Усовершенствованные способы выделения рекобинантных белков

Усовершенствованные способы выделения рекобинантных белков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США 61/616297, поданной 27 марта 2012, которая включена в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам культивирования рекомбинантных белков в прокариотических клетках-хозяевах.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Масштабная экономически эффективная очистка белков необходима для получения конкурентоспособных биотехнологических продуктов. Как правило, белки получают путем культивирования клеток с использованием либо клеточных линий млекопитающих, либо бактериальных клеточных линий, созданных для получения интересующего белка путем вставки рекомбинантной плазмиды, содержащей ген этого белка. Поскольку используемые клеточные линии являются живыми организмами, их культивируют в сложной среде сложного состава, которая, как правило, содержит смесь солей, сахаров, аминокислот, витаминов, микроэлементов и пептоны. Отделение желаемого белка от смеси соединений, в которых культивируют клетки, и от побочных продуктов самих клеток, с чистотой, достаточной для использования в качестве лекарства для человека, представляет собой сложную задачу.

Рекомбинантные терапевтические белки, как правило, производят в нескольких линиях клеток-хозяев, в том числе клетках-хозяевах млекопитающих, таких как, например, клетки мышиной миеломы NS0 и клетки яичника китайского хомячка (СНО), (Anderson, D.С and Krummen, L. (2002) Curr. Opin. Biotech. 13: 117-123; Chu, L. and Robinson, D.K. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 180-187), и бактериальных клетках-хозяевах, в том числе в клетках Escherichia coli (E. coli). Каждая линия клеток имеет свои преимущества и недостатки с точки зрения производительности и характеристик белков, продуцируемых клетками. Escherichia coli наиболее широко используется для крупномасштабного получения терапевтических белков, которые не требуют сложного гликозилирования для биологической активности. Гетерологичные белки, экспрессируемые в Е. coli, могут накапливаться как растворимый продукт или в виде нерастворимых агрегатов. Как правило, чтобы выделить белки, клетки могут быть подвергнуты обработке для извлечения белка из периплазматического пространства, или клетки могут быть лизированы, чтобы выделить внутриклеточные продукты, которые в противном случае недоступны. Достижения методов ферментации и культивирования клеток значительно увеличили выходы целевых рекомбинантных белков.

