Мультиплексный иммунохроматографический способ определения циркулирующих иммунокомплексов

Мультиплексный иммунохроматографический способ определения циркулирующих иммунокомплексов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В данном изобретении раскрыт способ обнаружения и определения (размера и композиции) циркулирующих иммунных комплексов в биологических средах многоступенчатым способом, включающим эксклюзионную хроматографию (ЭХ) и иммуноанализ.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Большинство биотерапевтических средств может индуцировать нежелательные иммунные ответы с возможными последствиями в отношении безопасности и эффективности, где эти ответы варьируют по частоте и тяжести (Buttel, I.C. et al., Biologicals 39 (2011) 100-109; COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu (2007)).

Образование противолекарственных антител (ПЛА) может привести в результате к измененной фармакокинетике, к утрате или снижению эффективности, к нейтрализации природных аналогов, а также к общим иммунным реакциям и реакциям гиперчувствительности, включающим сывороточную реакцию/реакцию гиперчувствительности III типа/заболевание, опосредованное иммунокомплексами (Buttel, I.C. et al., Biologicals 39 (2011) 100-109; COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu (2007)).

Синдром, подобный сывороточной реакции, в результате образования комплексов противолекарственных антител с лекарственным средством (ПЛА-ЛС) является хорошо известным побочным эффектом и описан для ряда биопрепаратов в доклинических исследованиях (Ponce, R. et al., Regul.Toxicol.Pharmacol.54 (2009) 164-182) и в клинической практике (COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu (2007); Dreyfus, D.H. et al., Ann.Allergy Asthma Immunol. 96 (2006) 624-627; Gamarra, R.M., J. Emerg. Med. 30 (2006) 41-44; Goto, S. et al., Int. J. Hematol. 89 (2009) 305-309; Hansel, T.T. et al., Nat.Rev.Drug Discov. 9 (2010) 325-338; Pilette, C. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 120 (2007) 972-973; Tamilvanan, S. et al., J. Drug Target 18 (2010) 489-498).

Для имеющихся в продаже лекарственных средств признаки основных реакций, таких как сывороточная реакция или тяжелые аллергические реакции, диагностируют клинически. В тех случаях, когда побочные эффекты следуют за введением вовлеченных моноклональных антител (mAb; от англ. "monoclonal antibody"), эти реакции относят к ответу антител (COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea. europa.eu (2007)). Действительно, можно найти лишь весьма ограниченные данные, где образование ПЛА было исследовано и соотнесено с сигналами, наблюдаемыми клинически (Goto, S. et al., Int. J. Hematol. 89 (2009) 305-309).

С учетом потенциальной серьезности иммуногенности Европейская организация экспертизы лекарственных препаратов (ЕАПС) подчеркивает важность подтверждения и определения образования ПЛА (COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www.emea.europa.eu (2007)).

В характерном случае оценку иммуногенности проводят, используя иммуноанализы, разработанные для обнаружения ПЛА (Mire-Sluis, A.R. et al., J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16; Shankar, G. et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 48 (2008) 1267-1281; Koren, E. et al., J. Immunol. Methods 333 (2008) 1-9).

Информация о встречаемости ПЛА, тем не менее, до сих пор не дает возможности глубокого сопоставления с клинической картиной и измененной фармакокинетикой.

Количество и размер образовавшихся комплексов ПЛА с лекарственным средством зависит от нескольких параметров, например, от концентрации/доли ПЛА и лекарственного средства, а также от эпитопа и валентности (Abbas, А.K. and Lichtman, А.Н., Diseases caused by immunity responses: Hypersensitivity and Autoimmunity, in: Saunders (2003); Murphy, K. et al., Janeway's Immunobiology, in: Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC (2008)).

