Vegf полиморфизм и антиангиогенезная терапия

Vegf полиморфизм и антиангиогенезная терапия

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США номер 60/991616, поданной 30 ноября 2007 года, и предварительной заявки США номер 61/038699, поданной 21 марта 2008 года, описание которых включено в настоящий документ в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится в основном к лечению болезней и расстройств человека, связанных с анти-ангиогенезной терапией. Точнее, изобретение относится к анти-ангиогенезному лечению рака или в качестве монотерапии, или в комбинации с другими противоопухолевыми способами лечения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕРНИЯ

Рак остается одной из наиболее смертельных угроз здоровью человека, которой подвергаются свыше 1 миллиона пациентов в год в США. Солидные опухоли ответственны за большинство этих смертей. Хотя медицинское лечение подтвержденных опухолей значительно продвинулось, современные способы лечения относительно не селективные: хирургические способы удаляют больную ткань; лучевая терапия уменьшает в размерах солидную опухоль; химиотерапия убивает быстро делящиеся клетки.

Эти виды лечения могут приводить ко множеству побочных эффектов, в некоторых случаях настолько тяжелым, что они ограничивают дозировку, которая могла бы быть дана, и, таким образом, мешают использованию потенциально эффективных препаратов.

Ангиогенез - это важное клеточное событие, в котором клеточный эндотелий пролиферирует, упрощается и перестраивается, чтобы сформировать новые сосуды из ранее существовавшей сосудистой сети. Ангиогенез характерен для роста большинства первичных опухолей и их последующего метастазирования. Сосудистый фактор роста эндотелиалия (VEGF), который также может называться VEGF-A или фактор сосудистой проницаемости (VPF), описан как основной регулятор как нормального, так и патологического ангиогенеза. Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. MoL Med. 77:527-543.

Анти-VEGF антитело «Бевацизумаб» известен также как препарат «BV», «rhuMAb VEGF», или «Авастин^®»; это рекомбинантные, гуманизированные анти–VEGF моноклональные антитела, созданные в соответствии с Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599; препарат на сегодняшний день разрешен в США для лечения колоректального рака с метастазами, немелкоклеточного рака легких и метастатического рака груди. Как и другие виды лечения, терапия «Авастином^®» сопряжена с доказанными побочными эффектами, включая повышенный риск артериальной гипертонии.

Генный полиморфизм возникает в популяции, когда различные аллели одного гена приводят к формированию различных фенотипов. Так полиморфизм может играть роль в определении эффективности и безопасности лекарственных препаратов. Например, конкретные полиморфизмы в VEGF, как показано, связаны с заболеваемостью раком груди. Schneider et al. (2008) Breast Cancer Research and Treatment 111:157-63.

Выявление дополнительных полиморфизмов, предсказывающих эффективность или безопасность лечения, может быть использовано, чтобы улучшить моделирование вида лечения, которое могло бы дать наилучший эффект от него.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение частично основано на выявлении полиморфизмов VEGF, которое прогнозирует высокую вероятность от лечения антагонистами VEGF и/или высокий риск артериальной гипертонии у пациентов, которые находятся на лечении анти–VEGF, включая «Авастин^®».

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ прогнозирования, будет ли пациент иметь высокий риск артериальной гипертензии, связанный с лечением антагонистами VEGF, содержащий скрининг образцов, полученных от пациента для геномного полиморфизма, выбранного из VEGF(-1498C/T) и VEGF (-634G/C), где пациент имеет высокий риск артериальной гипертензии, связанный с лечением антагонистами VEGF, если соответствующий генотип включает VEGF (-1498C) или VEGF (-634G). В некоторых примерах осуществления антагонисты VEGF - это антитела анти–VEGF, например бевацизумаб. В некоторых примерах осуществления будущее лечение содержит назначение анти–неопластической композиции. В некоторых примерах осуществления пациент проходит лечение по поводу рака, например рака груди.

В другом аспекте изобретение обеспечивает комплект для предсказания, будет ли пациент иметь высокий риск гипертензии, связанный с лечением антагонистами VEGF, содержащими первый олигонуклеотид и второй олигонуклеотид, специфичный для полиморфизма в VEGF, который отбирает из группы, состоящей из VEGF (-1498C/T) и VEGF (-634G/C). В некоторых примерах осуществления олигонуклеотиды в комплекте применимы для области VEGF, содержащей один из этих полиморфизмов.