Выбор клеточных линий для коммерческого получения часто определяется балансом между потребностью в высокой производительности и возможностью обеспечения характеристик качества, необходимых для данного продукта. По текущим правилам организации производства и контроля качества процедур культивирования, качество контролируется на протяжении всего процесса, гарантируя, что продукт удовлетворяет требованиям регулирующих инстанций с точки зрения безопасности, идентичности продукта, качества и чистоты. Тем не менее, время от времени возникают проблемы, когда данный продукт не соответствует его техническим характеристикам. Задача состоит в том, чтобы разработать надежный процесс, в котором идентифицирована и выделена проблема, затем минимизировать проблему таким образом, что процесс может поддерживаться в пределах установленных диапазонов параметров, и убедиться, что процесс воспроизводимо дает продукцию, отвечающую требованиям технических характеристик продукта. В данной области существует потребность в уменьшении или устранении частоты получения продуктов, которые не соответствуют техническим характеристикам.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка в условиях, где уровень растворенного кислорода (dO₂) превышает 0%, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до отфильтрованного препарата для хранения (FBS), где указанный отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и 1,4-дигидрокси-2-нафтоата (DHNA) по данным ионообменной хроматографии (IEC) при 310 нм. В одном варианте осуществления в способе, описанном выше, аналитическим анализом является метод HPLC, RP HPLC, HIC HPLC, ЯМР, масс-спектрометрии или УФ-спектроскопии.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение указанного рекомбинантного белка в условиях, где уровень dO₂ превышает 0%, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где рекомбинантный белок представляет собой рекомбинантный полипептид или выделенное антитело.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка в условиях, где уровень dO₂ превышает 0%, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где культивирование не зависит от масштаба культивирования.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка в условиях, где уровень dO₂ превышает 0%, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где прокариотической клеткой-хозяином является Escherichia coli (Е. coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla и Paracoccus. Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка в условиях, где уровень dO₂ превышает 0%, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где dO₂ поддерживается на уровне превышает 0%, непрерывно в ходе процедуры выделения стадии (б). В одном варианте осуществления изобретения в способе, описанном выше, процедуры выделения включают стадию гомогенизации. В другом варианте осуществления dO₂ поддерживают на уровне от примерно 30% до примерно 75% до гомогенизации. В еще одном варианте осуществления dO₂ поддерживают на уровне более 75% до гомогенизации. В еще одном варианте осуществления dO₂ поддерживают на уровне примерно 50% после гомогенизации. В другом варианте осуществления dO₂ поддерживают на уровне более 50% после гомогенизации. В одном варианте осуществления уровень dO₂ поддерживают в течение периода, больше или равного 1,5 часам. В еще одном варианте осуществления dO₂ поддерживают в течение периода, больше или равного 2 часам.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного белка, включающему (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина, где прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка в условиях, где уровень dO₂ превышает 0%, и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где dO₂ поддерживают с использованием нагнетаемого в пространство над средой воздуха или барботажного воздуха, увеличением противодавления или с помощью перемешивания (т.е. смешивания). В одном варианте осуществления количество нагнетаемого в пространство над средой воздуха составляет от примерно 0,4 до примерно 0,8 vvm. В другом варианте осуществления количество нагнетаемого в пространство над средой воздуха ориентировано на 0,6 vvm (объемов воздуха на объем жидкой среды в минуту). В другом варианте осуществления увеличенное противодавление составляет от примерно 1,0 до примерно 30 фунтов на квадратный дюйм. В одном варианте осуществления увеличенное противодавление ориентировано на 19 фунтов на квадратный дюйм. В еще одном варианте осуществления скорость перемешивания составляет от примерно 6 Вт/л до примерно 8 Вт/л. В еще одном варианте осуществления скорость перемешивания составляет, по меньшей мере, 6 Вт/л. В другом варианте осуществления скорость перемешивания ориентирована на 6 Вт/л.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка, включающий (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина с делецией гена menE, где указанная прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, (б) выделение рекомбинантного белка и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм. В еще одном варианте осуществления способа, описанного выше, выход рекомбинантного белка увеличен примерно на 20% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на 50% или более, примерно на 60% или более по сравнению с выходом при использовании контрольной прокариотической клетки-хозяина.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка, включающий (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина с делецией гена menE, где указанная прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где выход рекомбинантного белка увеличен примерно на 20% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на 50% или более, примерно на 60% или более по сравнению с выходом при использовании контрольной прокариотической клетки-хозяина, где культивирование не зависит от масштаба культивирования.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка, включающий (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина с делецией гена menE, где указанная прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где выход рекомбинантного белка увеличен примерно на 20% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на 50% или более, примерно на 60% или более по сравнению с выходом с использованием контрольной прокариотической клетки-хозяина, где указанный рекомбинантный белок является полипептидом или выделенным антителом.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения рекомбинантного белка, включающий (а) культивирование прокариотической клетки-хозяина с делецией гена menE, где указанная прокариотическая клетка-хозяин трансформирована нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный рекомбинантный белок, и (б) выделение рекомбинантного белка и (в) очистку указанного рекомбинантного белка до FBS, где отфильтрованный препарат не содержит детектируемых количеств аддукта рекомбинантного белка и DHNA по данным анализа IEC при 310 нм, где выход рекомбинантного белка увеличен примерно на 20% или более, примерно на 30% или более, примерно на 40% или более, примерно на 50% или более, примерно на 60% или более по сравнению с выходом с использованием контрольной прокариотической клетки-хозяина, где указанной прокариотической клеткой-хозяином является Escherichia coli (Е. coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla и Paracoccus.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 показаны результаты анализа прозрачности, опалесценции и окраски (анализ СОС) для трех партий, где две партии, партия 2 и партия 3, не соответствовали ожидаемым результатам анализа СОС. PW = очищенная вода, С = контроль опытной партии, 1 = партия 1, 2 = партия 2 и 3 = партия 3.

