Отбор больных раком для введения ингибиторов сигнального пути wnt на основании статуса мутации rnf43

Отбор больных раком для введения ингибиторов сигнального пути wnt на основании статуса мутации rnf43

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Притязание на приоритет

Настоящая заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США № 61/604290, поданной 28 февраля 2012 г.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам измерения или исследования с целью обнаружения опухолевой или раковой клетки и специфического выявления больных раком, у которых согласно прогнозу при введении ингибитора Wnt может быть достигнут благоприятный эффект, а также к композициям или индикаторным полоскам, содержащим антиген, связанный с клеточной мембраной, или рецептор, связанный с клеточной мембраной, которые предназначены для осуществления вышеуказанных способов. Настоящее изобретение также относится к ингибитору Wnt или фармацевтической композиции, включающей ингибитор Wnt, которые предназначены для введения специально отобранному субъекту.

Уровень техники

В биологии и медицине канонический сигнальный путь Wnt/β-катенина представляет собой ряд внутриклеточных сигнальных событий, включающих секретируемые лиганды Wnt, рецепторы на поверхности клетки и коактиватор транскрипции β-катенин, а также много других эффекторов и регуляторов указанных основных белковых компонентов. При отсутствии лигандов Wnt β-катенин постоянно находится в фосфорилированном состоянии под воздействием мультибелкового комплекса, который запускает его полиубиквитинацию и протеасомное разрушение. При связывании белка Wnt с его рецепторами цитозальный β-катенин стабилизируется в результате ингибирования деструктивного комплекса и перемещается в ядро для активации транскрипции генов-мишеней Wnt.

Главными рецепторами Wnt является семейство белков Frizzled (FZD), в котором LRP5 или LRP6 (белки 5 и 6, родственные рецептору LDL), являются основными корецепторами сигнального пути Wnt/β-катенина. Nusse R. (2005), Cell Research 15(1): 28-32. Рецепторы Frizzled являются трансмембранными молекулами, состоящими из семи фрагментов и имеющими длинный домен с высоким содержанием цистеина. Корецепторы LRP5/6 являются однопроходными трансмембранными белками. Huang H-C and Klein PS (2004) Genome Biol. 5(7): 234. LRP6 является доминантным рецептором по сравнению с LRP5, который необходим только для костного гомеостаза у взрослых. McDonald BT et al. (2009) Developmental Cell 17(1): 9-26.

Неканонический сигнальный путь Wnt не зависит от β-катенина. Рецепторы Frizzled участвуют в неканоническом сигнальном пути Wnt, но корецептор LRP6 не опосредует активность неканонического сигнального пути. Существует по меньшей мере два неканонических сигнальных пути Wnt, сигнальный путь полярности плоских клеток (РСР) и сигнальный путь высвобождения кальция.

Сигнальный путь Wnt/β-катенина имеет важное значение для регуляции роста и дифференцировки клеток в процессе развития эмбриона. У взрослых сигнальный путь Wnt стимулирует тканевый гомеостаз, и нарушение указанного сигнального пути является причиной разных болезней человека, в частности, рака. Nusse R (2005) Cell Research 15(1): 28-32.

Аберрантная сверхактивация сигнального пути Wnt часто имеет важное значение для онкогенеза колоректальных карцином. Также установлено, что анормальная передача сигналов Wnt ассоциирована с раками других типов. Указанные раки других типов включают рак поджелудочной железы, рак печени, рак молочной железы и рак кожи. Повышенная активность неканонического сигнального пути Wnt/РСР также имеет отношение к онкогенезу.

Были созданы антагонисты сигнального пути Wnt для лечения Wnt-зависимых опухолей. Для лечения рака было создано много ингибиторов Wnt, в частности, ингибиторы поркупина, ингибиторы танкиразы, антитела против белков Frizzled и антитела против LRP6. Однако большинство указанных ингибиторов Wnt направленно воздействуют на белковые компоненты верхней области сигнального пути Wnt. Указанные ингибиторы Wnt не подавляют передачу сигналов Wnt в опухолях с мутациями в генах, расположенных в нижней области сигнального пути Wnt, и поэтому часто не оказывают эффективного воздействия на опухоли с онкогенными мутациями в генах нижней области сигнального пути Wnt, таких как АРС (аденоматозный полипоз кишечника), AXIN1/2 и β-катенин.