Размер и заряд комплекса составляют важную детерминанту клиренса этого комплекса или индукции побочных эффектов. В характерном случае комплексы большего размера выводятся ретикулоэндотелиальной системой, комплексы малого размера обычно не запускают воспаление, в то время как комплексы среднего размера могут фиксировать комплемент, и могут вызвать повреждение ткани (Abbas, А. K. and Lichtman, А.Н., Diseases caused by immunity responses: Hypersensitivity and Autoimmunity, in: Saunders (2003); Murphy, K. et al., Janeway's Immunobiology, in: Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC (2008); Mannik, M., Serum Sickness and pathophysiology of immune complexes, in: Clinical Immunology: Principles and Practices, Rich R.R., Fleisher T.A.S.B.D., Shearer W.T., Strober W. (eds.) 1062-1071 (1996); Sicherer, S.H., Leung D.Y.M., Serum Sickness, in: Nelsons textbook of pediatrics, Kliegman R.M., Behrman R.E., Jenson H.B.J., Stanton B.F. (eds.), Saunders Elsevier, pp.985-986 (2007). Кроме того, заряд комплекса является важным фактором для отложения комплексов в тканях (Abbas, А. K. and Lichtman, А.Н., Diseases caused by immunity responses: Hypersensitivity and Autoimmunity, in: Saunders (2003); Mannik, M., Serum Sickness and pathophysiology of immunocomplexes, in: Clinical Immunology: Principles and Practices, Rich R.R., Fleisher T.A.S.B.D., Shearer W.T., Strober W. (eds.) 1062-1071 (1996)).

Для глубокой оценки ответа ПЛА потенциально образуемые комплексы ПЛА-лекарственное средство должны быть охарактеризованы в отношении их размера и заряда. Кроме того, если существует эндогенный аналог лекарственного средства, информация о том, обладают ли образовавшиеся ПЛА перекрестной реактивностью с этими молекулами, и составляют ли эти эндогенные аналоги также часть комплексов, представляет собой ценную информацию. Кроме того, определение структуры антигена/лекарственного средства в иммунокомплексах предоставляет информацию о патогенезе.

Авторами Coyle et al. описано обнаружение и выделение иммунокомплексов в спинномозговой жидкости при рассеянном склерозе (Journal of Neuroimmunology 15 (1987) 97-107). Хроматофокусирование в сочетании с методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA; от англ. "enzyme-linked immunosorbent analysis"), являющееся чувствительным методом анализа иммунокомплексов, описано Kneba, М., et al. (J. Immunol. Meth. 61 (1983) 233-243). Авторами Matousovic, K., et al. описаны IgA-содержащие иммунокомплексы в моче пациентов с первичной нефропатией IgA-типа (Nephrology Dialysis Transplantation 21 (2006) 2478-2484). Циркулирующие иммунокомплексы у кроликов, переживающих инфекцию вируса чумы, описаны авторами Rattan, В., et al. (Acta Vir. 38 (1994) 105-110). В документе WO 2008/031532 раскрыт анализ антител на лекарственное средство. Авторами Stubenrauch, K., et al. описана оценка общего иммуноанализа толерантности к лекарственному средству с обнаружением иммунокомплексов в образцах сыворотки от яванских макак после введения антител человека (J. Pharm. Biomed. Anal. 52 (2010) 249-254). В документе WO 2011/056590 раскрыты анализы на обнаружение антител к лекарственным средствам, включающим фактор некроза опухоли (TNF; от англ. "tumor necrosis factor"), и аутоантител. Авторами Wang Shui Long et al. описан анализ антител против лекарственного средства (ПЛА) к адалимумабу в сыворотке пациента с использованием нового гомогенного анализа изменения электрофоретической подвижности (Am. J. Gastroent. 105 (Sup I, 2010) S444-S445. В патенте ЕР 2354792 раскрыт способ обнаружения антител против лекарственного средства. Авторами Lambert, Р.Н., et al. описано коллективное исследование Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) по оценке восемнадцати способов обнаружения иммунокомплексов в сыворотке (J. Clin. Lab. Immunol. 1 (1978) 1-15). Способы измерения циркулирующих иммунокомплексов описаны авторами LeVinson, S.S. et al. (Clin. Immunol. Newsletter 3 (1987) 39-42).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Обнаружено, что при способе обнаружения и определения (размера и композиции) циркулирующих иммуннокомплексов, например, комплексов, содержащих ПЛА против данного лекарственного средства, в биологических средах, включающем многоступенчатый способ с использованием эксклюзионной хроматографии (ЭХ) в сочетании по меньшей мере с одним иммуноанализом, может быть установлена корреляция с измененной фармакокинетикой, утратой или снижением эффективности, нейтрализацией природных аналогов, а также с общими иммунными реакциями и реакциями гиперчувствительности, включающими сывороточную реакцию/гиперчувствительность типа III/заболевание, опосредованное иммунокомплексами.