Фигура 2А показывает спектр поглощения в УФ/видимом спектре (10 см) - ближний УФ для партий 1-3. Новые пики поглощения, которых не наблюдали для партии 1, наблюдали примерно при 320 нм и при 460 нм. Фигура 2В показывает УФ/видимый спектр для партии 3 после вычитания спектра партии 1, где можно видеть разницу пиков поглощения партий 2 и 3 и партии 1.

На Фигуре 3 показан анализ IEC при 310 нм для партий 1-3. Небольшой пик-плечо позади главного пика наблюдали в партиях 2 и 3, в то время как профиль для партии 1 сопоставим со стандартным материалом.

Фигура 4 показывает результаты анализа 2D LC-MS интактных партий 1-3 с детекцией при 280 нм и 310 нм. Для партии 1 наблюдали расчетную массу, в то время как для партий 2 и 3 наблюдали ожидаемую массу и дополнительную массу в 157 дальтон.

Фигура 5 демонстрирует 2D-LC-MS и масс-идентификацию триптической пептидной карты с MS детекцией собранной фракции коричневого аддукта (собирали минорные пики из анализа IEC). В анализе 2D LC-MS в дополнение к ожидаемой массе наблюдали массу +156 Да для выделенного пика плеча.

Фигура 6 показывает анализ LC-MS-MS нового пика коричневого аддукта, наблюдаемого на 48,8 минуте при 310 нм, который определили как пептид Т20, в котором Cys182 модифицирован фрагментом с массой 154,006 дальтон. Модифицированные (по цистеину, +154,006 Да) и свободные пептиды Т6 и Т16 также были обнаружены при разделении масс.

Фигура 7 сравнивает данные HSQC 1H-15N продукта и синтетического пептида (NH₂-IVQCR-COOH) и показывает, что в образце продукта отсутствовала корреляция Cys NH.

На Фигуре 8 показаны данные, позволяющие предположить структуру, подтверждаемую сильным nOe, наблюдаемым между СН Cys и NH аргинина.

На основании объединенных данных ЯМР предлагаемая структура коричневого аддукта представлена на Фигуре 9.

На Фигуре 10 показан путь биосинтеза менахинонов в клетках прокариот.

На Фигуре 11 показан репрезентативный пример отфильтрованного препарата рекомбинантного продукта, проверенный на формирование коричневого аддукта с помощью ионообменной хроматографии при 310 нм, и не показавший измеримого количества аддукта.

На Фигуре 12 показан пример схемы усовершенствованного процесса Hi-dO, реализуемого при процедурах выделения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не указано иное, следующие термины и фразы, используемые здесь, имеют следующие значения.

Термин «скорость перемешивания» означает перемешивание жидкости для культивирования или гомогената, которое, как правило, измеряют в оборотах в минуту (RPM). В одном варианте осуществления скорость перемешивания может быть измерена в «мощности на единицу объема». Например, при 200 оборотах в минуту в 1000-литровом ферментере скорость перемешивания составляет примерно 6 Вт/л.

Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле, и, в частности, охватывает моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.

Антитела могут быть мышиными, человеческими, гуманизированными, химерными или полученными из других видов. Термин «антитело», используемый в настоящем документе, относится также к полноразмерной молекуле иммуноглобулина или к иммунологически активной части полноразмерной молекулы иммуноглобулина, то есть к молекуле, которая содержит антигенсвязывающий сайт, который иммуноспецифически связывается с антигеном интересующей мишени, или его часть, такие мишени включают, но не ограничиваются ими, раковые клетки или клетки, которые продуцируют антитела, связанные с аутоиммунным заболеванием. Иммуноглобулины, описанные здесь, могут относится к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу молекул иммуноглобулинов. Иммуноглобулины могут быть получены из любых видов. В одном аспекте, однако, иммуноглобулин происходит из человека, мыши или кролика.