Отсутствие методов, позволяющих идентифицировать опухоли с мутациями в генах, расположенных в верхней области сигнального пути Wnt, препятствует клиническому созданию ингибиторов Wnt. Таким образом, в данной области существует потребность в методе, позволяющем идентифицировать ассоциированную с раком мутацию в гене или генном продукте сигнального пути Wnt, локализованном в верхней области сигнального пути Wnt.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к диагностическому применению двух гомологичных трансмембранных убиквитин-лигаз Е3 (RNF453 и ZNRF3), которые снижают уровни белков Frizzled/LRP6 в комплексах рецепторов Wnt в результате убиквитинации белков Frizzled. Одним объектом изобретения является использование инактивирующих мутаций в гене RNF43 или гене ZNRF3 в качестве биомаркеров для отбора опухолевых клеток, рост которых замедляется ингибиторами сигнального пути Wnt. Другим объектом изобретения является отбор больных раком для лечения ингибиторами Wnt на основании инактивирующих мутаций в гене RNF43 или ZNRF3, используемых в качестве биомаркеров, определяющих чувствительность опухоли к лечению ингибитором Wnt. В соответствии с конкретным объектом изобретения инактивирующие мутации RNF43, такие как миссенс-мутации и мутации со сдвигом рамки, присутствуют в первичных опухолях и линиях клеток аденокарцином протоков поджелудочной железы (PDAC). Так как эндогенный ген RNF43 дикого типа регулирует передачу сигналов Wnt а клетках PDAC и ингибирование эндогенного гена RNF43 в PDAC повышает уровень белков Frizzled и увеличивает передачу сигналов Wnt, то настоящее изобретение относится к идентификации мутированного в раке компонента (RNF43) в верхней области сигнального пути Wnt.

Настоящее изобретение также показывает, что раковые клетки с мутациями гена RNF43 более чувствительны к ингибированию сигнального пути Wnt. Ингибирование гена RNF43 в раковых клетках вызывает повышение уровней белков Frizzled на поверхности клетки. Поэтому сигнальный путь Wnt с повышенной активностью и раковые клетки с мутантом RNF43, в частности, раковые клетки поджелудочной железы, более чувствительны к антагонистам Wnt. Таким образом, настоящее изобретение относится к использованию статуса мутации RNF43 в качестве метода отбора больных раком для терапевтического введения ингибиторов сигнального пути Wnt.

Ингибиторы Wnt могут быть использованы в фармацевтических композициях, применяемых для лечения людей или в ветеринарии в случаях, требующих ингибирования сигнального пути Wnt, например, при лечении опухолей или анормального роста клеток. Настоящее изобретение относится к способу лечения больного раком ингибитором Wnt, который включает введение ингибитора Wnt или фармацевтической композиции, включающей ингибитор Wnt, субъекту, у которого обнаружен биомеркер, указывающий на чувствительность к ингибитору Wnt. Например, полученный у субъекта образец может быть исследован методами секвенирования ДНК на наличие мутации RNF43 или мутации ZNRF3, свидетельствующей о чувствительности к ингибитору Wnt. Альтернативно полученный у субъекта образец может быть исследован в отношении уровня экспрессии гена RNF43, белка RNF43, гена ZNRF3, белка ZNRF3 или другого биомаркера, при этом уровень биомаркера у субъекта может быть статистически равен или меньше контрольного уровня биомаркера, коррелированного с чувствительностью к ингибитору Wnt, или уровень биомаркера в опухолевых клетках субъекта может быть статистически равен уровню биомаркера, коррелированному с чувствительностью к ингибитору Wnt. Контрольный уровень может быть нормальным или базовым уровнем биомаркера, уровнем биомаркера в образце здоровой клетки или ткани либо контрольный уровень биомаркера может быть коррелирован с устойчивостью к ингибитору Wnt.

Ингибитор Wnt или фармацевтическая композиция, включающая ингибитор Wnt, может быть использована при лечении субъекта, у которого уровень биомаркера коррелирован с чувствительностью к ингибитору Wnt. В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор Wnt или композиция, включающая ингибитор Wnt, предназначены для лечения больного раком.

ZNRF3 и RNF43 являются функциональными гомологами, и ZNRF3 также может быть мутирован в опухолях определенного типа. Таким образом, статус мутации ZNRF3 также является информативным для отбора больных раком для терапевтического введения антагонистов Wnt.

Один вариант осуществления изобретения относится к способу отбора больного раком, у которого согласно прогнозу может быть достигнут или не достигнут благоприятный эффект при терапевтическом введении ингибитора Wnt. Указанный способ включает следующие стадии:

(а) определение в образце опухолевых клеток, полученном у субъекта, уровня биомаркера, который может представлять собой (i) число обнаруженных копий ДНК в области хромосомы RNF43 или в области хромосомы ZNRF3, для определения утраты гетерозиготности, (ii) секвенированную геномную ДНК, кДНК или РНК из раковых тканей, используемую для обнаружения инактивирующей мутации в гене RNF43 или гене ZNRF3; (iii) результаты анализа по измерению экспрессии мРНК RNF43 или экспрессии мРНК ZNRF3; (iv) результаты анализа по измерению экспрессии белка RBF43 или экспрессии белка ZNRF3; (v) функциональный эффект утраты гена RNF43 или гена ZNRF3; (vi) комбинацию биомаркеров (i)-(v);

