Биомаркеры для прогнозирования чувствительности к противоопухолевой терапии

Биомаркеры для прогнозирования чувствительности к противоопухолевой терапии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственную заявку(и)

По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки США 61/471036, поданной 01 апреля 2011 года, которая включена в настоящую описание посредством ссылки.

Уровень техники

Рак может возникать, если у клеток есть мутации, которые, в конечном счете, придают таким клеткам преимущество в росте. Соматические мутации включают, например, замены, делеции, вставки, амплификации и перестановки нуклеотидных оснований. Идентификация соматических мутаций, которые присутствуют при раке, предоставляет ценную информацию относительно развития рака. Такая информация также полезна для идентификации диагностических маркеров и терапевтических мишеней при раке (см., например, Bamford et al. (2004) British Journal of Cancer 91:355-358). Идентификация соматических мутаций, связанных с раком, оказалась ценной в клинических условиях, например, при выявлении отличий популяций пациентов, которые чувствительны к специфической терапии (см., например, Lynch et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350:2129-2139; O'Hare (2004) Blood 104:2532-2539). Таким образом, сохраняется потребность в идентификации соматических мутаций, которые присутствуют при раке.

Эмбриональные вариации, или полиморфизм, являются наследственными вариациями, которые присутствуют в геноме организма. Полиморфизмы включают полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP), короткие тандемные повторы (STR) и однонуклеотидный полиморфизм (SNP). Эмбриональные вариации также могут быть связаны с восприимчивостью к некоторым заболеваниям, включая рак (см., например, Vierimaa et al. (2006) Science 312:1228-1230; Landi et al. (2006) Science 313:521-522; Zhu et al. (2004) Cancer Research 64:2251-2257). Таким образом, сохраняется потребность в идентификации полиморфизмов, связанных с раком.

Сущность некоторых вариантов осуществления изобретения

Изобретения, описанные в настоящей описании, удовлетворяют описанным выше потребностям и обеспечивают другие преимущества.

Авторы обнаружили, что биомаркеры могут прогнозировать эффективность ингибиторов AKT при лечении гиперпролиферативных нарушений, таких как рак.

Авторы обнаружили, что некоторые мутации в AKT могут привести к нарушению взаимодействий между PH-доменом AKT и киназным доменом. Нарушение между указанными доменами, вызванное мутацией(ями), по-видимому, приводит к конститутивному фосфорилированию AKT и к конститутивной сигнализации AKT. Такие эффекты также допускают перерождение клеток. Данные мутации придают устойчивость к PI3K и аллостерическим ингибиторам Akt. Соответственно, присутствие таких мутаций указывает на то, что эффективная дозировка PI3K и аллостерических ингибиторов Akt будет выше, а также указывает, что необходимо использовать другие ингибиторы помимо PI3K и/или аллостерических ингибиторов Akt, такие как АТФ-конкурентные ингибиторы Akt. Применение указанного биомаркера, одного или в комбинации с другими биомаркерами, описанными в настоящем описании, может быть предназначено для прогнозирования чувствительности роста опухолевых клеток к ингибитору AKT, который вводят отдельно или в комбинации с другим терапевтическим соединением, таким как 5-FU, платиносодержащее средство (карбоплатин, цисплатин, оксалиплатин и т.д.) иринотекан, доцетаксел, доксорубицин, гемцитабин, SN-38, капецитабин, темозоломид, эрлотиниб, PD-0325901, паклитаксел, бевацизумаб, пертузумаб, тамоксифен, рапамицин, лапатиниб, PLX-4032, MDV3100, абиратерон и GDC-0973, и другие ингибиторы MEK.

Краткое описание фигур

На фиг.1 показаны AKT и взаимодействия PH и киназного домена (1A и 1B), а также показаны положения взаимодействий между указанными доменами (1C).

На фиг.2 представлены результаты, показывающие, что синтетические мутации по сайтам, вероятно, нарушают взаимодействия PH домена с киназным доменом и приводят к конститутивному фосфорилированию Akt.

На фиг.3 показаны соматические мутации.

