Способ обнаружения мультиспецифического связывающего агента

Способ обнаружения мультиспецифического связывающего агента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В настоящем изобретении предложен способ обнаружения мультиспецифического связывающего агента в образце, в котором мультиспецифический связывающий агент выявляют, используя антиидиотипические антитела к различным связывающим специфичностям мультиспецифического связывающего агента.

Предпосылки создания изобретения

Стандартные твердофазные иммуноанализы с использованием антител включают создание комплекса между антителом, адсорбированным/иммобилизованном на твердой фазе («захватывающее» антитело), антигеном и антителом к другому эпитопу антигена, которое конъюгировано с ферментом или выявляемой меткой (меченое антитело). При осуществлении анализа образуется сэндвич: твердая фаза/»захватывающее» антитело/антиген/меченое антитело. Среди прочего, в реакции, катализируемой сэндвичем, активность конъюгированного с антителом фермента является пропорциональной концентрации антигена в среде для инкубации. Анализы с применением антиидиотипических антител упомянуты, например, в US 5219730; WO 87/002778; ЕР 0139389 и ЕР 0170302. У Wadhwa М. и др. (J. Immunol. Methods 278, 2003, сс. 1-17), описаны стратегии обнаружения, измерения и характеризации нежелательных антител, индуцированных терапевтическими биологическими агентами. Метод получения антиидиотипических антител описан в ЕР 1917854.

В WO 2008/119353 описаны биспецифические антитела и методы их получения. Методы определения двухвалентности терапевтических агентов на основе белка и антитела описаны в WO 2006/096697. В WO 2008/134046 описаны эффективные стабильные не обладающие иммуносупрессорным действием антитела к CD4. У Muller K.M. с соавторами отмечено, что в качестве домена гетеродимеризации для биспецифических миниантител можно применять первый константный домен (СН1 и CL) антитела.

Краткое изложение сущности изобретения

Установлено, что путем применения двух антиидиотипических антител в качестве «захватывающего» и меченого антитела в сэндвич-иммуноанализе для определения количества мультиспецифического антитела в образце, если при этом каждое из антиидиотипических антител связывается с различными связывающими специфичностями мультиспецифического антитела, можно минимизировать влияния, связанные с матриксом образца (таким, например, как сыворотка или человеческая плазма, антигены и т.д.). Кроме того, можно применять процедуру анализа, которая является более чувствительной, меньше подвержена воздействиям матрикса образца, которую можно осуществлять более быстро, при осуществлении которой требуется минимальное удаление/разведение матрикса образца и которая является более гибкой касательно мечения/дериватизации/иммобилизации «захватывающего» и/или меченого антитела соответственно. Для этой цели применяют два антиидиотипических антитела, одно, направленное против первой связывающей специфичности биспецифического антитела, и одно, направленное против второй связывающей специфичности биспецифического антитела.

Таким образом, в настоящем описании представлен способ (иммунологического) определения количества мультиспецифического связывающего агента в образце, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых:

- определяют количество комплекса, образованного между

I) антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается с первой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, и

II) мультиспецифическим связывающим агентом

посредством инкубации комплекса с антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, которая отличается от первой связывающей специфичности мультиспецифического антитела, и тем самым определяют количество мультиспецифического связывающего агента в образце.

В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается с первой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, конъюгируют с твердой фазой.

В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается со второй связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, конъюгируют с выявляемой меткой.

В одном из вариантов осуществления изобретения образец содержит (человеческую) сыворотку или (человеческую) плазму и/или представляет собой клеточный лизат, и/или сдержит один или несколько антигенов мультиспецифического связывающего агента. В одном из вариантов осуществления изобретения образец представляет собой (человеческую) сыворотку или (человеческую) плазму.

В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент выбирают из антитела, слитого полипептида, который содержит антитело или фрагмент антитела и не представляющий собой антитело полипептид, слитого полипептида, который содержит антитело или фрагмент антитела и растворимый рецептор, или слитого полипептида, который содержит антитело или фрагмент антитела и пептидную связывающую молекулу.