Один аспект, раскрытый в данном изобретении, представляет собой способ анализа/определения циркулирующего иммунокомплекса (ЦИК), образовавшегося in vivo, включающий следующие стадии:

a) эксклюзионную хроматографию (ЭХ) образца, полученного от млекопитающего, которому было введено лекарственное средство по меньшей мере один раз, для определения массы/размера иммунокомплекса,

b) необязательно вторую хроматографию, отличающуюся от ЭХ,

c) по меньшей мере один иммуноанализ, и

d) необязательно анализ на основе масс-спектрометрии,

в результате чего иммунокомплекс определяют посредством корреляции размера иммунокомплекса и результата/считывания данных иммуноанализа или масс-спектрометрического анализа.

Один аспект, раскрытый в данном изобретении, представляет собой способ анализа/определения циркулирующего иммунокомплекса конъюгированного противолекарственного антитела, содержащего (экзогенный) терапевтический полипептид и эндогенное противолекарственное антитело, образовавшегося in vivo, включающий следующие стадии:

a) эксклюзионную хроматографию (ЭХ) образца, полученного от млекопитающего, которому было введено лекарственное средство по меньшей мере один раз, для определения массы/размера иммунокомплекса,

b) необязательно вторую хроматографию, отличающуюся от ЭХ,

c) по меньшей мере один гетерогенный иммуноанализ для определения противолекарственного антитела, и

d) необязательно анализ на основе масс-спектрометрии,

в результате чего иммунокомплекс определяют посредством корреляции размера иммунокомплекса и результата/считывания данных иммуноанализа или масс-спектрометрического анализа,

где терапевтический полипептид представляет собой синтетический или неприродный терапевтический полипептид.

В одном воплощении всех аспектов изобретения образец представляет собой сыворотку или спинномозговую жидкость.

В одном воплощении всех аспектов изобретения иммунокомплекс представляет собой иммунокомплекс, специфичный к лекарственному средству.

Иммунокомплекс, специфичный к лекарственному средству, содержит лекарственное средство вместе с другими молекулами, отличающимися от лекарственного средства.

В одном воплощении всех аспектов изобретения иммуноанализ выбран из группы, включающей анализ на обнаружение противолекарственного антитела, анализ на обнаружение нейтрализующего антитела против лекарственного средства, фармакокинетический анализ (анализ количественного определения лекарственного средства), анализ на изотипирование антитела, анализ на обнаружение перекрестной реактивности ПЛА на эндогенный аналог лекарственного средства (если данное лекарственное средство содержит участок, также встречающийся эндогенно у млекопитающего), анализ связывания комплемента (связанного комплемента или способности к связыванию комплемента), анализ на определение эндогенного аналога лекарственного средства, содержащегося в иммунокомплексе (если данное лекарственное средство содержит участок, также встречающийся эндогенно у млекопитающего).