На фиг.4 представлены результаты, показывающие, что соматические мутации, которые приводят к конститутивному фосфорилированию Akt, приводят к конститутивной сигнализации Akt.

На фиг.5 представлены результаты, показывающие, что мутанты Akt1 могут вызывать перерождение клеток.

На фиг.6 представлены результаты, показывающие, что мутанты Akt1 придают устойчивость к ингибиторам PI3K и аллостерическим ингибиторам AKT.

На фиг.7 показаны изменения в pPRAS40 T246 в опухолях пациентов, получавших GDC-0068.

На фиг.8 показаны опухоли с активированным путем PI3K/AKT.

На фиг.9 представлены результаты, показывающие, что профиль высокой активности AKT предсказывает чувствительность к GDC-0068.

На фиг.10 представлены результаты, демонстрирующие сильную корреляцию с потерей PTEN и чувствительностью к GDC-0068 в линиях клеток предстательной железы и яичников. Результаты соответствуют нормализованному дозозависимому эффекту одного соединения в GDC-0068.

На фиг.11 представлены результаты, демонстрирующие, что потеря PTEN и мутации PIK3CA сильно коррелируют с чувствительностью к монотерапии GDC-0068 in vitro.

На фиг.12A и 12B представлены результаты активности одного GDC-0068 на ксенотрансплантатных моделях (12A) и данные in vitro скрининга клеточных линий (12B), показывающие, что наиболее высокий процент ингибирования роста опухоли также доказывает активацию пути либо через потерю PTEN, либо в результате мутации PI3K. На моделях с активацией пути AKT (и без активации пути MEK) наблюдается высокая эффективность.

На фиг.13 представлены результаты, показывающие негативную корреляцию между чувствительностью к GDC-0068 и ингибитором MEK по отдельности в различных клеточных линиях.

На фиг.14 представлены результаты, демонстрирующие сильную синергию в клеточных линиях с активацией пути AKT (потеря PTEN, мутации PI3K). Анализ BLISS указывает на широкую синергию для GDC-0068 в комбинации с ингибитором MEK (GDC-0973).

На фиг.15 представлены результаты, согласно которым комбинированные эффекты GDC-0068 с цисплатином+5FU связаны с активацией пути AKT. Комбинированный скрининг с 5FU/цисплатином (FOLFOX) демонстрирует доказательство аддитивных эффектов. Аддитивные эффекты связаны с активацией путей: PTEN, pAKT, мутация PI3K.

На фиг.16 показаны мутации участка контакта PH-киназного домена, приводящие к активации AKT. (A) IL-3-независимая пролиферация клеток BaF3, стабильно экспрессирующих пустой вектор (EV), дикий тип (WT), миристоилированный (Myr) или E17K AKT1, один или в комбинации с MEK1 N3. (B) Представление в форме "открытая книга" PH и KD AKT1 в комплексе с аллостерическим ингибитором (код доступа в PDB 3O96). (C) Схематическое изображение скрининга, использованного для оценки эффекта мутаций в интерфейсе PH-KD AKT1. (D) Мутации в интерфейсе PH-KD способствуют пролиферации IL-3-независимых клеток BaF3. (E) Иммуноблот-анализ клеток NIH3T3, стабильно экспрессирующих пустой вектор и указанные конструкции AKT1.

На фиг.17 показаны соматические мутации AKT при раке у человека. Соматические мутации представителей семейства AKT. Горизонтальные черные полосы указывают остатки, консервативные в AKT 1, 2 и 3.

Подробное описание

Недавние структурные исследования указывают, что ингибирующие междоменные взаимодействия играют важную роль в регуляции активации AKT. При использовании мутационного скрининга показано, что активация AKT может являться результатом мутаций по остаткам, вовлеченным в контакты PH-киназного домена. Кроме того, сообщается об идентификации новых мутаций в раковых образованиях человека, из которых некоторые включают остатки в PH-KD интерфейсе.

