать как выражения в их буквальном смысле. Скорее, как это следует из контекста настоящего описания и как это понимают в данной области, эти фразы используют с учетом того, что фильтрационная мембрана может не являться полностью проницаемой для 100% представляющих интерес молекул, попадающих на/в фильтр и что мембрана может оказаться непроницаемой для определенного незначительного процента попавших на нее молекул, представляющих интерес. Таким образом, в контексте настоящего описания эти фразы указывают на то, что по меньшей мере 90% от количества представляющей интерес молекулы, подвергнутой второй операции с использованием устройства для TFF, собирается или может собираться в пермеате.

Таким образом, способы двухстадийной TFF, представленные в настоящем описании, как правило, включают применение по меньшей мере двух ультрафильтрационных мембран, каждая из которых обладает различными границами отсечки, размером пор и/или характеристиками проницаемости. Ультрафильтрационную мембрану для первой операции с использованием устройства для TFF выбирают таким образом, чтобы представляющая интерес молекула не проходила через мембрану при осуществлении операции и могла собираться в ретентате, полученном в результате операции. Как правило, этого достигают путем выбора первой ультрафильтрационной мембраны (т.е. мембраны для первой операции с использованием устройства для TFF), имеющей границу отсечки, которая меньше молекулярной массы представляющей интерес молекулы. Однако, как известно в данной области, характеристики мембраны могут зависеть не только от размера молекулы, но и от других факторов; таким образом, мембраны с определенными границами отсечки могут, тем не менее, очень эффективно бл