В другом аспекте изобретение обеспечивает способ предсказания, имеет ли пациент высокую вероятность пользы от лечения антагонистами VEGF, включающий скрининг образцов, выделенных из пациента для геномного полиморфизма VEGF (-2578C/ A) или VEGF (-1154G/A), где имеется высокая вероятность пользы от лечения антагонистами VEGF, если соответствующий генотип содержит VEGF (-2578AA) или VEGF (1154AA). В некоторых примерах осуществления антагонисты VEGF - это анти–VEGF антитела, например, бевацизумаб. В некоторых примерах осуществления будущее лечение содержит назначение анти-неопластической композиции. В некоторых примерах осуществления пациент проходит лечение по поводу рака, например рака груди.

В другом аспекте изобретение обеспечивает комплект для предсказания, имеет ли пациент высокую вероятность пользы от лечения антагонистами VEGF, содержащими первый олигонуклеотид и второй олигонуклеотид, специфичный для полиморфизма в VEGF, который отбирает из группы, состоящей из VEGF (-2578C/A) и VEGF (-1154G/A. В некоторых примерах осуществления олигонуклеотиды в комплекте применимы для амплификации области VEGF, содержащей один из этих полиморфизмов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Осуществление на практике настоящего изобретения будет использовать, если не указано иное, традиционные способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологию, клеточную биологию, биохимию, иммунологию, которые находятся в рамках навыков специальных знаний. Такие способы подробно указаны в литературе, такой как «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», second edition (Sambrook et al., 1989); «Oligonucleotide Synthesis» (M. J. ed., 1984). «Animal Cell Culture» (R. I. Freshney, ed., 1987); «Methods in Enzymology» (Academic Press, Inc.); «Current Protocols in Molecular Biology» (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); «PRC: The Polymerase Chain Reaction», (Mullis et al., eds., 1994).

Если не определено иное, способ и научные термины, используемые в настоящем документе, означают тот же смысл, что обычно используется специалистами в данной области, к которой принадлежит изобретение, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley&Sons (New York, N.Y. 1994), and March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Struture 4th ed., John Wiley&Sons (New York N.Y. 1992), чтобы обеспечить квалифицированные специальные знания с общим руководством для множества терминов, используемых в настоящей заявке.

Все ссылки, которые цитируются в настоящем документе, включая патентные заявки и публикации, сделаны в полном объеме.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Как использовано в данном документе, единственное число включает и множественное число, если контекст четко не диктует иное, например, клетка также будет включать и «клетки». Термин «содержать» означает, что композиции и способы включают указанные элементы, но не исключают других.

Термины "VEGF и "VEGF-A" использованы как синонимы для обозначения 165 аминокислотного сосудистого фактора роста эндотелиалия и обозначения 121-, 189- и 206 аминокислотного сосудистого фактора роста клеток эндотелиалия, как описано Leung et al. Science, 246: 1306 (1989), and Houck et al. MoI. Endocrin., 5: 1806 (1991), вместе с естественным возникновением аллей и ходом развития результата из них. Термин "VEGF» также использован, чтобы обозначать «обрезанные формы» полипептидов содержащие аминокислоты с 8 по 109 или с 1 по 109165 - аминокислотного сосудистого фактора роста клеток эндотелиалия человека. Любые обозначения таких форм VEGF могут встречаться в настоящей заявке, например как "VEGF (8-109), "VEGF (1-109)" или "VEGF₁₆₅". Положение аминокислоты для «обрезанной» исходной VEGF пронумеровано, как обозначено в исходной последовательности. Например, позиция 17 (метионин) аминокислоты в «обрезанном» исходном VEGF - это также позиция 17 (метионин) аминокислоты в исходном VEGF. «Обрезанный» исходный VEGF имеет обязательное сродство к KDR и FIt-I рецепторами, которые сопоставимы с исходным VEGF.

Анти–VEGF антитела не будут обычно связываться с другими VEGF гомологами, такими как VEGF-B или VEGF-C, или другими факторами роста, такими как PlGF, PDGF или bFGF. Предпочитаемое анти–VEGF антитело - это моноклональное антитело, которое соединяется с подобным эпитопом, как моноклональное анти–VEGF антитело A4.6.1, синтезирующееся с участием гибридомы ATCC HB 10709. Более предпочтительны анти-VEGF антитела - это рекомбинантные гуманизированные анти-VEGF антитела, синтезированные согласно Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599, включая, но не ограничиваясь, антителами, известными как бевацизумаб (BV; Avastin^®).