В дополнение к ранее идентифицированной мутации E17K, мутант L52R PH-домена AKT1 и мутант D323H киназного домена, идентифицированные в клинических образцах, опосредуют клеточное перерождение и являются онкогенными in vivo. Исследование структуры полноразмерной AKT1 показывает, что E17, L52 и D323 расположены в интерфейсе PH-KD, и замены в указанных положениях теоретически могут нарушить связывание PH-KD. В соответствии с этим, L52R и D323H ослабляют связывание PH-KD в 2-гибридных анализах. Ранее механизм активации E17K связывали с измененной липид-связывающей специфичностью. Эти результаты указывают, что нарушение междоменных взаимодействий представляет собой дополнительный механизм, лежащий в основе активации E17K. В совокупности указанные наблюдения дают возможность предположить, что онкогенность мутаций в интерфейсе PH-KD AKT1, идентифицированных в настоящем изобретении, обусловлена дестабилизацией междоменных контактов.

Ингибиторы, направленные против участников пути PI3K-AKT, включая AKT, в настоящее время находятся на различных этапах разработки. Предыдущие исследования показали, что аллостерические ингибиторы AKT требуют наличия интактного PH-KD интерфейса, поскольку такие ингибиторы предпочтительно связывают закрытую конформацию "PH-in". В соответствии с этим, мутации в AKT, которые способствуют появлению открытой конформации ("PH-out"), демонстрируют пониженную чувствительность к аллостерическим ингибиторам AKT, хотя они сохраняют чувствительность к АТФ-конкурентным ингибиторам. Это указывает на то, что мутационный статус AKT имеет важное значение при выборе ингибитора в клинике. Мутации AKT, которые хотя и могут послужить причиной возникновения первичных опухолей, также могут возникать в опухолях в ответ на агенты, которые взаимодействуют с вышестоящими элементами пути AKT.

В некоторых вариантах осуществления присутствие мутации B-Raf или K-Ras является негативным предиктором (то есть, служит противопоказанием), и такие пациенты должны быть исключены из группы терапии, получающей такие ингибиторы AKT, как GDC-0068.

GDC-0068 и подобные АТФ-конкурентные ингибиторы предпочтительно воздействуют на активную Akt и запертую Akt в гиперфосфорилированном, но неактивном состоянии, блокируя дефосфорилирование. Увеличение pAkt может использоваться в качестве фармакодинамического биомаркера ("PD-биомаркера") действия GDC-0068 и подобных АТФ-конкурентных ингибиторов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения pGSK-3β или PRAS40 могут применяться в качестве фармакодинамических биомаркеров для таких ингибиторов AKT, как GDC-0068. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления нужная дозировка такого соединения, как GDC-0068, может быть определена и скорректирована с учетом ингибирования пути AKT с применением PD биомаркеров, например, pGSK-3β или PRAS40 (см. фиг.7).

Также полагают, что GDC-0068 и подобные АТФ-конкурентные ингибиторы более активны против гиперактивированной Akt.

Селективный таргетинг активной Akt может действовать в сочетании с добавлением онкогена, увеличивая терапевтический индекс GDC-0068 и подобных АТФ-конкурентных ингибиторов в отношении опухолей с высокими стационарными уровнями активной Akt, включая опухоли, вызванные мутациями Akt, потерей PTEN (гемизиготной или гомозиготной), потерей функции INPP4B, потерей функции PHLPP, потерей функции PP2A, мутацией PI3K и Her2 и/или амплификацией Her3.

Эффективность GDC-0068 прогнозируется в опухолях, которые являются PTEN нулевыми или имеют мутации PI3k, например, при раке предстательной железы, молочной железы и яичников.

Потеря PTEN является биомаркером, который предсказывает синергию с ингибиторами MEK, например, при раке поджелудочной железы.

Таким образом, активность GDC-0068 связана, например, выборочно связана, с активацией пути AKT. Доказательство подобной зависимости было продемонстрировано в клеточных линиях и ксенотрансплантатных исследованиях.