(b) сравнение уровня биомаркера в образце опухолевых клеток с контрольным уровнем биомаркера, выбираемым из группы, состоящей из: (i) контрольного уровня биомаркера, коррелированного с чувствительностью к ингибитору Wnt; и (ii) контрольного уровня биомаркера, коррелированного с устойчивостью к ингибитору Wnt; и

(с) отбор субъекта, у которого согласно прогнозу может быть достигнут благоприятный эффект от терапевтического введения ингибитора Wnt, если наличие в опухоли субъекта мутации RNF43 или ZNRF3 либо пониженной экспрессии мРНК или белка RNF43 или пониженной экспрессии мРНК или белка ZNRF3 свидетельствует о том, что опухоль субъекта, по-видимому, чувствительна к ингибитору Wnt.

Статус мутации гена RNF43 или гена ZNRF3 в опухолевых клетках может быть исследован любым из нижеследующих методов или при помощи комбинации указанных методов.

(i) Анализ числа копий ДНК в области RNF43 хромосомы 17 в геномном локусе 17q22 для определения утраты одной или обеих копий гена RNF43. Альтернативно может быть выполнен анализ числа копий ДНК в области ZNRF3 хромосомы 22 в геномном локусе 22q12.1 для определения утраты одной или обеих копий гена ZNRF3. Утрата гетерозиготности RNF43 или ZNRF3 является биомаркером опухолей, отбираемых для уменьшения скорости роста таких опухолей при помощи ингибитора Wnt.

(ii) Секвенирование геномной ДНК, кДНК или РНК из раковых тканей для обнаружения инактивирующей мутации в гене RNF43. Инактивирующая мутация RNF43 или ZNRF3 является биомаркером опухолей, отбираемых для уменьшения скорости роста таких опухолей при помощи ингибитора Wnt. Инактивирующая мутация может быть нонсенс-мутацией, мутацией со сдвигом рамки, сплайсирующим вариантом или миссенс-мутацией, вызывающей замену аминокислот в положении консервативных остатков.

(iii) Анализ экспрессии мРНК RNF43 или анализ экспрессии мРНК ZNRF3 методом Taqman или другими подобными методами. Нонсенс-мутации или мутации со сдвигом рамки в мРНК часто вызывают разрушение мРНК, опосредованное нонсенс-мутацией. Поэтому утрата экспрессии мРНК RNF43 в раковых клетках может быть использована в качестве вторичного или альтернативного анализа выявления нонсенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки RNF43. Отсутствие мРНК RNF43 может быть также результатом эпигенетического сайленсинга, но в данном случае отсутствует мутация в геномной ДНК.

(iv) Анализ функционального эффекта утраты гена RNF43 или гена ZNRF3, который определяют по повышенным уровням белка Frizzled, повышенным уровням белка LRP6, повышенному фосфорилированию LRP6 и повышенному фосфорилированию белка Disheveled в образцах опухоли по сравнению с нормальным контрольным образцом.

Преимущество использования статуса мутации гена RNF43 или гена ZNRF3 в качестве биомаркера опухолей, отбираемых для уменьшения скорости роста таких опухолей путем введения ингибитора Wnt, приобретает особенно важное значение при создании лекарственных средств.

Один вариант осуществления изобретения относится к анализу или набору для исследования статуса мутации гена RNF43 или гена ZNRF3. Указанный анализ или набор может быть сопутствующим диагностическим средством, используемым после признания ингибитора Wnt в качестве лекарственного средства.

Другой вариант осуществления изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей ингибитор Wnt, которая предназначена для лечения рака у субъекта, у которого уровень (вышеуказанного) биомаркера статистически равен или меньше контрольного уровня биомаркера, коррелированного с чувствительностью к ингибитору Wnt.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена фотография, на которой показаны анализы колониеобразования при обработке ингибитором LGK974. На фиг. 1(а) показан анализ колониеобразования клеток HPAFII в присутствии LGK974 в двух концентрациях (300 нМ и 1 мкМ). 1300 клеток высевали в среды, подвергнутые соответствующей обработке, которые меняли через каждые 5 дней до окрашивания кристаллическим фиолетовым на 14-й день. LGK974 ингибирует колониеобразование клеток HPAFII, содержащих нонсенс-мутацию в гене RNF43. На фиг. 1(b) показаны анализы колониеобразования клеток РК1 (содержащих функциональный белок RNF43) и клеток HPAFII (содержащих нефункциональных белок RNF43) в присутствии только 1 мкМ LGK974 или в сочетании с ежедневно добавляемой кондиционированной среды (СМ), содержащей 10% Wnt3a. Клетки РК1, содержащие RNF43 дикого типа, не проявили чувствительность к LGK974 в течение 10-дневного анализа. Клетки HPAFII, содержащие мутант RNF43, были ингибированы LGK974, при этом ингибирование было частично прекращено при добавлении экзогенного белка Wnt3a, поэтому ингибирование роста при помощи LGK974 зависело от сигнального пути Wnt.