«VEGF антагонистом» обозначается молекула, способная нейтрализовать, блокируя, ингибируя, снижая или вмешиваясь в активность VEGF, включая соединение с одним или более VEGF рецепторами. VEGF антагонисты включают анти–VEGF антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, молекулы рецептора и производные, которые специфично соединяются с VEGF, таким образом нарушая его соединение с одним или более рецептором, анти–VEGF антитела рецепторов и антагонисты VEGF рецепторов, такие как ингибиторы малых молекул VEGFR тирозин киназ.

Термин «антитела» используется в широком смысле и включает моноклональные антитела (включая молекулы полной длины или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультвалентные антитела, мультиспецифические антитела (например, бивалентые антитела) и фрагменты антител, которые обладают желаемой биологической активностью.

Термин «моноклональные антитела» обозначает антитела, полученные главным образом из семейства однотипных антител, то есть отдельные антитела, содержащие семейство; это одинаковые антитела, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительном количестве. Моноклональные антитела высокоспецифичны, будучи направлены против одного антигена. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные на различные детерминанты (эпитопы), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты в антигене. Термин «моноклональный» не следует толковать как требующий производства антител каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые будут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть сделаны способом гибридом, впервые описанным by Kohler et al, Nature 256:495 (1975), или могут быть сделаны рекомбинантным ДНК способом (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» могут быть также выделены из банка антител фагов, используя методику, описанную Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) or Marks et al, J. MoI Biol 222:581-597 (1991), например.

«Расстройство» - это любое состояние, при котором возможен положительный эффект от лечения антителами. Оно включает хронические и острые расстройства или заболевания, включая такие патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающих к расстройствам, о которых идет речь. Неограничивающие примеры расстройств, указанных здесь, включают доброкачественные и злокачественные опухоли; лейкемии и злокачественные лимфоидные опухоли, опухоли нейрональной, глиальной, астральной ткани и других желез, макрофагальные, эпителиальные, стромальные и бластроцельные расстройства; и воспалительные, ангиогенные и иммунологические расстройства.

Термин «терапевтически эффективное количество» обозначает дозу лекарства, эффективную для лечения заболевания или расстройства у млекопитающих. В случае рака терапевтически эффективная доза лекарства может снижать количество раковых клеток, уменьшать опухоль в размере, ингибировать (то есть замедлить до некоторой степени или желательно остановить) прорастание раковых клеток в прилежащие органы, ингибировать (то есть замедлить до некоторой степени или желательно остановить) метастазирование опухоли, ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли, и/или облегчить до некоторой степени один или более симптомов, связанных с этим расстройством. В этой степени препарат может предотвратить рост и/или убивать существующие раковые клетки, это может быть цитостатик и/или цитотоксический препарат. Для лечения рака эффективность in vivo может, например, быть оценена по общей выживаемости (OS), выживаемости без прогрессирования заболевания (PFS), времени до прогрессирования заболевания (TTP), проценту ответивших на лечение (RR), продолжительности ответа и/или по качеству жизни.

«Лечение» означает как терапевтическое лечение, так и профилактические и превентивные меры. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже болеет, а также тех, у кого расстройства должны быть предотвращены.

Термины "рак" и "раковые" означает или описывается как физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется неконтролируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но не ограничиваются, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкемию. Более частные примеры таких раков включают рак сквамозных клеток, рак легкого (включая мелкоклеточный рак, крупноклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, сквамозную карциному легкого), канцероматоз брюшной полости, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка (включая гастроинтестинальный рак), рак поджелудочной железы, глиобластома, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак груди, толстой кишки, колоректальный рак, рак эндометрия или карциному матки, карциному слюнной железы, рак почки или карциному почки, рак печени, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные виды рака головы и шеи, а также B-клеточную лимфому (в том числе низко дифференцированные/фолликулярные неходжкинской лимфомы (НХЛ), лимфому из малых лимфоцитов (ЛМЛ) НХЛ; умеренно дифференцированные/фолликулярные НХЛ; умеренно дифференцированные диффузные НХЛ, высокодифференцированные иммунобластные НХЛ; высокодифференцированные лимфобластные НХЛ, высоко дифференцированные непроникающие мелкоклеточные НХЛ, НХЛ опухоли больших масс; лимфомы мантийной зоны, СПИД–ассоциированные лимфомы; и макроглобулинэмию Вальденсрема; хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ); острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз и посттрансплантатные лимфопролиферативные расстройства (ПТЛПР), такие как абдоминальная сосудистая пролиферация ассоциированная с факоматозом, отек (такой, который ассоциирован с опухолями мозга) и синдром Мейгса.