В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент представляет собой антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой биспецифическое антитело, или триспецифическое антитело, или тетраспецифическое антитело, или пентаспецифическое антитело, или гексаспецифическое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой биспецифическое антитело.

В одном из вариантов осуществления изобретения связывающая специфичность представляет собой связывающий сайт или пару, состоящую из вариабельного домена тяжелой цепи антитела и вариабельного домена легкой цепи антитела.

В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается с первой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, является биотинилированным, а твердая фаза сенсибилизирована стрептавидином. В одном из вариантов осуществления изобретения твердая фаза представляет собой сенсибилизированную стрептавидином парамагнитную гранулу или сенсибилизированную стрептавидином сефарозную гранулу.

В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается со второй связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента, является дигоксигенилированным.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ заключается в том, что осуществляют стадии, на которых

- определяют количество комплекса, образованного между

I) антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается с первой связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента,

II) мультиспецифическим связывающим агентом и

III) антиидиотипическим антителом, которое специфически связывается со второй связывающей специфичностью мультиспецифического связывающего агента и содержит выявляемую метку,

путем определения выявляемой метки в образовавшемся комплексе.

В одном из вариантов осуществления изобретения конъюгацию антиидиотипического антитела с его партнером по конъюгации осуществляют путем химического связывания через N-концевые и/или ε-аминогруппы (лизин), ε-аминогруппы различных лизинов, карбоксильные, сульфгидрильные, гидроксильные и/или фенольные функциональные группы аминокислотного каркаса, представляющего собой лекарственное средство антитела и/или группы сахарного спирта углеводной структуры, представляющего собой лекарственное средство антитела.

В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело представляет собой смесь, содержащую антиидиотипическое антитело, конъюгированное с твердой фазой по меньшей мере через две различные аминогруппы. Указанное сочетание через различные аминогруппы можно осуществлять путем ацилирования части ε-аминогрупп с помощью химических защитных агентов, например, на первой стадии путем цитраконилирования. На второй стадии конъюгацию осуществляют через оставшиеся аминогруппы. Затем цитраконовые группы удаляют и антитело конъюгируют с твердой фазой через оставшиеся свободные аминогруппы, т.е. полученное антитело конъюгировано с твердой фазой через аминогруппы, которые не были защищены путем цитраконилирования. Приемлемые химические защитные агенты образуют связи на незащищенных боковых цепях аминов и являются менее стабильными и отличаются от связей на N-конце. Известно много указанных химических защитных агентов (см., например, ЕР 0651761). В одном из вариантов осуществления изобретения химические защитные агенты включают циклические ангидриды дикарбоновых кислот типа ангидрида малеиновой или цитраконовой кислоты.

В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело конъюгируют с твердой фазой путем пассивной адсорбции. Пассивная адсорбция описана, например, у Butler J.E. в: «Solid Phases in Immunoassay», 1996, сс. 205-225 и в «Immunoassays», под ред. Diamandis Е.Р. и Christopoulos T.K., изд-во Academic Press, San Diego, 1996.

В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело конъюгируют (иммобилизуют) через специфическую связывающуюся пару. Указанную связывающуюся пару (первый компонент/второй компонент) в одном из вариантов осуществления изобретения выбирают из стрептавидина или авидина /биотина, антитела/антигена (см., например, Hermanson G.T. и др. Bioconjugate Techniques, изд-во Academic Press, 1996), лектина/полисахарида, стероида/связывающего стероид белка, гормона/рецептора гормона, фермента/субстрата, IgG/белка А и/или G и т.д. В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело конъюгируют с биотином и иммобилизацию осуществляют через иммобилизованный авидин или стрептавидин.

Описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - схематическое изображение принципа фармакокинетического анализа ELISA, предназначенного для определения концентраций биспецифических антител в образцах сыворотки и клеток (ELISA на основе антиидиотипических антител);

на фиг. 2 - схема основанного на применении антигенов сэндвич-ELISA, предназначенного для выявления антитела к VEGF/ANG2. Рекомбинантным человеческим ангиопоэтином 2 непосредственно сенсибилизировали титрационный микропланшет. Параллельно осуществляли предварительную инкубацию образцов, содержащих антитела к VEGF/ANG2, с меченным дигоксигенином рекомбинантным VEGF. После сенсибилизации планшет отмывали и инкубировали с предварительно инкубированной смесью. Комплексы антитела к VEGF/ANG2 и меченного дигоксигенином VEGF связывались с ANG2 на поверхности титрационного микропланшета. Связанный меченный дигоксигенином VEGF выявляли с помощью конъюгата антитело к дигоксигенину-HRP и ABTS;

на фиг. 3 - результаты сравнения калибровочных кривых, полученных с помощью основанного на применении антигенов ELISA (А, целевой анализ) и основанного на применении антиидиотипических антител ELISA (Б, анти-ID-анализ) для обнаружения биспецифического антитела к VEGF/ANG2;

на фиг. 4 - результаты сравнения калибровочных кривых, полученных с помощью основанного на применении антиидиотипических антител ELISA и основанного на применении антигенов ELISA в присутствии 5%, 10% и 20% человеческой сыворотки.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предложен способ in vitro определения количества мультиспецифического связывающего агента, такого как биспецифические антитела/лекарственные средства, в образцах, полученных в доклинических и клинических исследованиях.

Было установлено, что мультиспецифический связывающий агент в образце можно выявлять с помощью двух антиидиотипических антител, которые связываются с различными связывающими специфичностями мультиспецифического связывающего агента, для того, чтобы минимизировать влияния матрикса образца и обеспечивать большую степень гибкости схемы и процесса осуществления иммунологического определения количества мультиспецифического связывающего агента в образце.

В представленном ниже в настоящем описании способе, приведенном в качестве примера, в качестве варианта мультиспецифического связывающего агента применяют мультиспецифическое антитело.

Понятие «антитело» в контексте настоящего описания применяют в его наиболее широком смысле, и оно относится к антителам различной структуры, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, если они сохраняют требуемую активность в отношении связывания с антигеном.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент представляет собой мультиспецифическое антитело, например биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности, связывающиеся по меньшей мере с двумя различными сайтами. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из специфичностей связывается с первым антигеном, в другая со вторым отличным от него антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецфические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами одного и того же антигена. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое специфически связывается с первым и вторым антигеном. В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело имеет I) первую связывающую специфичность, которая специфически связывается с первым антигеном или первым эпитопом антигена, и II) вторую связывающую специфичность, которая специфически связывается со вторым антигеном или вторым эпитопом этого же антигена. В одном из вариантов осуществления изобретения второй эпитоп этого же антигена представляет собой неперекрывающийся эпитоп.

Мультиспецифические антитела описаны в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 или WO 2010/145793.

Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; димерные антитела (диабоди); линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Понятие «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, который/которая входит в его тяжелую цепь. Известно пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них можно подразделять дополнительно на подклассы (изотипы), например IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулина, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно.

Понятие «свободный антиген» означает антиген, который может быть специфически связан связывающей специфичностью антитела, но который в рассматриваемый момент времени не связан с указанной связывающей специфичностью. В одном из вариантов осуществления изобретения свободный антиген представляет собой несвязанный антителом антиген или не образующий комплекс с антителом антиген.

Понятие «Fc-область» в контексте настоящего описания относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Понятие включает нативную последовательность Fc-областей и вариант Fc-областей. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается с Cys226 или с Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc-области может присутствовать или отсутствовать. Если специально не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, которую обозначают также как EU-индекс, описанной у Kabat Е.А. и др. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, NIH публикация 91-3242.

Понятие «каркасный участок» или «FR» означает аминокислотные остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка (HVR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности HVR и FR, как правило, расположены в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-Н3(L3)-FR4.

«Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком или человеческой клеткой, или выведенную из источника, отличного от человека, с использованием спектра человеческих антител или других кодирующих человеческое антитело последовательностей. Указанное определение человеческого антитела специально исключает гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.