Потеря PTEN, мутации киназного домена PI3K и высокие уровни pAKT являются важными маркерами, которые прогнозируют активность соединения, например, в виде отдельно применяемого средства; с аддитивными эффектами с комбинациями химиотерапевтических соединений и с синергическими эффектами, например, с ингибиторами MEK. Примечательно, что синергия с ингибитором MEK наблюдается с активацией пути MEK. Напротив, активация пути MEK (например, KRAS/BRAF) является маркером устойчивости к воздействию отдельного средства (например, GDC-0068). Другие потенциальные прогностические факторы активности соединения, например, активности GDC-0068, включают РТК-регулируемую активацию пути (HER2 при раке молочной железы, HER2 и Met при раке желудка), мутации E17K AKT1, амплификации AKT2, овер-экспрессию AKT3 и амплификации PI3K.

Таблица AТекущие оценки распространенности биомаркеров рака желудка, предстательной железы и поджелудочной железы, основанные на литературных данных
	Рак желудка	Рак предстательной железы	Рак поджелудочной железы
Потеря PTEN	40%	75-100%	20-75%
Мутация PI3K	8%	2%
Амплификация PI3K	36%
Амплификация AKT	20%		20%
Мутация KRAS			90%

В целях понимания настоящего описания использованы следующие определения, и каждый раз, в соответствующих случаях, термины, используемые в единственном числе, будут также включать множественное число, и наоборот. В случае если какое-либо определение, представленное ниже, противоречит какому-либо документу, включенному в настоящее описание посредством ссылки, определение, представленное ниже, должно иметь преимущественную силу.

Термины "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота", используемые в настоящем описании попеременно, относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями и/или их аналогами, или любым субстратом, который может быть включен в полимер ДНК- или РНК-полимеразой. Полинуклеотид может включать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. В случае присутствия, модификация структуры нуклеотида может быть введена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, посредством конъюгирования с меткой. Другие типы модификаций включают, например, "кэпы", замену одного или более природных нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), модификации, содержащие боковые группы, например, такие как белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), модификации интеркаляторами (например, акридином, псораленом и т.д.), модификации, содержащие хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), модификации, содержащие алкилирующие соединения, модификации модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих на сахарах, может быть заменена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена стандартными защитными группами или активирована для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами или может быть конъюгирована с твердыми подложками. 5'- и 3'-концевой ОН может быть фосфорилирован или замещен аминами или молекулами органических кэппирующих групп длиной от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксилы также можно дериватизировать стандартными защитными группами. Полинуклеотиды также могут содержать формы аналогов сахаров, рибозы или дезоксирибозы, которые широко известны в данной области, включая, например, 2'-О-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидорибозу, карбоциклические аналоги сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пираноза, фураноза, седогептулоза, ациклические аналоги и абазические аналоги нуклеозидов, такие как метилрибозид. Одна или более фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связывающими группами. Такие альтернативные связывающие группы включают, но без ограничения, варианты осуществления, где фосфат заменен Р(О)S ("тиоатом"), P(S)S ("дитиоатом"), (O)NR 2 ("амидатом"), P(O)R, P(O)OR', СО или СН 2 ("формацеталем"), где каждый из R или R' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С); необязательно, содержащий простую эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Нет необходимости, чтобы все связи в полинуклеотиде были идентичными. Приведенное выше описание относится ко всем полинуклеотидам, перечисленным в настоящем описании, включая РНК и ДНК.

"Олигонуклеотид", как используется в настоящем описании, относится к коротким, одноцепочечным полинуклеотидам, которые имеют длину по меньшей мере приблизительно семь нуклеотидов и менее чем приблизительно 250 нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут быть синтетическими. Термины "олигонуклеотид" и "полинуклеотид" не являются взаимоисключающими. Описание, представленное выше для полинуклеотидов, в равной мере и полностью применимо к олигонуклеотидам.

Термин "праймер" относится к одноцепочечному полинуклеотиду, который способен к гибридизации с нуклеиновой кислотой и обеспечивает полимеризацию комплементарной нуклеиновой кислоты, обычно предоставляя свободную группу 3'-OH.