Термин "анти-неоплатическая композиция" означает композицию, пригодную для лечения рака, содержащую, по меньшей мере, один активный терапевтический агент, способный ингибировать или предотвращать рост или функцию опухоли и/или разрушать опухолевые клетки. Терапевтические средства, годные в качестве анти–неопластической композиции для лечения рака, включают, но не ограничиваются, хемотерапевтические агенты, радиоактивные изотопы, токсины, цитокины, такие как интерфероны, и антагонисты, воздействующие на цитокины, цитокиновые рецепторы или антигены, ассоциированные с опухолевыми клетками. Предпочтительным терапевтическим агентом является химиотерапевтический агент.

«Химиотерапевтический агент» - это химическое соединение, пригодное для лечения рака.

«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты - это молекула нуклеиновой кислоты, которая определена или отделена от, по меньшей мере, одной примешанной молекулы нуклеиновой кислоты, с которой обычно она ассоциируется в природном источнике полипептидной нуклеиновой кислоты. У выделенной молекулы нуклеиновой кислоты отличаются формы или условия, в которых она существует в природе. Поэтому выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, которая существует в природе. Тем не менее, выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулы нуклеиновой кислоты, содержащиеся в клетках, которые обычно экспрессируют полипептид, когда, например, молекулы нуклеиновой кислоты находятся в хромосоме, отличающейся от таковой в естественных клетках.

Термин «полиморфизм» означает позицию в последовательности генов, которая меняется в популяции. Полиморфизм - это содержание различных «аллелей». Этот полиморфизм определяется по позиции различных оснований в гене, которые найдены в нем. Например, VEGF -1498C/T определен как вариация между С и Т позицией – 1498 в гене VEGF. Два возможных варианта С и Т - это и есть два различных аллеля. Поскольку генотип состоит из двух отдельных аллелей, любой из нескольких возможных вариантов может наблюдаться в любом одном человеке (например, для данного случая CC, CT или TT).

Термин «генотип» означает конкретные аллели определенного гена в клетке или образце ткани. В приведенном примере СС, СТ или ТТ - возможные генотипы VEGF -1498C/T полиморфизма.

Термин «образец» включает клетки тканей образца, полученного от пациента. Например, образец может включать образец опухоли, образец нормальной ткани, соответствующий типу опухоли, или образец тканей, взятых из зоны, окружающей опухоль, или клетки крови.

Определение конкретных генотипов в образце может выполняться любым количеством способов, хорошо известных в одном специальном знании. Например, определение полиморфизма может быть достигнуто путем клонирования аллелей и последовательности, используя способы, хорошо известные в области техники. Кроме того, последовательности генов могут быть амплифицированы от геномной ДНК, например способом ПЦР и воспроизведением последовательности. Некоторые неограничивающие способы анализа мутаций ДНК пациента в определенных генетических локусах описаны ниже.

Может быть использована технология ДНК-чипов, т.е. оборудование для ДНК чипов и чипы с высокой плотностью для высокоразрешающего скрининга и чипы с низкой плотностью. Способы производства чипов известны в данной области и включают в себя различные струйные и микроструйные или точечные способы и технологии нанесения, in situ или на чипе фотолитографические способы синтеза олигонуклеотидов и способы электронной адресации ДНК проб. Заявки по гибридизации ДНК чипов были успешно использованы в способах анализа генной экспрессии и генотипирования точечных мутаций, однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и коротких тандемных повторов (STR). Дополнительные способы включают в себя чипы с интерферирующими РНК и комбинации чипов с другими методиками, такими как лазерная захватывающая микродиссекция (LCM), сравнительная геномная гибридизация (CGH) и иммунопреципитация хроматина (ChiP). Смотри, например, He et al. (2007) Adv. Exp. Med. Biol. 593: 117-133 и Heller (2002) Annu. Rev. Biomed. Eng. 4: 129-153. Другие способы включают ПЦР, технологию xMAP, методики с захватом, масс-спектрометрию и пиросеквенирование (Wang et al. (2007) 593:105-106).