«Фрагменты антител» включают часть полноразмерного антитела, как правило, связывающую антиген часть или вариабельные области антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; фрагменты, полученные с помощью экспрессионной библиотеки Fab, антиидиотипические (анти-Id) антитела, CDR (участки, определяющие комплементарность), связывающие ECD (внеклеточный домен) и связывающие эпитоп фрагменты любых вышеупомянутых молекул, которые иммуноспецифически связываются с антигеном раковых клеток, вирусным антигеном или микробным антигеном, молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные фрагментами.

«Анализ прозрачности, опалесценции и окраски» (СОС) проводят с использованием идентичных пробирок из бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла с плоским основанием и внутренним диаметром 15-25 мм, где сравниваемые жидкости должны быть рассмотрены вместе со свежеполученной контрольной суспензией, приготовленной так, как описано ниже, глубина слоя должна составлять 40 мм. Для надлежащей оценки цвета могут быть использованы стандартные окрашенные растворы, перечисленные в фармакопее США 2012 (USP Monograph 631, Color and Achromicity) или в Европейской Фармакопее 5.0 (ЕР Method 2.2.2, Degree of Coloration of Liquids).

Термин «1,4-дигидрокси-2-нафтоат» (DHNA) означает химический продукт, полученный из клеток E. coli. Okada Y, Tsuzuki Y, Miyazaki J, Matsuzaki K, Hokari R, Komoto S, et al. (2006) Gut 55: 681-8. DHNA является промежуточным продуктом в пути биосинтеза менахинона (МК), также известного как витамин К2, в клетках E. coli. Neidhardt, F.C. (2010) Escherichia coli and Salmonella (версия он-лайн: Module 3.2.2 pgs. 36-37); Inledew, W.J. & R.K. Poole (1984) The respiratory chains of Escherichia coli. Microbiological reviews. 48: 222-271; Nowicka, B. & J. Cruk (2010) Occurrence, Biosynthesis and Function of Isoprenoid Quinones. Biochimica et Biophysica Acta 1797: 1587-1605.

Термин «содержание растворенного кислорода» (dO₂) представляет собой относительное измерение количества кислорода, который растворен или содержится в данной среде. Оно может быть измерено с помощью растворимого сенсора кислорода, такого как сенсор кислорода в жидких средах.

Термин «культивирование» или «ферментация», используемый в настоящем документе, означает процесс выращивания прокариотических клеток-хозяев, которые были трансформированы для получения интересующего рекомбинантного белка

Термин «отфильтрованный препарат» или «вещество отфильтрованного препарата» (FBS) означает продукт интересующего рекомбинантного белка после выделения и очистки, где белок был высвобожден из клетки-хозяина, центрифугирован и/или отфильтрован для удаления клеточного дебриса, далее очищен на подходящих хроматографических колонках, а затем сконцентрирован путем процесса фильтрации. Термин «собранная жидкость для культивирования», также обозначенный как HCCF, означает жидкость для культивирования прокариотических или эукариотических клеток, из которой эти клетки были удалены, в том числе путем центрифугирования или фильтрации. Культивирование клеток является процессом, при котором либо прокариотические, либо эукариотические клетки выращивают в контролируемых условиях. Термин «культура клеток» относится к культивированию клеток, полученных из многоклеточных эукариот, в том числе клеток животных, или одноклеточных прокариот, в том числе бактерий и дрожжей. Культуры эукариотических клеток включают клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка, гибридомы и клетки насекомых. При использовании подходящей емкости для культивирования клеток, секретируемые белки могут быть получены из клеток прикрепленных клеточных линий или суспензионных клеточных линий. Культуры клеток млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки Ns0.

Термин «процедуры выделения» или «выделение» означает, без ограничения, процесс, включающий лизис или гомогенизацию, а затем центрифугирование и/или фильтрацию культивируемой культуры прокариотических клеток-хозяев, которые были трансформированы для получения интересующего рекомбинантного белка, чтобы начать выделение и очистку указанного интересующего белка.