На фиг. 2 изображена диаграмма, на которой показан сравнительный анализ белка RNF43 и белка ZNRF3 с целью выявления консервативных остатков. Указанная информация может быть использована для прогнозирования миссенс-мутаций, являющихся инактивирующими мутациями. Последовательность белка RNF43 человека представлена в SEQ ID NO:3, и последовательность белка ZNRF3 человека представлена в SEQ ID NO:4.

На фиг. 3 изображено несколько столбчатых диаграмм, показывающих отрицательную регуляцию сигнального пути Wnt при помощи RNF43 в раковых клетках поджелудочной железы YAPC, экспрессирующих RNF43 дикого типа. На фиг. 3(а) показано, что истощение RNF43 повышает активность Super TOPFlash (STF) в линии раковых клеток поджелудочной железы YAPC. Клетки YAPC-STF трансфицировали указанной миРНК в присутствии или отсутствии кондиционированной среды (СМ), содержащей Wnt3a, и измеряли активность репортерной люциферазы, используя STF. миРНК pGL2 является отрицательным контрольным образцом. На фиг. 3(b) показано, что повышение активности STF, индуцированное миРНК RNF43, зависит от эндогенного Wnt. Клетки YAPC-STF трансфицировали указанной миРНК и затем обрабатывали ДМСО или ингибитором поркупина LGK974. Затем измеряли активность репортера STF. На фиг. 3(с) показано, что истощение RNF43 увеличивает экспрессию AXIN2, гена-мишени β-катенина. Клетки YAPC, экспрессирующие пустой вектор (EV) или миРНК-устойчивый ген RNF43, трансфицировали указанной миРНК и определяли относительные уровни мРНК AXIN2 и RNF43 при помощи количественной ПЦР с обратной транскрипцией.

На фиг. 4 изображено несколько столбчатых диаграмм, показывающих изменение уровня мРНК для нескольких генов, относящихся к сигнальному пути Wnt/β-катенина. На фиг. 4(а) показано, что истощение β-катенина снижает уровень мРНК AXIN2 и RNF43. Клетки обрабатывали миРНК и анализировали относительные уровни мРНК указанных генов при помощи количественной ПЦР с обратной транскрипцией. На фиг. 4(b) показано, что ингибиторы поркупина уменьшают экспрессию мРНК RNF43 и мРНК AXIN2. Клетки YAPC обрабатывали 3 мкМ IWP2 или 1 мкМ LGK974 и исследовали экспрессию генов при помощи количественной ПЦР с обратной транскрипцией.

Подробное описание изобретения

Введение

Авторы настоящего изобретения обнаружили два отрицательных регулятора сигнального пути Wnt, цинкосодержащий пальцеобразный белок 3 (ZNRF3, Swiss-Prot Q9ULT6, SEQ ID NO:4) и пальцеобразный белок 43 (RNF43, Swiss-Prot Q68DV7, SEQ ID NO:3). Hao HX et al. (2012) Nature 485(7397): 195-200. RNF43, пальцеобразный белок, ассоциированный с раком, является убиквитин-лигазой, которая взаимодействует с ядерным белком НАР95. Sugiura T et al. (2008) Exp. Cell Res. 314(7): 1519-28. ZNRF3 и RNF43 являются гомологичными трансмембранными убиквитин-лигазами Е3 на поверхности клетки для рецептора Frizzled Wnt. Оба белка снижают уровни комплекса рецепторов Wnt на поверхности клетки, состоящего из рецепторов Frizzled и LRP6.

Авторы настоящего изобретения также показали, что транскрипция ZNRF3 индуцируется в результате активации сигнального пути Wnt. Сверхэкспрессия ZNRF3 снижала активность сигнального пути Wnt, в то время как миРНК ZNRF3 или доминантный отрицательный ZNRF3 сильно повышал активность сигнального пути Wnt. Фосфорилирование LRP6 увеличивалось при ингибировании ZNRF3, из чего следует, что ZNRF3 действует в верхней области сигнального пути Wnt. Поэтому ZNRF3 регулирует реакцию клетки на стимуляцию лигандом Wnt. Данное наблюдение было подтверждено в клеточных системах при выполнении экспериментов in vivo с использованием брахиданио-рерио и мышей с отсутствием гена. Также было установлено, что RNF43 является функциональным гомологом ZNRF3 и регулирует передачу сигналов Wnt.