Другой способ выявления - это аллель-специфическая гибридизация, использующая перекрывающиеся зонды полиморфных сайтов, и имеющих около 5 или же 10, или же 20, или же 25, или же 30 нуклеотидов вокруг района полиморфизма. Например, несколько зондов, способных к специфической гибридизации аллельных вариантов, прикрепляются к твердой поддерживающей основе, например «чипу». Олигонуклеотиды могут быть присоединены к твердой основе путем различных процессов, включая литографию. Анализ определения мутации, использующий такие чипы, содержащие олигонуклеотиды, также называемые «массивы ДНК чипов», описана, например, Cronin et al. (1996).

В других способах определения необходимо амплифицировать по меньшей мере часть гена, прежде чем идентифицировать вариант аллеля. Амплификация может быть выполнена, например, ПЦР и/или ЛЦР, или другим способом, хорошо известным в области техники.

В некоторых случаях наличие специфического аллеля в ДНК от пациента может быть продемонстрировано путем рестрикционного ферментного анализа. Например, конкретный нуклеотидный полиморфизм может приводить к последовательности нуклеотидов, содержащих рестрикцию сайта, который отсутствует в нуклеотидной последовательности другого аллельного варианта.

В следующих вариантах осуществления защита от расщепляющих агентов (таких как нуклеаза, гидроксиламин или тетроксид осмия) может быть также использована, чтобы определить несовпадающие основания РНК/РНК, ДНК/ДНК или РНК/ДНК гетеродуплексы (см., например, Myers et al. (1985) Science 230: 1242). Вообще методика «расщепления несовпадений» начинается с обеспечения гетеродуплексов, образованных гибридизацией контрольной нуклеиновой кислотой, которая дополнительно помечена, например РНК или ДНК, содержащая нуклеотидные последовательности аллельного варианта гена с образцом нуклеиновой кислоты, например РНК или ДНК, полученного из образца ткани. Двунитевые дуплексы подвергаются действию агентов, которые расщепляют однонитевые регионы дуплексов, такие, которые сформированы парой несовпадающих оснований между контролем и нитью образца. Например, РНК/ДНК дуплексы могут быть подвергнуты воздействию РНК–азы и ДНК/ДНК гибридов, подвергнутые воздействию S1 нуклеазы, чтобы ферментативно переварить несовпадающие регионы. Кроме того, как ДКН/ДНК или РНК/ДНК, дуплексы могут быть подвергнуты воздействию гидроксиламином или тетроксидом осмия и пипередином для переваривания несовпадающих регионов. После переваривания несовпадающих регионов полученный материал тогда отделяется размером денатурирующего полицикламидного геля, чтобы определить, имеет ли нуклеиновая кислота из контроля и образца одинаковую последовательность, или нуклеотиды в них различаются. См., например, патент США № 6455249, Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba et al. (1992) Meth. Enzymol. 217:286- 295.

Для выявления конкретных аллельных вариантов могут быть также использованы изменения в электрофоретической подвижности. Например, конформационный одноцепочечный полиморфизм (SSCP) может быть использован для выявления различий в элекрофоретической подвижности между мутантной и натуральной нуклеиновой кислотой. (Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766; Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144 and Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79). Фрагменты однонитевой ДНК образца и контроля нуклеиновых кислот денатурируются и позволяют ренатурировать. Вторичная структура одноцепочечных нуклеиновых кислот изменяется в зависимости от последовательности, в результате изменения в электрофоретической подвижности дают возможность обнаруживать изменения даже в одном основании. Фрагменты ДНК могут быть помечены или обнаружены с помощью меченных зондов. Чувствительность способа может быть увеличена с помощью РНК (но не ДНК), в которых вторичная структура более чувствительна для изменений в последовательности. В других предпочтительных примерах осуществления предмет способа использует гетеродуплексный анализ, чтобы разделить дуплекс двуцепочечной молекулы на основании изменений в электрофоретической подвижности. (Keen et al. (1991) Trends Genet. 7:5).