Термин «Hi-dO», используемый в настоящем документе, относится к улучшенным способам, описанным в настоящем документе, и заключается в поддержании уровня растворенного кислорода более 0% в ходе процедур выделения. Для достижения этой цели настоящее изобретение включает сочетание нагнетаемого в пространство над средой воздуха, противодавления и скорости перемешивания, которые могут использоваться для поддержания dO₂ на уровне или выше заданного значения, то есть выше 0%, или от примерно 30% до примерно 75%, или на уровне более 75%, или примерно 50%, или на уровне более 50%. В другом варианте осуществления специалист в данной области техники может также использовать барботирование воздухом или чистым кислородом среды непосредственно для достижения уровня растворенного кислорода Hi-dO, превышающего 0%.

Термин «гомогенизация», используемый в настоящем документе, означает процесс лизиса или механического лизиса прокариотических клеток-хозяев, трансформированных нуклеиновой кислотой, кодирующей интересующий рекомбинантный белок, чтобы высвободить указанный белок из клетки-хозяина. Термин «увеличение противодавления» используется для обозначения увеличения скорости переноса кислорода через среду для культивирования. Противодавление, как правило, измеряется либо в фунтах на квадратный дюйм, либо в барах.

«Менахиноны» (МК) являются гомологами витамина К2 и выполняют функцию молекул переносчиков электронов в дыхательной цепи между связанными с мембраной белковыми комплексами в микро-аэробных и/или анаэробных условиях. Термин «menE» означает ген в пути биосинтеза менахинонов.

Термин «культивирование микроорганизмов» означает культуру клеток бактерий или дрожжей, которые были изменены с помощью генной инженерии для получения белков и низкомолекулярных соединений (например, вторичных метаболитов). Культивирование используется для размножения рекомбинантных бактерий и дрожжей, а также других микроорганизмов, и образования целевых белков. Производительность и рост клеток этих организмов оптимизируют путем подачи конкретных питательных сред и контроля различных факторов окружающей среды (например, pH, температура и аэрация). Жидкость после культивирования бактерий может быть получена из культуры E. coli.

Термин «моноклональное антитело», используемый в настоящем документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфичными, направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что они могут быть синтезированы без загрязнения другими антителами. Термин «моноклональное» указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно быть истолковано как антитело, требующее получения любым конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые будут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены методом гибридом, впервые описанным Kohler et al (1975) Nature 256: 495, или могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (патент США 4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных, например, в Clackson et al (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597. Термин «нагнетаемый в пространство над средой воздух» означает воздух, подаваемый в верхнюю части ферментера, содержащего среду с культурой. Как правило, кислород подают в ферментер барботированием воздуха через жидкую среду для культивирования, что часто сопровождается интенсивным перемешиванием, чтобы создать дисперсию мелких пузырей.

Термин «прокариотическая клетка-хозяин», используемый в настоящем изобретении, включает хозяев, которые используют путь биосинтеза менахинона. В одном варианте осуществления прокариотические клетки-хозяева включают, например, Archaebacteria и Eubacteria, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы. Примеры подходящих бактерий включают Escherichia (например, Е. coli), Bacilli (например, В. subtilis), Enterobacteria, виды Pseudomonas (например, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla или Paracoccus. В одном варианте осуществления используются грамотрицательные клетки. В другом варианте в качестве хозяев для изобретения используют клетки E. coli (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) и их производные, включая штамм 33D3, имеющий генотип W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lacIq lacL8 ΔompT Δ(nmpC-fepE) degP41 kanR (патент США 5639635). Конечно, также подходят другие штаммы и их производные, такие как E. coli 294 (ATCC 31446), E. coli В, Е. coliλ 1776 (ATCC 31537) и E. coli RV308 (ATCC 31608). Эти примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими. Способы создания производных любой из вышеуказанных бактерий, имеющих определенные генотипы, известны в данной области и описаны, например, Bass et al. (1990) Proteins, 8: 309-314. Конечно, необходимо выбрать подходящие бактерии с учетом воспроизводимости репликона в клетках бактерии. Например, виды E. coli, Serratia или Salmonella подходят для использования в качестве хозяина, если для обеспечения репликона используют хорошо известные плазмиды, такие как pBR322, pBR325, pACYC177 или pKN410.