RNF43 и опухоли поджелудочной железы

Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) является наиболее распространенной формой рака поджелудочной железы. PDAC является чрезвычайно агрессивной и ассоциирована с неутешительным прогнозом. Matthaei H et al. (2011) Ann. Surg. Oncol. 18(12): 3493-9; Luebke AM et al. (2012) Pancreatology 12(1): 16-22; Hezel AF (2006) Genes Dev. 20(10). Предшественниками PDAC считаются интраэпителиальная эндоплазия поджелудочной железы (PanIN), внутрипроточная папиллярная слизеобразующая неоплазма (IPMN) и слизеобразующая кистозная неоплазия (MCN). Несмотря на взаимосвязь с протоками PDAC не обязательно возникает в протоках.

Сигнальный путь Wnt/β-катенина динамически регулируется в процессе развития поджелудочной железы и необходим для развития поджелудочной железы. Wells JM (2007) BMC Dev. Biol. 7:4. Ингибирование сигнального пути Wnt/β-катенина нарушает развитие ацинарных клеток, но не островка поджелудочной железы. Индуцибельная экспрессия стабилизированного β-катенина в поджелудочной железе взрослых мышей увеличивает пролиферацию зрелых экзокринных клеток при минимальном воздействии на клетки островка. Heiser PW et al. (2006) Development 133(10): 2023-32. Имеющиеся данные показывают, что активация сигнального пути Wnt может способствовать сохранению и/или развитию PDAC. Morris JP et al. (2010) Nat. Rev. Cancer 10(10): 683-95. Накопление β-катенина в ядре или цитоплазме отмечено в ряде PDAC (Pasca di Magliano M et al. (2007) PLoS One 2(11): e1155), что указывает на активацию сигнального пути. Уровень цитозольного и ядерного β-катенина положительно коррелирован со степенью PanIN и развитием PDAC (Wang L et al. (2009) Cancer Sci. 101(3): 700-6), поэтому передача сигналов β-катенином стимулирует развитие PDAC. Истощение β-катенина уменьшает пролиферацию клеток PDAC, что свидетельствует о важном значении β-катенина в сохранении трансформирующего фенотипа.

RNF43 часто мутирует в IMPN и MCN (Furukawa T et al. (2011) Sci. Rep. 1: 161; Wu J et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(52): 21188-93). IPMN и MCN являются предшественниками инвазивной аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDAC).

В данной области известна последовательность RNF43 человека. Непроцессированную кДНК RNF43 человека (NM_017763.4) можно приобрести в коммерческих источниках (например, Open Biosystems, Glastonbury, CT, USA 06033). Для получения дополнительной информации, относящейся к RNF43, см. патент США № 7425612. Полипептид ТАТ179 идентичен внеклеточной области RNF43, расположенной после сигнального пептида. См. международную заявку на патент WO 2003/024392, на основании которой в Европе был выдан патент ЕР 1487877 В1.

Недавно было предложено использовать RNF43 в качестве супрессора кистозных опухолей поджелудочной железы. Wu J et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108: 2188. В исследовании по секвенированию полного экзона было установлено, что 6 из 8 внутрипроточных папиллярных слизеобразующих неоплазм (IPMN) и 3 из 8 слизеобразующих кистозных неоплазм (MCN) содержат инактивирующие мутации RNF43. Преобладание инактивирующих мутаций в RNF43 и утрата гетерозиготности (LOH) его локуса делает возможным использование RNF43 в качестве супрессора как в IPMN, так и в MCN. В публикации Wu et al. отсутствует функциональное исследование RNF43.

Не так давно было установлено, что специфичная для кишечника делеция Znrf3 и Rnf43 индуцирует сверхпролиферацию кишечных крипт и образование кишечной аденомы у мышей. Koo BK et al. (2012) Nature 488(7413): 665-9. Кроме того, мутации RNF43 были обнаружены в разных опухолях, в том числе в кистозных опухолях поджелудочной железы. Указанные исследования показывают, что RNF43 действует в качестве отрицательного регулятора сигнального пути Wnt/β-катенина подобно ZNRF3.

Однако до сих пор не идентифицирована клеточная система, важным элементом которой является RNF43, поэтому функциональное исследование RNF43 in vitro было невозможно. Таким образом, физиологическая принадлежность мутации RNF43 в раке ранее была неизвестна.