Термин "нуклеотидная вариация" относится к изменению в нуклеотидной последовательности (например, вставке, делеции, инверсии или замене одного или более нуклеотидов, такой как однонуклеотидный полиморфизм (SNP)) по сравнению с референсной последовательностью (например, последовательностью дикого типа). Термин также охватывает соответствующее изменение в комплементарной нуклеотидной последовательности, если не указано иное. Нуклеотидная вариация может быть соматической мутацией или эмбриональным полиморфизмом.

Термин "аминокислотная вариация" относится к изменению в аминокислотной последовательности (например, вставке, замене или делеции одной или более аминокислот, такой как внутренняя делеция или N- или C-концевое усечение) по сравнению с референсной (например, последовательностью дикого типа).

Термин "детектирование" включает любые способы детектирования, включая прямое и опосредованное детектирование.

Термин "диагностика" используется в настоящем описании для обозначения идентификации или классификации молекулярного или патологического состояния, заболевания или состояния. Например, "диагностика" может относиться к идентификации конкретного типа рака, например, рака легкого. "Диагностика" также может относиться к классификации конкретного типа рака, например, по гистологии (например, немелкоклеточной карциномы легкого), по молекулярным особенностям (например, рак легкого, характеризуемый нуклеотидной и/или аминокислотной вариацией(ями) в конкретном гене или белке) или по тому и другому.

Термин "прогноз" используется в настоящем описании для обозначения прогнозирования вероятности смерти, связанной с раком, или прогрессии рака, включая, например, рецидив, распространение метастазов и устойчивость к лекарственному средству неопластического заболевания, такого как рак.

Термин "прогнозирование" (а такие вариации, как предсказание), используется в настоящем описании для обозначения вероятности, с которой пациент будет иметь благоприятную или неблагоприятную реакцию на воздействие лекарственного средства или набора лекарственных средств. В одном варианте осуществления прогнозирование относится к степени таких реакций. В другом варианте осуществления прогнозирование относится к тому, переживет ли и/или к вероятности того, что пациент переживет последующую терапию, например, лечение конкретным терапевтическим средством и/или хирургическое удаление первичной опухоли, и/или химиотерапию в течение некоторого периода времени, без рецидива рака. Способы прогнозирования по изобретению могут применяться клинически, для принятия решений о лечении при выборе наиболее подходящих методов лечения любого конкретного пациента. Способы прогнозирования настоящего изобретения являются ценным инструментом в прогнозировании, будет ли пациент благоприятно отвечать на схему лечения, такую как данная терапевтическая схема, включающая, например, введение данного терапевтического средства или комбинации, хирургического вмешательства, химиотерапии и т.д., или будет ли вероятным продолжительное выживание пациента после применения терапевтической схемы.

Термины "клеточное пролиферативное нарушение" и "пролиферативное нарушение" относятся к нарушениям, которые связаны с измеряемой степенью патологической пролиферации клеток. В одном варианте осуществления клеточным пролиферативным нарушением является рак.

"Опухоль", как используется в настоящем описании, относится ко всем типам роста и пролиферации неопластических клеток, злокачественных или доброкачественных, а также ко всем предраковым и раковым клеткам и тканям. Термин "рак", "раковый", "клеточное пролиферативное нарушение," "пролиферативное нарушение" и "опухоль" не являются взаимоисключающими, как указано в настоящем описании.

Термины "рак" и "раковый" относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом и пролиферацией клеток. Примеры рака включают, но, не ограничиваясь ими, карциному, лимфому (например, ходжкинскую и неходжкинскую лимфому), бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры раковых опухолей включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, перитонеальный рак, гепатоцеллюлярный рак, почечно-клеточная карцинома, желудочно-кишечный рак, рак желудка, рак пищевода, рак поджелудочной железы, глиому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы (например, гормонорезистентный рак молочной железы), рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак легкого, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, меланому, лейкоз и другие лимфопролиферативные нарушения, а также различные типы злокачественных образований головы и шеи.

Термин "опухоль легкого" относится к любой опухоли легкого, включая, но без ограничений, мелкоклеточную карциному легкого и немелкоклеточную карциному легкого, при этом последняя включает, но без ограничений, аденокарциному, плоскоклеточную карциному и крупноклеточную карциному.