В одном воплощении всех аспектов изобретения иммуноанализ представляет собой гомогенный иммуноанализ или гетерогенный иммуноанализ. В одном воплощении изобретения иммуноанализ представляет собой радиоиммуноанализ (РИА), либо иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA, метод иммуноанализа с ферментным усилением (ИФУ)), либо флуоресцентный поляризационный иммуноанализ (ФПИА), либо люминесцентный иммуноанализ (ЛИА), либо иммунорадиометрический иммуноанализ (ИРМА), либо иммуноанализ с ферментами, иммобилизованными на микрогранулированной смоле (MEIA; от англ. "microbead-enzyme immunoassay"), либо твердофазный иммуноферментный анализ с флуоресцентным усилением (ELFA; от англ. "enzyme-linked fluorescence assay"), либо иммуноферментный анализ, усиленный лектином (LEIA; от англ. lectin-enzyme immunoassay"), либо иммунофлуоресцентный анализ (ИФА), либо электрохемилюминесцентный анализ (ЭХЛИА), либо иммуномагнитный электрохемилюминесцентный анализ (ИМЭХЛ), либо хемилюминесцентный метод дот-анализа на обнаружение тканевых антигенов (CDIA; от англ. "chemiluminescence dot-immunobinding assay"), либо иммунонефелометрический анализ, либо иммунонефелометрический анализ, усиленный частицами.

В одном воплощении изобретения иммуноанализ представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA; от англ. "enzyme linked immunosorbent assay"), либо электрохемилюминесцентный анализ (ЭХЛИА), либо хемилюминесцентный метод дот-анализа на обнаружение тканевых антигенов (CDIA), либо флуоресцентный поляризационный иммуноанализ (ФПИА), либо иммунонефелометрический анализ, либо иммунонефелометрический анализ, усиленный частицами.

В одном воплощении всех аспектов изобретения вторая хроматография, отличающаяся от ЭХ, представляет собой ионообменную хроматографию (катионо- или анионообменную хроматографию), либо хроматографию с обращенной фазой, либо гидрофильную хроматографию (ГФЛХ), либо гидрофобную хроматографию (ГФБХ), либо гидрофобную хроматографию с переносом заряда (ГФБХ-ПЗ), либо хроматографию с ограниченным доступом вещества (RAMC; от англ. "restricted access material chromatography").

В одном воплощении всех аспектов изобретения эксклюзионная хроматография представляет собой эксклюзионную хроматографию со сбором элюата во фракциях. В одном воплощении изобретения каждую из фракций анализируют в иммуноанализе.

В одном воплощении по меньшей мере одну из фракций эксклюзионной хроматографии дополнительно разделяют с помощью второй хроматографии, отличающейся от ЭХ, со сбором элюата в аликвотах. В одном воплощении изобретения каждую из фракций анализируют в иммуноанализе. В одном воплощении изобретения каждую из фракций эксклюзионной хроматографии анализируют второй хроматографией, отличающейся от ЭХ.

В одном воплощении всех аспектов изобретения фракция представляет собой аликвоту.

В одном воплощении всех аспектов изобретения иммуноанализ представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ.

В одном воплощении всех аспектов изобретения по меньшей мере один иммуноанализ представляет собой либо один, либо два, либо три, либо четыре, либо пять, либо шесть иммуноанализов.

В одном воплощении всех аспектов изобретения иммуноанализ представляет собой иммуноанализ противолекарственного антитела.

В одном воплощении всех аспектов изобретения по меньшей мере один из иммуноанализов представляет собой мостиковый твердофазный иммуноферментный анализ.

Положительный мостиковый твердофазный иммуноферментный анализ означает, что противолекарственное антитело составляло часть комплекса ПЛА-ЛС (противолекарственное антитело - лекарственное средство). Обнаружение противолекарственного антитела во фракции высокой молекулярной массы, то есть во фракциях эксклюзионной хроматографии, элюируемых раньше, означает, что противолекарственное антитело составляло часть комплекса, имеющего более высокую молекулярную массу.

В одном воплощении всех аспектов изобретения по меньшей мере один твердофазных иммуноферментных анализов представляет собой комплексный анализ на обнаружение комплексов ПЛА-ЛС. В одном воплощении изобретения комплексный анализ включает иммобилизованное антитело, специфичное к лекарственному средству, и антитело антивидовой специфичности в качестве идентифицирующего антитела.

В одном воплощении всех аспектов изобретения по меньшей мере один из иммуноанализов представляет собой прямой анализ на обнаружение противолекарственных антител, связанных с лекарственным средством, и/или с эндогенным аналогом лекарственного средства. В одном воплощении изобретения этот прямой анализ включает в качестве иммобилизованной молекулы иммобилизованное лекарственное средство или эндогенный аналог лекарственного средства и антитело антивидовой специфичности в качестве идентифицирующего антитела.