Одинаковость аллельных вариантов может быть также получена на основе анализа движения нуклеиновых кислот, включая район полиморфизма, в полиакриламидном геле, который содержит градиент денатурации, используя денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) (Myers et al. (1985) Nature 313:495). Если в способе анализа используют ДГГЭ, ДНК нужно модифицировать для того, чтобы не было полной денатурации, например добавлением GC скрепителей приблизительно 40 п.н. высокоплавящейся GC-богатой ДНК с помощью ПЦР. В дополнительном варианте осуществления вместо денатурирующего агента используют температурный градиент для определения разницы в подвижности контрольной ДНК и ДНК образца. (Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265:1275).

Примеры методик для выявления различий по меньшей мере в одном нуклеотиде между 2 нуклеиновыми кислотами включают, но не ограничиваются, избирательную гибридизацию олигонуклеотидов, избирательную амплификацию или избирательное удлинение праймера. Например, олигонуклеотидные зонды могут быть приготовлены с известным полиморфным нуклеотидом, размещенным центрально (аллель-специфические зонды), и затем гибридизуются с целевой ДНК при состоянии, которое разрешает гибридизацию, только если найдена истинная совместимость (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230). Такая аллель-специфическая олигонуклеотидная гибридизация может быть использована для выявления нуклеотидных изменений в районе полиморфизма гена. Так, например, олигонуклеотиды, имеющие нуклеотидную последовательность конкретного варианта аллеля, прикреплены к гибридизирующей мембране, и затем эта мембрана гибридизуется с меченым образцом нуклеиновой кислоты. Анализ сигнала гибридизации затем выявляет идентичность нуклеотидов в образце нуклеиновой кислоты.

Кроме того, технология аллель-специфической амплификации, которая зависит от селективности амплификации ПЦР, может быть использована в сочетании с настоящим изобретением. Олигонуклеотиды, используемые как праймеры специфической амплификации, могут нести интересующий аллельный вариант в центре молекулы (так что амплификация зависит от дифференциальной гибридизации) (Gibbs et al. (1989). Nucl. Acid Res. 17:2437-2448) или на конце 3' одного праймера, где при соответствующих условиях можно избежать ошибочного спаривания или уменьшить удлинение полимеразы (Prossner (1989) Tibtech 11:238 and Newton et al. (1989) Nuck. Acids Res. 17:2503). Эта методика также называется «PROBE» для зонда удлинения олигооснования. Кроме того, желательно вводить новый участок ограничения в регион мутации для определения, основанного на расщеплении. (Gasparini et al. (1992). Mol. Cell. Probes 6:1).

В других предпочтительных примерах осуществления определение аллельных вариантов проводится способом олигонуклеотидного легирования (OLA), как описано в U.S. Pat. No. 4998617 and in Laridegren, U. et al. Science 241:1077-1080 (1988). Протокол OLA использует 2 олигонуклеотида, которые созданы, чтобы быть способными гибридизироваться с примыкающей последовательностью одиночной цепи мишени. Один олигонуклеотид связан с разделительным маркером, например биотинилированный, и обнаруживаемо помечен, если найдена точная комплементарная последовательность в молекуле–мишени, то олигонуклеотиды будут гибридизироваться так, что их концы будут соединяться, образуя субстрат для лигации. Лигация разрешена тогда, когда меченный олигонуклеотид будет восстановлен, используя авидин или другой биотиновый лиганд, Nickerson, D. A. et al., которые описали анализ выявления нуклеиновой кислоты, который комбинирует свойства ПЦР и OLA (Nickerson, D. A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8923-8927). В этом способе ПЦР используется для достижения экспоненциальной амплификации мишени ДНК, которая затем определяется, используя OLA.

Изобретение обеспечивает способ определения однонуклеотидного полиморфизма (SNP) в VEGF. Поскольку однонуклеотидный полиморфизм расположен сбоку района одновариантного нуклеотида, и не требуется определять генетическую последовательность целиком для каждого пациента. Некоторые способы уже развиты, чтобы упростить анализ SNPs.