Понятие «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, которое содержит аминокислотные остатки из нечеловеческих HVR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело может содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют участкам нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, выведенной из человеческого антитела. Понятие «гуманизированная форма» антитела, например нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое подвергнуто гуманизации.

Понятие «гипервариабельный участок» или «HVR» в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательности которых являются гипервариабельными и/или образуют петли определенной структуры («гипервариабельные петли»). Как правило, нативные четырехцепочечные антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). HVR, как правило, содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из «определяющих комплементарность участков» (CDR), последние обладают наибольшей вариабельностью последовательности и/или или участвуют в распознавании антигена. Приведенные в качестве примера гипервариабельные петли включают аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia С. и Lesk A.M., J. Mol. Biol. 196, 1987, сс. 901-917). Приведенные в качестве примера CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) включают аминокислотные остатки 24-34 в случае L1, 50-56 в случае L2, 89-97 в случае L3, 31-35 В в случае H1, 50-65 в случае Н2 и 95-102 в случае Н3 (Kabat Е.А. и др. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-oe изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD,1991, публикация NIH 91-3242). За исключением CDR1 в VH, CDR, как правило, содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. CDR содержат также «определяющие специфичность остатки» или «SDR», которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR входят в области CDR, которые обозначают как «сокращенные»-CDRs или a-CDR. Приведенные в качестве примера a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) включают аминокислотные остатки 31-34 в случае L1, 50-55 в случае L2, 89-96 в случае L3, 31-35 В в случае H1, 50-58 в случае Н2 и 95-102 в случае Н3 (Almagro J.С. и Fransson J., Front. Biosci. 13, 2008, сс. 1619-1633). Если не указано иное, то HVR-остатки и другие остатки в вариабельном домене (например, FR-остатки) в контексте настоящего описания нумеруют по Кэботу с соавторами (см. выше).

В контексте настоящего описании понятие «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. входящие в популяцию индивидуальные антитела являются идентичными и/или связываются с одним и тем же эпитопом за исключением возможных вариантов, которые могут возникать при получении моноклонального антитела, такие варианты, как правило, присутствуют в небольших количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), мишенью каждого моноклонального антитела является одна детерминанта антигена. Таким образом, прилагательное «моноклональный» указывает на тот отличительный признак, что антитело получено из практически гомогенной популяции антител, и оно не подразумевает требования, что антитело должно быть получено каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению, можно создавать с помощью различных методов, включая (но, не ограничиваясь только ими) метод гибридом, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы, основанные на применении трансгенных животных, которые содержат все локусы человеческих иммуноглобулинов или их часть, указанные методы и другие приведенные в качестве примеров методы получения моноклональных антител представлены ниже в настоящем описании.

Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который принимает участие в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt T.J. и др. Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman и Co., N.Y. 2007, с. 91). Индивидуального VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфического связывания с антигеном. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, можно выделять, используя VH-или VL-домен из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL- или VH-доменов соответственно (см., например, Portolano S. и др., J. Immunol. 150, 1993, сс. 880-887; Clackson Т. и др. Nature 352, 1991, сс. 624-628).

Понятие «антиидиотипическое антитело» относится к антителу, которое специфически связывается со связывающей специфичностью, такой как связывающий сайт родительского антитела, т.е. которое направлено, например, против антигенсвязывающего сайта родительского антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения антиидиотипическое антитело специфически связывается с одним или несколькими CDR родительского антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения родительское антитело представляет собой терапевтическое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения родительское антитело представляет собой мультиспецифическое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения родительское антитело представляет собой биспецифическое антитело.