Термины "неоплазия" или "неопластическая клетка" относятся к патологической ткани или клетке, которые пролифирируют быстрее, чем соответствующие нормальные ткани или клетки, и продолжают расти после удаления стимула, который инициировал рост.

"Клетка опухоли легкого" относится к клетке опухоли легкого, in vivo или in vitro, и охватывает клетки, полученные из первичных опухолей легкого или метастатических опухолей легкого, а также клеточные линии, полученные из таких клеток.

Как используется в настоящем описании, "лечение" (и такие вариации, как "лечить") относится к клиническому вмешательству в попытке изменить естественное состояние индивидуума или клетки, подвергаемые лечению, и может быть выполнено для профилактики или во время клинической патологии. Требуемые эффекты лечения включают предотвращение появления или рецидива заболевания, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение тяжести или облегчение состояния болезни и ремиссию или улучшенный прогноз.

"Индивидуум", "субъект" или "пациент" представляет собой позвоночное животное. В некоторых вариантах осуществления позвоночным животным является млекопитающее. Млекопитающие включают, но, не ограничиваясь ими, сельскохозяйственных животных (таких как коровы), спортивных животных, домашних животных (таких как кошки, собаки и лошади), приматов (включая человека и не относящихся к человеку приматов) и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах осуществления млекопитающим является человек и может быть мужского или женского пола.

"Эффективное количество" относится к эффективному количеству, в дозировках и в течение периодов времени, необходимого для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата.

"Терапевтически эффективное количество" вещества/молекулы по изобретению может изменяться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и масса индивидуума, и от способности вещества/молекулы вызывать требуемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество охватывает количество, при котором любые токсические или нежелательные эффекты вещества/молекулы перевешиваются благоприятными терапевтически эффектами. "Профилактически эффективное количество" относится к эффективному количеству, в дозировках и в течение периодов времени, необходимому для достижения требуемого профилактического результата. Как правило, но необязательно, поскольку профилактическая доза используется у субъектов до болезни или на ее более ранней стадии, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.

Термин "длительная" выживаемость используется в настоящем описании для обозначения выживаемости в течение по меньшей мере 1 года, 5 лет, 8 лет или 10 лет после терапевтического воздействия.

Термин "повышенная устойчивость" к конкретному терапевтическому средству или методу лечения, при использовании согласно изобретению, означает уменьшенный ответ на стандартную дозу лекарственного средства или на стандартную схему лечения.

Термин "пониженная чувствительность" к конкретному терапевтическому средству или методу лечения, при использовании согласно изобретению, означает уменьшенный ответ на стандартную дозу средства или на стандартную схему лечения, где уменьшенный ответ можно компенсировать (по меньшей мере частично) увеличением дозы средства или интенсивности лечения.

"Ответ пациента" может быть оценен с использованием любого конечного критерия, показывающего благоприятное воздействие на пациента, включая, но без ограничения, (1) ингибирование до некоторой степени роста опухоли, включая замедление или полное прекращение роста; (2) уменьшение количества опухолевых клеток; (3) уменьшение размера опухоли; (4) ингибирование (например, уменьшение, замедление или полную остановку) инфильтрации опухолевых клеток в смежные периферические органы и/или ткани; (5) ингибирование (например, уменьшение, замедление или полную остановку) метастазирования; (6) усиление противоопухолевого иммунного ответа, который может, но необязательно, приводить к регрессии или отторжению опухоли; (7) облегчение до некоторой степени одного или более симптомов, связанных с опухолью; (8) увеличение продолжительности выживания после лечения; и/или (9) уменьшение смертности в данный момент времени после лечения.

"Антитела" (Ab) и "иммуноглобулины" (Ig) относятся к гликопротеинам, обладающим сходными структурными особенностями. Хотя антитела демонстрируют специфичность связывания в отношении определенного антигена, иммуноглобулины включают как антитела, так и другие подобные антителам молекулы, которые обычно не имеют антигенной специфичности. Полипептиды последнего типа, например, вырабатываются в низких уровнях лимфатической системой и в повышенных уровнях миеломами.