Сигнальный путь Wnt/β-катенина

Сохранившийся в процессе эволюции сигнальный путь Wnt/β-катенина имеет важное значение для развития эмбриона и тканевого гомеостаза у взрослых. Logan CY and Nusse R (2004) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20: 781-810; Clevers H (2006) Cell 127(3): 469-80. Сигнальный путь Wnt регулирует преобразование кофактора транскрипции β-катенина и контролирует основные программы экспрессии генов в процессе развития. MacDonald BT et al. (2009) Dev. Cell. 17(1): 9-26. При отсутствии активации сигнального пути Wnt цитозольный 4-катенин ассоциирован с деструктивным комплексом β-катенина, который содержит много белков, в том числе белок аденоматозного полипоза кишечника (АРС), AXIN и протеинкиназу 3α/β (GSK3α/β). В указанном комплексе β-катенин конститутивно фосфорилирован GSK3, при этом фосфорилированный β-катенин разрушается под воздействием сигнального пути протеасомы убиквитина. Сигнал Wnt, принимаемый двумя рецепторами, белком Frizzled и LRP5/6, вызывает диссоциацию деструктивного комплекса β-катенина. Стабилизированный β-катенин проникает в ядро, связывается с семейством TCF факторов транскрипции и включает транскрипцию.

Аберрантная активация сигнального пути Wnt/β-катенина является причиной онкогенеза, при этом многие компоненты нижней области сигнального пути Wnt мутируют в раки. Процессирующие мутации АРС обнаружены в 80% колоректального рака. В разных раках также обнаружены стабилизирующие мутации β-катенина и утрата функциональных мутаций AXIN1/2. Несмотря на интенсивные исследования направленное воздействие сигналов β-катенина в раках, содержащих мутацию в нижней области сигнального пути, до сих пор не установлено из-за отсутствия прослеживаемых мишеней. С другой стороны, существует несколько прослеживаемых мишеней в верхней области сигнального пути Wnt. Созданы разные агенты, направленно воздействующие на верхнюю область сигнального пути Wnt, в том числе антитело против LRP6 (Ettenberg S et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 (35): 15473-8), антитело против белка Frizzled (Gurney A et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(29): 11717-22) и ингибитор поркупина (Chen B et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5(2): 100-7). Однако клиническая разработка указанных агентов ранее была затруднена, так как указанные молекулы не ингибируют передачу сигналов β-катенина в опухолях, имеющих мутацию в нижней области, поэтому было трудно идентифицировать опухоли человека, принимающие индуцируемые лигандами сигналы Wnt/β-катенина.

Определения терминов

“Рак” в соответствии с описанием, приведенным в патенте США № 8093011 и патенте США № 8093011 (которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки), является общим названием целого ряда злокачественных новообразований клеток, характеризующихся нерегулируемым ростом, отсутствием дифференцировки и способностью проникать в ткани и метастазировать. Указанные злокачественные новообразования поражают с разной степенью распространения все ткани и органы тела. Таким образом, термин ”рак” в использованном здесь значении означает наличие клеток, обладающих характеристиками, типичными для вызывающих рак клеток, такими как неконтролируемая пролиферация, иммортализация, метастазирование, быстрый рост и пролиферация, а также определенными типичными морфологическими признаками. Раковые клетки часто имеют форму опухоли, но такие клетки могут существовать отдельно или могут циркулировать в кровеносной системе в виде независимых клеток, таких как лейкозные клетки.

Термин ”анормальный рост клеток” означает рост клеток, не зависящий от нормальных регуляторных механизмов (например, утрата контактного ингибирования). В определение данного термина входит анормальный рост: (1) опухолевых клеток (опухолей), которые пролиферируют в результате сверхактивности сигнального пути Wnt в клетке; (2) доброкачественных и злокачественных клеток других пролиферативных заболеваний, при которых в клетке имеет место аберрантная сверхактивность сигнального пути Wnt; (4) любых опухолей, которые пролиферируют в результате сверхактивности сигнального пути Wnt в клетке; (5) любых опухолей, которые пролиферируют в результате сверхактивности сигнального пути Wnt в клетке; и (6) доброкачественных и злокачественных клеток других пролиферативных заболеваний, в которых имеет место аберрантная сверхактивность сигнального пути Wnt.

“Биомаркер” представляет собой нечто, что может быть использовано в качестве индикатора конкретного заболевания или какого-либо другого физиологического состояния организма, такого как человек. Биомаркером может быть наличие гена, аллеля гена, измерение экспрессии гена, белок, функциональный эффект активности белка, который может быть измерен и коррелирован с физиологическим состоянием. Биомаркеры используют в медицине в качестве лабораторных параметров, которые могут помочь лечащему врачу принять решение о диагнозе и выборе курса лечения.