Используемый в настоящем документе термин «рекомбинантный белок» относится в целом к пептидам и белкам, в том числе антителам. Такие рекомбинантные белки «гетерологичны», то есть являются чужеродными к используемой клетке-хозяину, примером является человеческий белок, полученный с использованием E. coli. Полипептид может быть получен в виде нерастворимого агрегата или в виде растворимого полипептида в периплазматическом пространстве или в цитоплазме.

Термин «не зависит от масштаба культивирования» означает, что процесс культивирования в варианте осуществления настоящего изобретения может быть выполнен в емкости любого объема, такого как, например, от примерно 1 литра или более, или примерно 10 литров или более, или примерно 100 литров или более, или примерно 500 литров или более, или примерно 1000 литров или более, или примерно 10000 литров или более или примерно 100000 литров или более.

II. СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам рекомбинантного получения белков в прокариотической системе. Изобретение основано на предотвращении образования коричневого аддукта, обнаруживаемого в ходе получения рекомбинантного белка, которое приводит к несоответствию некоторого количества продукта техническим требованиям. Как показано в представленных здесь примерах, проблема коричневого аддукта является результатом нестабильного окислительно-восстановительного потенциала во время процедур выделения. Было неожиданно обнаружено, что образование коричневого аддукта может быть предотвращено путем поддержания уровня растворенного кислорода, превышающего ноль, во время процедур выделения или, в качестве альтернативы, путем делеции гена menE в геноме прокариотической клетки-хозяина, используемой для рекомбинантного получения интересующего рекомбинантного белка.

Рекомбинантное получение рекомбинантных белков в прокариотических клетках На первой стадии указанного выше способа гетерологичную нуклеиновую кислоту (например, кДНК или геномную ДНК), используемую для получения интересующего рекомбинантного белка, соответствующим образом встраивают в реплицируемый вектор для экспрессии в бактерии под контролем подходящего для бактерии промотора. Для этой цели подходит множество векторов, и выбор соответствующего вектора зависит главным образом от размера нуклеиновой кислоты, которую будут вставлять в вектор, и конкретной клетки-хозяина, которую будут трансформировать вектором. Каждый вектор содержит различные компоненты в зависимости от его функции (амплификация ДНК или экспрессия ДНК) и конкретной клетки-хозяина, с которой он совместим. Компоненты вектора для трансформации бактерий могут включать сигнальную последовательность для гетерологичного полипептида, сигнальную последовательность, а также индуцируемый промотор для гетерологичного полипептида. Они также обычно включают участок начала репликации и один или несколько маркерных генов, описанных в настоящем документе.

Если гетерологичный полипептид должен секретироваться, ДНК, кодирующая интересующий гетерологичный полипептид, содержит сигнальную последовательность, например, на N-конце зрелого гетерологичного полипептида. В общем, сигнальная последовательность может быть компонентом вектора, или она может быть частью ДНК гетерологичного полипептида, которая встроена в вектор. Гетерологичная сигнальная последовательность должны быть выбрана так, чтобы ее могла распознавать и процессировать (например, расщеплять сигнальной пептидазой) клетка-хозяин. Для бактериальных клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют нативную сигнальную последовательность гетерологичного полипептида, сигнальная последовательность может быть заменена любой из широко известных бактериальных сигнальных последовательностей.

Экспрессионные векторы содержат нуклеотидную последовательность, которая позволяет вектору реплицироваться в одном или нескольких выбранных клетках-хозяевах. Такие последовательности хорошо известны для различных бактерий. Участок начала репликации из плазмиды pBR322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий.