Два эпитопа являются перекрывающимися, если обнаружено снижение сигнала на 50% или более, в одном из вариантов осуществления изобретения на 75% или более, с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR), в котором используют иммобилизованное антитело и растворимый антиген или наоборот, при использовании изучаемого эпитопа в концентрации 20-50 нМ, а антитело, которое связывается с перекрывающимися эпитопами, может быть обнаружено в концентрации 100 нМ. В альтернативном варианте можно применять метод, в котором перекрывание эпитопов двух антител, связывающихся с одним и тем же антигеном, определяют с помощью конкурирующей тест-системы. Например, для этой цели с помощью иммуноферментного клеточного анализа (ELISA), в котором применяют клетки, экспрессирующие эпитопы рекомбинантного антигена, определяют, может ли антитело, для которого требуется обнаружить перекрывание эпитопов, конкурировать с другим антителом за связывание с иммобилизованным антигеном. Для этой цели иммобилизованный антиген инкубируют с антителом в меченой форме и определяют избыток антитела, для которого требуется обнаружить перекрытие эпитопов. Путем оценки связанной метки можно легко обнаруживать перекрывание эпитопов. Если снижение сигнала составляет более 70%, в одном из вариантов осуществления изобретения - более 80%, при одной или той же концентрации, или вытеснение составляет более 80%, в одном из вариантов осуществления изобретения - более 90%, при более высоких концентрациях, в одном из случаев при 10⁵-кратном избытке антитела, для которого требуется обнаружить перекрывание эпитопов, относительно известного антитела, то считается, что присутствуют идентичные эпитопы или перекрывающиеся эпитопы, и оба антитела связываются с одним и тем же или с перекрывающимся эпитопом на одном и том же антигене.

Принципы различных иммуноанализов описаны, например, у Hage D.S. Anal. Chem. 71, 1999, сс. 294-304). У Lu В. и др. Analyst 121, 1996, сс. 29-32 описана ориентированная иммобилизация антител, предназначенных для применения в иммуноанализах. Опосредуемые авидином-биотином иммуноанализы описаны, например, у Wilchek М. и Bayer Е.А., Methods Enzymol. 184, 1990, сс. 467-469.

В белках моноклональных антител и их константных доменов содержится ряд реакционно-способных боковых цепей, пригодных для сочетания с партнером по связыванию, таким как поверхность, белок, полимер (например, ПЭГ, целлюлоза или полистирол), фермент или компонент связывающейся пары. Химическими реакционно-способными группами антител являются, например, аминогруппы (лизины, альфа-аминогруппы), тиольные группы (цистины, цистеины и метионины), группы карбоновых кислот (аспарагиновые кислоты, глутаминовые кислоты) и группы сахарных спиртов. Указанные методы описаны, например, у Aslam М. и Dent А. в «Bioconjugation», изд-во MacMillan Ref. Ltd., 1999, сс. 50-100.

Одной из наиболее часто встречающихся реакционно-способных групп белков является алифатический ε-амин аминокислоты лизина. В целом, практически все антитела содержат лизин в большом количестве. Амины лизина представляют собой достаточно хорошие нуклеофилы при значении pH выше 8,0 (pK_a=9,18) и поэтому легко и полностью вступают во взаимодействие с различными реагентами с образованием стабильных связей.

Реакционно-способные в отношении аминов реагенты сначала вступают во взаимодействие с лизинами и α-аминогруппами белков. Реакционно-способные сложные эфиры, прежде всего сложные N-гидроксисукцинимидные (NHS) эфиры, относятся к одним из наиболее широко применяемых реагентов для модификации аминных групп. Оптимальное значение pH реакции в водной среде составляет от 8,0 до 9,0. Изотиоцианаты представляют собой модифицирующие амин реагенты и образуют тиомочевинные связи с белками. Они взаимодействуют с аминами белков в водном растворе (оптимально при pH 9,0-9,5). Альдегиды взаимодействуют в мягких водных условиях с алифатическими и ароматическими аминами, гидразинами и гидразидами с образованием иминного промежуточного продукта (основание Шиффа). Основание Шиффа можно избирательно восстанавливать с помощью слабых или сильных восстановителей (таких, как борогидрид натрия или цианборогидрид натрия) с получением стабильной алкиламинной связи. Другие реагенты, которые применяли для модификации аминов, представляют собой ангидриды карбоновых кислот. Например, ангидрид диэтилентриаминопентауксусной кислоты (DTPА) представляет собой бифункциональный хелатирующий агент, который содержит две обладающие реакционной способностью в отношении аминов ангидридные группы. Он может взаимодействовать с N-концевыми и ε-аминогруппами с образованием амидных связей. Ангидридные кольца размыкаются с образованием многовалентных металлхелатирующих плеч, которые могут прочно связываться с металлами с образованием координационного комплекса.