Полиморфизм одного основания может быть определен, используя специализированный нуклеотид, резистентный к экзонуклеазе, как описано в патенте США № 4656127. Согласно способу, 3' конец праймера полностью комплиментарен аллельной последовательности полиморфного сайта, чтобы разрешить гибридизацию молекуле-мишени, полученной от конкретного животного или человека. Если полиморфный сайт на молекуле-мишени содержит нуклеотиды, которые комплиментарны отдельному резистентному к нуклеазе нуклеотиду существующей производной, тогда производная будет объединяться с концом гибридизированного праймера. Такое объединение делает праймер устойчивым к экзонуклеазе и, таким образом, разрешает это определение. К тому моменту, как обнаруживается идентичность экзонуклезорезистентного производного образца, обнаружение того, что праймер уже стал устойчивым к экзонуклеазам, дает понять, что нуклеотид, присутствующий в полиморфном сайте молекулы–мишени, был комплиментарным к таковому в нуклеотидном производном, использовавшимся в реакции. Этот способ имеет преимущества, что не требует определения большого количества данных о прилежащих последовательностях.

Способ, основанный на растворе, может быть также использован для определения нуклеотида в полиморфном сайте (WO 91/02087). Как говорилось выше, задействованный праймер комплиментарен к аллельной последовательности полиморфного сайта опосредованно через 3'. Способ определяет идентичность нуклеотидов сайта, используя меченные дидезоксинуклеотидные производные, которые, если комплиментарны к нуклеотиду полиморфного сайта, будут включены в конец праймера.

Альтернативный способ описан для WO 92/15712. Этот способ использует смесь меченного терминатора и праймера, которые комплиментарны к последовательности 3' к полиморфному сайту. Меченный терминатор, который включен и таким образом определен, при этом комплиментарный, при этом оценивается нуклеотид, присутствующий в полиморфном сайте молекулы мишени. Способ обычно оценивает гетерогенную фазу, в котором праймер или молекула-мишень зафиксирована в твердой фазе.

Много других праймеров управляемых нуклеотидов, вовлеченных в процедуру для оценки полиморфных сайтов в ДНК, уже описано (Komher, J. S. et al. (1989) Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784; Sokolov, B. P. (1990) Nucl. Acids Res. 18:3671; Syvanen, А.-C., et al. (1990) Genomics 8:684-692; Kuppuswamy, M. N. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1143-1147; Prezant, T.R.et al. (1992) Hum. Mutat. 1:159-164; Ugozzoli, L. et al. (1992) GATA 9:107-112; Nyren, P. et al. (1993) Anal. Biochem. 208:171-175). Этот способ целиком полагается на меченные дезоксинуклеотиды, чтобы разделить основания в полиморфном сайте.

Более того, будет понятно, что любой из вышеописанных способов для определения изменений в гене или продукте гена или полиморфных вариантов может быть использован для мониторинга курса лечения или терапии.

Способ, описанный здесь, может быть выполнен, например, утилизируя предварительно расфасованные комплекты, такие как описаны ниже, содержащие по меньшей мер один зонд или праймер нуклеиновой кислоты, которые могут быть легко использованы, например, чтобы определить, имеет ли пациент риск развития артериальной гипертензии, связанной с лечением антагонистами VEGF.

Образцы нуклеиновых кислот для использования в вышеописанных диагностических и прогностических способах, могут быть получены от любых типов клеток или тканей пациента. Например, физиологическая жидкость пациента (например, кровь) может быть получена известными способами. В качестве альтернативы, тесты нуклеиновых кислот могут быть проведены на сухих образцах (например, волосы или кожа).

Изобретение, описанное здесь, имеет отношение к способам и композициям для определения и идентификации аллелей, присутствующих в VEGF локусе. Эта информация полезна для предсказания степени риска развития артериальной гипертензии, связанной с лечением антагонистами VEGF. Зонды могут быть использованы для определения генотипа образца или могут быть использованы одновременно или последовательно с амплификацией. Термин «зонд» включает естественно возникшую или рекомбинантную одно– или двуцепочечную нуклеиновую кислоту или химически синтезированную нуклеиновую кислоту. Они могут быть мечены путем «ник»-трансляции, реакции временного заполнения Кленова, ПЦР или другими способами, известными в области техники. Зонды настоящего изобретения, их приготовление и/или метка описаны Sambrook et al. (1989) выше. Зонд может быть полинуклеотидом любой длины, пригодным для селективной гибридизации нуклеиновых кислот, содержащих полиморфный регион изобретения. Длина используемого зонда будет зависеть, в частности, от характера используемого анализа и условий задействованной гибридизации.