Термин ”утрата гетерозиготности” (LOH) означает делецию генетического материала (ДНК), который подвержен почти всем разновидностям рака по сравнению с нормальными клетками. См. патент США № 7718364 (который полностью включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки). Утрата генетического материала из раковых клеток может привести к избирательной утрате одного из двух или более аллелей гена в определенном локусе хромосомы, где ген может влиять на рост клеток. Вследствие генетической гетерогенности или полиморфизма ДНК многие спаренные аллели генов отличаются друг от друга. При наличии двух идентичных аллелей субъект считается гомозиготным в отношении данной пары аллелей в данном определенном локусе. Альтернативно при наличии двух разных аллелей субъект является гетерозиготным в данном локусе. Оба аллеля обычно транскрибируются и в конечном счете транслируются или в идентичные белки в случае гомозиготности, или в разные белки в случае гетерозиготности. В случае утраты одной из пар гетерозиготных аллелей вследствие делеции ДНК из одной из спаренных хромосом, будет экспрессирован только оставшийся аллель и указанные клетки становятся функционально гомозиготными. Такая ситуация именуется ”утратой гетерозиготности” (LOH) или переходом к гомозиготности. Благодаря использованию ДНК-зондов ДНК из нормальных клеток субъекта можно сравнить с ДНК, экстрагированной из опухолевых клеток того же субъекта и идентифицировать LOH при помощи экспериментальных методов, хорошо известных в данной области. Альтернативно LOH можно исследовать, демонстрируя две полиморфные формы белка в нормальных гетерозиготных клетках и только одну форму в раковых клетках, где произошла делеция аллеля. См., например, публикацию Lasko et al. (1991) Annu. Rev. Genet. 25: 281-314. Частая утрата гетерозиготности в определенных областях хромосомы была обнаружена во многих типах злокачественных новообразований, что указывает на существование предполагаемых генов-супрессоров опухоли или опухолевых генов в указанных локусах или рядом с ними. Таким образом, анализ LOH является мощным инструментом поиска гена-супрессора опухоли путем сужения и идентификации области, в которой находится предполагаемый ген. См. публикации Vogelstein et al. (1988) New Engl. J. Med. 319(9): 525-532; Fearon et al. (1990) Cell 61: 759-767; и Friend et al., Nature 323: 643-646 (1986). В результате выполнения анализов были идентифицированы многие типы предполагаемых генов-супрессоров опухолей или опухолевых генов. См. публикации Call et al. (1990) Cell 60: 509-520; Kinzler et al. (1991) Science 253: 661-665; и Baker et al. (1989) Science 244: 217-221.

Мутация ”утраты функции” (LOF) является мутацией аллеля или гена, в результате которой функция генного продукта (такого как кодированный белок) становится более слабой по сравнению с нормальной функцией или полностью отсутствует в клетке или организме (включая человеческую клетку или самого человека). Мутация, при которой аллель полностью утрачивает функцию (нулевой аллель), часто именуется аморфной мутацией. Фенотипы, ассоциированные с мутациями утраты функции, часто являются рецессивными.

“Замена” представляет собой мутацию, при которой одно основание заменяется другим основанием (то есть изменение однобуквенного ”химического кода”, например, замена буквы А буквой G). Такая замена может быть (1) заменой кодона другим кодоном, кодирующим другую аминокислоту и вызывающим небольшое изменение продуцируемого белка (например, серповидно-клеточную анемию вызывает замена в гене бета-гемоглобина, в результате которой изменяется одна аминокислота в продуцируемом белке; (2) заменой кодона другим кодоном, кодирующим такую же аминокислоту и не вызывающим изменения продуцируемого белка (“молчащие мутации”); или (3) заменой кодона, кодирующего аминокислоту, одним ”терминирующим” кодоном, в результате чего образуется неполный белок (неполный белок обычно является нефункциональным).

“Инсерция” представляет собой мутацию, при которой в ДНК вводятся дополнительные пары оснований.

”Делеция” представляет собой мутацию, при которой утрачивается или удаляется участок ДНК.

“Сдвиг рамки считывания” представляет собой мутацию, вызванную инсерциями или делециями нуклеотидов, число которых не делится на три в последовательности ДНК. Вследствие экспрессии генов кодонами в виде триплетов инсерция или делеция может изменить рамку считывания (группировку кодонов), в результате чего полностью изменится трансляция по сравнению с исходной последовательностью. Такая мутация часто вызывает образование усеченных белков и утрату функции.

“Секвенирование Сангера” (получившее название по имени изобретателя Фредерика Сангера) является методом секвенирования полинуклеотидов с терминатором цепи. Особенностью метода секвенирования Сангера является использование трифосфатов дидезоксинуклеотидов (ddNTP) в качестве терминаторов цепи ДНК. Метод секвенирования Сангера часто является автоматизированным методом.