Другой широко распространенной реакционно-способной группой в антителах является тиольный остаток серосодержащей аминокислоты цистина и ее восстановленного продукта цистеина (или половины цистина). Цистеин содержит свободную тиольную группу, которая является более нуклеофильной, чем амины, и, как правило, является наиболее реакционно-способной функциональной группой в белке. Тиолы, как правило, являются реакционно-способными при нейтральном значении pH и поэтому их можно избирательно сшивать с другими молекулами в присутствии аминов. Поскольку свободные сульфгидрильные группы являются относительно реакционно-способными, в белках с такими группами они часто присутствуют в окисленной форме в виде дисульфидных групп или дисульфидных связей. В таких белках восстановление дисульфидных связей с помощью реагента, такого как дитиотреитол (DTT), требуется для создания реакционно-способного свободного тиола. Реакционно-способные в отношении тиола реагенты представляют собой соединения, которые могут связываться с тиольными группами на белках, образуя сшитые с помощью простого тиоэфира продукты. Эти реагенты быстро взаимодействуют при значении pH от слабокислого до нейтрального и поэтому могут вступать в реакцию избирательно в присутствии аминных групп. Из литературы известно применение несколько тиолирующих перекрестносшивающих реагентов, таких как реагент Траута (2-иминотиолан), сукцинимидил(ацетилтио)ацетат (SATА) и сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат (сульфо-LC-SPDP), для обеспечения эффективных путей интродукции нескольких сульфгидрильных групп через реакционно-способные аминогруппы. Галоацетильные производные, например йодацетамиды, образуют тиоэфирные связи и также представляют собой реагенты для модификации тиолов. Другими пригодными реагентами являются малеимиды. Реакция малеимидов с обладающими реакционной способностью в отношении тиола реагентами практически такая же, как и в случае йодацетамидов. Малеимиды быстро вступают в реакцию при значении рН от слабокислого до нейтрального.

Другой широко распространенной реакционно-способной группой в антителах является карбоновая кислота. Белки содержат группы карбоновых кислот на С-конце и в боковых цепях аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. Относительно низкая реакционная способность карбоновых кислот в воде, как правило, затрудняет применение этих группы для избирательной модификации белков и других биомолекул. Когда это осуществляют, то группу карбоновой кислоты, как правило, превращают в реакционно-способный эфир с помощью водорастворимого карбодиимида и подвергают взаимодействию с нуклеофильным реагентом, таким как амин, гидразид или гидразин. Содержащий амин реагент должен быть слабоосновным для того, чтобы избирательно взаимодействовать с активированной карбоновой кислотой в присутствии более высокоосновных ε-аминов лизина с образованием стабильной амидной связи. Перекрестное сшивание белков может происходить при значении pH, превышающем 8,0.

Периодат натрия можно применять для окисления спиртовой части сахара в углеводном фрагменте, присоединенном к антителу, до альдегида. Каждая альдегидная группа может взаимодействовать с амином, гидразидом или гидразином, как описано для карбоновых кислот. Поскольку углеводный фрагмент главным образом встречается в области кристаллизуемого фрагмента (Fc) антитела, то для достижения конъюгации можно применять сайтнаправленную модификацию углевода вне антигенсвязывающего сайта. Образуется промежуточный продукт, представляющий собой основание Шиффа, который можно восстанавливать до алкиламина путем восстановления промежуточного продукта водорастворимым восстановителем, таким как цианборогидрид натрия (мягкий и избирательный реагент) или борогидрид натрия (сильный реагент).