Экспрессионные векторы обычно также содержат ген для селекции, также называемый селективным маркером. Этот ген кодирует белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев, выращиваемых в селективной среде для культивирования. Клетки-хозяева, не трансформированные вектором, содержащим ген для селекции, не выживут в среде для культивирования. Типичные гены для селекции кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (б) дополняют ауксотрофную недостаточность или (в) обеспечивают доступность необходимых питательных веществ, не доступных из сложных сред, например, ген, кодирующий D-аланинрацемазу для Bacilli. Один из примеров схемы селекции включает использование лекарственного средства для остановки роста клетки-хозяина. Те клетки, которые успешно трансформированы гетерологичным геном, продуцируют белок, обеспечивающий резистентность к лекарственным средствам и, таким образом, выживают при селекции. Экспрессионный вектор для получения гетерологичного полипептида также содержит индуцируемый промотор, который распознается бактериальным организмом-хозяином, и который функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей интересующий гетерологичный полипептид. Вектор также содержит отдельный индуцируемый промотор или промотор с низким базовым уровнем экспрессии, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей литические ферменты. Индуцируемые промоторы, пригодные для использования с бактериальными хозяевами, включают бета-лактамазные и лактозные промоторные системы (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)), арабинозные промоторные системы, в том числе промотор araBAD (Guzman et al., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992); Guzman et al., J. Bacteriol., 177: 4121-4130 (1995); Siegele and Hu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8168-8172 (1997)), рамнозный промотор (Haldimann et al., J. Bacteriol., 180: 1277-1286 (1998)), промотор щелочной фосфатазы, триптофановую (trp) промоторную систему (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) и ЕР 36,776), промоторы P.sub.LtetO-1 и P.sub.lac/are-1 (Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res., 25: 1203-1210 (1997)) и гибридные промоторы, такие как промотор tac, deBoer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983). Тем не менее, также подходят другие известные бактериальные индуцируемые промоторы и промоторы с низким базовым уровнем экспрессии. Их нуклеотидные последовательности опубликованы, тем самым предоставляя квалифицированному специалисту возможность функционально лигировать их с ДНК, кодирующей интересующий гетерологичный полипептид, или с нуклеиновой кислотой, кодирующей литические ферменты (Siebenlist et al., Cell, 20: 269 (1980)), используя линкеры или адаптеры для создания любых необходимых сайтов рестрикции. Если используется сильный промотор с высоким уровнем базальной экспрессии, такой как промотор trp, как правило, его используют только для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид, а не для нуклеиновой кислоты, кодирующей литический фермент. Промоторы tac и PL могут быть использованы по отдельности для всех компонентов, но не оба вместе. В одном варианте осуществления используют промотор щелочной фосфатазы (phoA) для продукта и арабинозный промотор (ara) для литических ферментов.

Промоторы для использования в бактериальных системах также обычно содержат последовательность Шайна-Дальгарно (SD), функционально связанную с ДНК, кодирующей интересующий гетерологичный полипептид. Промотор может быть удален из исходной бактериальной ДНК с помощью расщепления ферментом рестрикции и вставлен в вектор, содержащий желаемую ДНК. Промотор phoA может быть удален из исходного источника бактериальной ДНК с помощью ферментов рестрикции и вставлен в вектор, содержащий желаемую ДНК.

Создание подходящих векторов, содержащих один или более из перечисленных выше компонентов, включает использование стандартных способов лигирования, широко известных специалистам в данной области. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК расщепляют, обрабатывают и повторно лигируют в требуемом виде для получения требуемой плазмиды.

Подходящие прокариотические клетки-хозяева для заявленного изобретения включают любые клетки-хозяева, которые используют пути биосинтеза менахинонов, как это определено в настоящем документе. Некоторые неограничивающие примеры включают, например, Escherichia coli (Е. coli), Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla и Paracoccus. Трансформация означает введение ДНК в прокариотического хозяина таким образом, что ДНК является реплицируемой, либо в виде внехромосомного элемента, либо в виде вставки в хромосому. В зависимости от используемой клетки-хозяина, трансформация осуществляется с использованием стандартных методов, подходящих для таких клеток. Обработку кальцием с использованием хлорида кальция, как правило, используют для бактериальных клеток, которые имеют существенные барьеры в виде клеточных стенок. В другом способе трансформации используют полиэтиленгликоль/ДМSO. Еще одним способом является электропорация.

Прокариотические клетки, используемые для получения полипептидов согласно изобретению, выращивают в среде, известной в данной области техники