Методы ”секвенирования следующего поколения” представляют собой группу недавно разработанных высокопроизводительных методов секвенирования, при выполнении которых производится одновременное сравнение тысяч или миллионов последовательностей. Методика получения большого количества данных в сочетании с низкими затратами на получение указанных данных была признана специалистами в данной области универсальным инструментом.

Термин ”лечение” в использованном здесь значении, за исключением особо оговоренных случаев, означает реверсию, уменьшение, ингибирование развития или частичное или полное предотвращение роста опухолей, опухолевых метастазов или других вызывающих рак или неопластических клеток у субъекта. Термин ”лечение” в использованном здесь значении, за исключением особо оговоренных случаев, означает процесс лечения.

Фраза ”метод лечения” или ее эквивалент применительно к лечению рака означает процедуру или действие, направленное на уменьшение числа или устранение раковых клеток или ослабление симптомов рака. “Метод лечения” рака или другого пролиферативного заболевания необязательно означает, что раковые клетки или другие неупорядоченные клетки действительно будут уничтожены, что число клеток действительно сократится или симптомы рака или другого нарушения будут действительно ослаблены. Метод лечения рака часто применяется даже при низкой вероятности успеха, но с учетом истории болезни и предполагаемой продолжительности жизни тем не менее считается благоприятным действием.

Термин ”терапевтически эффективный агент” означает композицию, которая вызывает биологическую или медицинскую реакцию ткани, системы, животного или человека, ожидаемую исследователем, ветеринаром, лечащим врачом или другим клиницистом.

Термин ”терапевтически эффективное количество” или “эффективное количество” означает количество соединения или комбинации, которое вызывает биологическую или медицинскую реакцию ткани, системы, животного или человека, ожидаемую исследователем, ветеринаром, лечащим врачом или другим клиницистом.

“Ингибитор” является соединением, которое ингибирует (например, оказывает антагонистическое воздействие, уменьшает, снижает, блокирует, реверсирует или изменяет) действие природного или контрольного соединения, описанного выше. Такие ингибиторы могут включать любое соединение, белок, пептид, нуклеиновую кислоту (включая рибозимы и антисмысловые нуклеиновые кислоты) или продукт создания или отбора лекарственного средства/соединения/пептида, который оказывает антагонистическое действие.

“Выделенный” полинуклеотид или молекула выделенной нуклеиновой кислоты является молекулой нуклеиновой кислоты, которая была удалена из естественного окружения (то есть была подвергнута манипуляциям человека), при этом естественным окружением такой молекулы является геном или хромосома, где молекула нуклеиновой кислоты находится в природе. В указанном значении термин ”выделенный” необязательно отражает степень очистки молекулы нуклеиновой кислоты, но показывает, что указанная молекула не включает весь геном или всю хромосому, где молекула нуклеиновой кислоты находится в природе. Полинуклеотиды, используемые в способе по настоящему изобретению для обнаружения генов (например, путем гибридизации с геном), обычно представляют собой часть гена-мишени, пригодную для использования в качестве гибридизирующего зонда или затравки для ПЦР с целью идентификации непроцессированного гена (или его части) в данном образце (например, образце клеток). Молекула выделенной нуклеиновой кислоты может включать ген или часть гена (например, регуляторную область или промотор). Молекула выделенной нуклеиновой кислоты, включающая ген, не является фрагментом хромосомы, включающей такой ген, а скорее содержит кодирующую область и регуляторные области, ассоциированные с данным геном, но не дополнительные гены, присутствующие в той же хромосоме в естественных условиях. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты может также включать последовательность нуклеиновой кислоты, фланкированную (то есть в положении 5ʹ-конца, 3ʹ-конца или обоих концов последовательности) дополнительными нуклеиновыми кислотами, которые обычно не фланкируют данную последовательность нуклеиновой кислоты в природе (то есть гетерологичные последовательности). Молекула выделенной нуклеиновой кислоты может включать ДНК, РНК (например, мРНК) или производные ДНК или РНК (например, кДНК). Хотя фраза ”молекула нуклеиновой кислоты” прежде всего означает физическую молекулу нуклеиновой кислоты и фраза “последовательность нуклеиновой кислоты” прежде всего означает последовательность нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты, обе фразы могут быть использованы взаимозаменяемо, особенно применительно к молекуле нуклеиновой кислоты или последовательности нуклеиновой кислоты, способной кодировать белок. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты может быть получена методами рекомбинантных ДНК (например, путем амплификации при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), клонирования) или химического синтеза.

“Зонд” (олигонуклеотидный зонд) является молекулой нуклеиновой кислоты, длина которой обычно находится в диапазоне от около 50-100 нуклеотидов до