Понятие «образец» относится (но, не ограничиваясь только ими) к любому количеству субстанции из живого организма или бывшего ранее живым организма. Указанные живые организмы включают (но, не ограничиваясь только ими) человека, мышей, обезьян, крыс, кроликов и других животных. В одном из вариантов осуществления изобретения образец получают из обезьян, прежде всего обезьян циномолгус, или кроликов, или мышей, или крыс. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные субстанции включают (но, не ограничиваясь только ими) цельную кровь, сыворотку или плазму из организма индивидуумов, которые являются наиболее широко распространенными источниками образцов в клинической практике.

Понятие «твердая фаза» означает нетекучую субстанцию и включает частицы (в том числе, микрочастицы и гранулы), изготовленные из такого материала, как полимер, металл (парамагнитные, ферромагнитные частицы), стекло и керамика; гелеобразные субстанции, такие как кремнезем, глинозем и полимерные гели; капилляры, изготовленные из полимера, металла, стекла и/или керамики; цеолиты и другие пористые субстанции; электроды; титрационные микропланшеты; твердые полоски и кюветы, пробирки или другие контейнеры для образов, применяемые в спектрометрии. Твердофазный компонент отличается от инертных твердых поверхностей тем, что «твердая фаза» содержит на своей поверхности по меньшей мере один фрагмент, который предназначен для взаимодействия с субстанцией, присутствующей в образце. Твердая фаза может представлять собой стационарный компонент, такой как пробирка, полоска, кювета или титрационный микропланшет, или может представлять собой нестационарные компоненты, такие как гранулы и микрочастицы. Можно применять широкое разнообразие микрочастиц, которые позволяют осуществлять либо нековалентное, либо ковалентное связывание с белками и другими субстанциями. Указанные частицы включают полимерные частицы, такие как частицы из полистирола и поли(метилметакрилата); золотые частицы, такие как золотые наночастицы и золотые коллоиды; и керамические частицы, такие как частицы из кремнезема, стекла и оксидов металлов (см., например, Martin C.R. и др. Analytical Chemistry-News & Features, 70, 1998, сс. 322А-327А, или Butler J.E., Methods 22, 2000, сс. 4-23).

В одном из вариантов осуществления изобретения выявляемую метку выбирают из хромогенов (флуоресцентные или люминесцентные группы и красители), ферментов, ЯМР-активных групп, частиц металлов или гаптенов, таких как дигоксигенин. Выявляемая метка может представлять собой также фотоактивируемую перекрестносшивающую группу, например азидогруппу или азириновую группу. В одном из вариантов осуществления изобретения хелаты металлов, которые можно выявлять путем электрохемилюминисценции, также представляют собой испускающие сигналы группы, при этом наиболее предпочтительными являются хелаты рутения, например хелат (биспиридил)₃²⁺рутения. Приемлемые применяемые для мечения включающие рутений группы описаны, например, в ЕР 0580979, WO 90/05301, WO 90/11511 и WO 92/14138.

Понятие «терапевтический мультиспецифический связывающий агент» относится к мультиспецифическому связывающему агенту, который предназначен для применения на человеке. В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент представляет собой мультиспецифическое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифический связывающий агент представляет собой биспецифическое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифическое или биспецифическое антитело представляет собой моноклональное антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифическое антитело или биспецифическое антитело представляет собой человеческое или гуманизированное моноклональное антитело.

Понятие «подопытное животное» означает любое млекопитающее, включая домашних и сельскохозяйственных животных, а также высших приматов, исключая однако человека. В одном из вариантов осуществления изобретения способ, представленный в настоящем описании, осуществляют с использованием образца, полученного из организма подопытного животного, которое выбирают из группы, включающей мышей, крыс, кроликов, коз, овец, собак, кошек и приматов типа лемуров, мартышек, мармозеток и высших обезьян. Если подопытное животное представляет собой гиббона, наиболее близкородственного человеку, то исключаются крупные обезьяны, прежде всего из группы, включающей шимпанзе, бабуинов, горилл и орангутангов.

Понятие «полный терапевтический мультиспецифический связывающий агент» означает любой