Меченные зонды также могут быть использованы в сочетании с амплификацией полиморфизма. (Holland et al. (1991) Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:7276-7280). Патент США № 5210015 описывает основанные на флуоресценции подходы к измерению продуктов амплификации во время ПЦР. Такой подход либо использует интрекаляционный краситель (такой как бромид этидиума), чтобы определить количество присутствующей двуцепочечной ДНК, или использует зонды, содержащие пары с флуоресцентным гасителем (также называются как "Taq-Man"), где зонд расщепляется во время амплификации, чтобы освободить флуоресцентные молекулы, концентрация которых пропорциональна количеству двухцепочечной ДНК. Во время амплификации проба расщепляется за счет нуклеазной активности полимеразы, когда гибридизуется с таргетной последовательностью и способствует отсоединению флуоресцентной молекулы от молекулы-гасителя, таким образом вызывая появление флуоресценции от репортерной молекулы. Taq-Man подход использует зонд, содержащий пару репортер- молекула/гаситель-молекула, что специфично плавит регион полинуклеотида мишени, содержащего полиморфизм.

Зонды могут быть прикреплены к поверхностям для использования в качестве «генных чипов». Такие генные чипы могут быть использованы для определения генетических вариаций с использованием ряда техник, известных в одном специальном знании. В одной технике олигонуклеотиды могут выстраиваться на генном чипе для определения ДНК последовательности с использованием способов секвенирования или гибридизации, например указанные в патентах США №№ 6025136 и 6018041.

Зонды настоящего изобретения также могут быть использованы для флуоресцентного определения генетической последовательности. Такие способы были описаны, например, в патентах США №№ 5968740 и 5858659. Зонды могут также быть прикреплены к поверхности электрода для электрохимического определения последовательности нуклеиновых кислот, такие как описаны в патенте США № 5952172 and by Kelley, S. O. et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27:4830-4837.

Кроме того, изолированные нуклеиновые кислоты, используемые как зонды или как праймеры, могут быть изменены, чтобы стать более стабильными. Типичные нуклеиновые кислоты, которые изменены, включают фосфорамидат, фосфотиоат и метилфосфонат аналоги ДНК (см. также патенты США №№ 5176996, 5264564 и 5256775).

Как указано в настоящем документе, изобретение также обеспечивает способы диагностики для определения типа аллельных вариантов полиморфного региона присутствующего в VEGF. В некоторых примерах осуществления способы используют зонды или праймеры, содержащие нуклеотидные последовательности, которые комплиментарны к полиморфным областям VEGF. Таким образом, изобретение обеспечивает наборы для выполнения этих способов.

В некоторых примерах осуществления изобретение представляет собой комплект для определения того, имеет ли пациент риск развития артериальной гипертензии, связанных с лечением антагонистами VEGF. В некоторых примерах осуществления изобретение представляет собой комплект для определения того, может ли пациент иметь большую вероятность получения положительного эффекта от лечения анти-VEGF. Такие наборы содержат один из нескольких композиций, описанных выше, и инструкции по эксплуатации. В качестве только примера изобретение также обеспечивает наборы для определения того, имеет ли пациент риск развития артериальной гипертензии, связанной с лечением антагонистами VEGF, содержащие первый и второй олигонуклеотид, специфический для полиморфной области VEGF, например, VEGF (-2578C/A), VEGF (-1498C/T), VEGF (-1154G/A) или VEGF (-634G/C). В качестве другого примера изобретение также обеспечивает наборы для определения, имеет ли пациент большую вероятность эффективности лечения анти-VEGF, содержащий первый и второй олигонуклеотид, специфический для полиморфной области VEGF, например, VEGF (-2578C/A) или VEGF (-1154G/A). Олигонуклеотиды "специфические для" генетического локуса связываются либо с полиморфным регионом локуса, либо присоединяются к прилегающему району полиморфизма локуса. Для олигонуклеотидов, которые будут использоваться в качестве праймеров для амплификации, при этом праймеры достаточно близки, чтобы быть использованы для производства полинуклеотида, содержащего район полиморфизма. В одном примере осуществления олигонуклеотиды прилегают, если они соединены на протяжении примерно 1-2 кдальтон, например, менее, чем 1 кдальтон от полиморфизма. Конкретные олигонуклеотиды способны к гибридизации последовательности и при подх