Термины "антитело" и "иммуноглобулин" используются попеременно в самом широком смысле и включают моноклональные антитела (например, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, одновалентные антитела, поливалентные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность), и могут также включать некоторые фрагменты антител (как более подробно описано в настоящем описании). Антитело может быть химерным, человеческим, гуманизированным и/или с созревшей афинностью.

"FOXO3a" относится к белку с боксом forkhead/winged helix класса O, который представляет собой нижестоящую мишень PI3K/AKT киназного сигнального пути. Активированная AKT киназа непосредственно регулирует активность FOXO3a посредством фосфорилирования, вызывая ее транслокацию в цитоплазму, где она подвергается секвестрации под действием шаперона 14-3-3. Ингибирование киназ PI3K/AKT приводит к дефосфорилированию и ядерной локализации FOXO3a, вызывая его активацию. Ядерная локализация FOXO3a дает возможность ему действовать в качестве фактора транскрипции, вызывая остановку клеточного цикла и/или апоптоз через апрегуляцию его ключевых генов-мишеней, таких как p27Kip1 и Bim.

"Профиль локализации" относится к количеству данной молекулы в одном местоположении по сравнению с ее количеством во втором местоположении. В одном примере профиль локализации FOXO3a относится к количеству FOXO3a в клеточном ядре по сравнению с его количеством в цитоплазме клетки. Профиль локализации может быть выражен через отношение (например, количество FOXO3a в ядре, деленное на количество FOXO3a в цитоплазме) или разность (например, количество FOXO3a в ядре минус количество FOXO3a в цитоплазме). "Ядерный профиль локализации" относится к профилю локализации, при котором уровни FOXO3a существенно выше в ядре, чем в цитоплазме. В одном примере ядерный профиль локализации включает более чем приблизительно 50% FOXO3a в ядре по сравнению с цитоплазмой. В других примерах ядерный профиль локализации включает более чем приблизительно 70%, альтернативно, более чем приблизительно 80%, альтернативно, более чем приблизительно 90% FOXO3a в ядре, чем в цитоплазме. "Цитоплазматический профиль локализации" относится к профилю локализации, при котором уровни FOXO3a существенно выше в цитоплазме, чем в ядре. В одном примере цитоплазматический профиль локализации включает более чем приблизительно 50% FOXO3a в цитоплазме, чем в ядре. В других примерах цитоплазматический профиль локализации включает более чем приблизительно 70%, альтернативно, более чем приблизительно 80%, альтернативно, более чем приблизительно 90% FOXO3a в цитоплазме, чем в ядре.

Один аспект, таким образом, включает способ прогнозирования чувствительности роста опухолевых клеток к ингибированию под действием ингибитора AKT-киназного пути, включающий: определение профиля локализации FOXO3a в клетке опухоли, где цитоплазматический профиль локализации FOXO3a коррелирует с чувствительностью к ингибированию под действием ингибитора AKT-киназы, и ядерный профиль локализации FOXO3a коррелирует с устойчивостью к ингибированию под действием ингибитора AKT-киназы.

"Профиль pAKT" относится к уровню активации или фосфорилирования AKT ("pAKT") по сравнению с уровнем неактивированной или нефосфорилированной AKT в данном образце. В одном примере образцом является опухолевая клетка. Профиль pAKT может быть выражен через отношение (например, количества pAKT в клетке опухоли, деленное на количество нефосфорилированной AKT в клетке или в неопухолевой клетке того же типа) или разность (например, количество pAKT в клетке опухоли минус количество нефосфорилированной AKT в клетке или в неопухолевой клетке того же типа). Профиль pAKT может также быть выражен через уровень активации пути при измерении количества фосфорилированных нижестоящих мишеней AKT (например, pGSK или PRAS40). "Высокий профиль pAKT" относится к уровням активации или фосфорилирования суммарной AKT в образце, которые превышают базовое значение. В одном примере базовое значение представляет собой базальные уровни pAKT для клетки данного типа. В другом примере базовое значение представляет собой средний уровень pAKT в данной популяции исследуемых клеток. В другом примере "высокий профиль pAKT" относится к опухолевой клетке, в которой повышена экспрессия или амплифицирована фосфорилированная или активированная AKT по сравнению со средним значением в нормальных, здоровых (например, неопухолевых) клетках того же типа или из той же популяции млекопитающих или пациентов. На фиг.9 показан пример, который демонстрирует, что высокий профиль pAKT предсказывает чувствительность к ингибиторам AKT, например, GDC-0068. Профиль pAKT также может применяться в сочетании с другими маркерами (например, потерей PTEN, мутациями PI3K, Kras или Braf киназ, или профилями локализации FOXO3) для прогнозирования эффективности некоторых ингибиторов AKT.

Способы измерения уровней активации AKT и количеств pAKT в образце известны в данной области техники. Например, могут использоваться иммунопреципитационные анализы, такие как набор AKT Activity Assay (производства Abcam®, San Francisco, CA). В другом примере могут использоваться Вестерн-блот анализы, такие как набор AKT Western Blot Assay (производства Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Другие известные форматы анализов, используемые для измерения уровней pAKT, включают хемилюминесцентный иммуносорбентный анализ, см. Cicenas, J, et. al., "Increased level of phosphorylated akt measured by chemiluminescence-linked immunosorbent assay is a predictor of poor prognosis in primary breast cancer overexpressing ErbB-2," Breast Can. Res., 7(4), R394, 2005. Доступны другие анализы, которые могут использоваться, например, набор AlphaScreen SureFire Akt 1 (p-Thr308) (производства Perkin Elmer, Waltham, MA).

Методы определения присутствия мутаций PI3K известны в данной области техники. Например, известны анализы для обнаружения определенных мутаций в гене PIK3CA (в экзонах 9 и 20, а также мутации H1047R или H1047L) при использовании ПЦР в реальном времени (Qiagen, Valencia, CA).

Нуклеиновой кислотой, может являться, например, геномная ДНК, РНК, транскрибированная с геномной ДНК или кДНК, полученной с РНК. Нуклеиновая кислота может быть получена из позвоночного животного, например, млекопитающего. Нуклеиновая кислота, как говорят, "происходит из" конкретного источника, если она получена непосредственно из того источника, или если она является копией нуклеиновой кислоты, обнаруженной в данном источнике.

Вариации в нуклеиновых кислотах и аминокислотных последовательностях могут быть обнаружены с помощью определенных методов, известных специалистам в данной области техники. Такие методы включают, но без ограничения, секвенирование ДНК; анализы с удлинением праймеров, включая анализы включения аллель-специфичных нуклеотидов и анализы с удлинением аллель-специфичных праймеров (например, аллель-специфичную ПЦР, аллель-специфичную лигазную цепную реакцию (ЛЦР) и ЛЦР с пропусками); анализы гибридизации аллель-специфичных олигонуклеотидов (например, анализы лигирования олигонуклеотидов); анализы с защитой от расщепления, где защита от расщепляющих агентов используется для обнаружения ошибочно спаренных оснований в дуплексах нуклеиновых кислот; анализ связывания белка MutS; электрофоретический анализ, в котором сравнивают подвижность измененных молекул нуклеиновых кислот и молекул дикого типа; денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE, как описано, например, Myers et al. (1985) в Nature 313:495); анализ расщепления РНКазой по ошибочно спаренным парам оснований; анализ химического или ферментативного расщепления гетеродуплекса ДНК; масс-спектрометрию (например, MALDI-TOF); анализ генетической информации (GBA); 5'-нуклеказный анализ (например, TaqMan^®); и анализы с использованием молекулярных маяков. Некоторые из указанных методов обсуждаются ниже более подробно.

Обнаружение вариаций в целевых нуклеиновых кислотах может быть выполнено с помощью молекулярного клонирования и секвенирования целевых нуклеиновых кислот при использовании методик, известных в данной области техники. Альтернативно, методики амплификации, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), могут использоваться для амплификации целевых последовательностей нуклеинов