В прямом анализе использовано установление равновесия связывания противолекарственного антитела с лекарственным средством и/или его эндогенным аналогом в образце и иммобилизованным лекарственным средством после того, как свободное противолекарственное антитело удалено с помощью эксклюзионной хроматографии.

В одном воплощении всех аспектов изобретения поверхностный слой лекарственного средства представляет собой плотный поверхностный слой лекарственного средства.

За счет плотного поверхностного слоя осуществляют значительный сдвиг этого равновесия в направлении связывания с поверхностно-связанным лекарственным средством (используя авидность противолекарственного антитела).

В одном воплощении всех аспектов изобретения образец инкубируют в иммуноанализе в течение периода времени, составляющего от 16 до 32 часов.

Один аспект, как раскрыто в данном изобретении, представляет собой способ выделения лекарственного средства из комплексов ПЛА-ЛС с целью повышения толерантности лекарственного средства к последовательным анализам ПЛА/иммуноанализам. Аналогично способы, раскрытые в данном изобретении, можно применять для повышения толерантности лекарственного средства к иммуноанализам.

Один аспект, как раскрыто в данном изобретении, представляет собой способ определения комплексов противолекарственное антитело-лекарственное средство (ПЛА-ЛС), образовавшихся in vivo, включает следующие стадии:

a) эксклюзионную хроматографию образца, полученного от млекопитающего, которому было введено лекарственное средство по меньшей мере один раз, для определения массы/размера комплексов ПЛА-ЛС,

b) по меньшей мере один твердофазный иммуноферментный анализ для обнаружения противолекарственных антител,

где иммунокомплекс определяют как

- низкомолекулярный комплекс на основании положительного твердофазного иммуноферментного анализа, имеющий массу от примерно 150 кДа до примерно 400 кДа,

- комплекс средней молекулярной массы на основании положительного твердофазного иммуноферментного анализа, имеющий массу от примерно 400 кДа до примерно 1500 кДа, или

- высокомолекулярный комплекс на основании положительного твердофазного иммуноферментного анализа, имеющий массу от примерно 1500 «Да до примерно 7000 кДа.

Один аспект, как раскрыто в данном изобретении, представляет собой применение способа, раскрытого в данном изобретении, для определения корреляции характеристик иммунокомплекса с измененной фармакокинетикой.

Один аспект, как раскрыто в данном изобретении, представляет собой применение способа, раскрытого в данном изобретении, для определения снижения эффективности лекарственного средства.

Один аспект, как раскрыто в данном изобретении, представляет собой применение способа, раскрытого в данном изобретении, для определения нейтрализации природных аналогов лекарственного средства.

Один аспект, как раскрыто в данном изобретении, представляет собой применение способа, раскрытого в данном изобретении, для определения иммунных реакций и реакций гиперчувствительности к лекарственному средству.

Один аспект, как раскрыто в данном изобретении, представляет собой применение способа, раскрытого в данном изобретении, для определения отложений IgG в гломерулах.

В одном воплощении всех аспектов изобретения иммунная реакция и реакция. гиперчувствительности представляет собой сывороточную реакцию/реакцию гиперчувствительности III типа/заболевание, опосредованное иммунокомплексами.

Один аспект, как раскрыто в данном изобретении, представляет собой применение способа, раскрытого в данном изобретении, для определения присутствия иммунокомплексов, содержащих аутоиммунное антитело.

Один аспект, как раскрыто в данном изобретении, представляет собой применение способа, раскрытого в данном изобретении, для определения присутствия модифицированного/конъюгированного лекарственного средства.

В одном воплощении всех аспектов изобретения лекарственное средство представляет собой антитело человека или гуманизированное антитело.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Термин "противолекарственное антитело" означает антитело, направленное против антигенного участка лекарственного средства. Данный антигенный участок представляет собой антигенную аминокислотную последовательность лекарственного средства или гликоструктуру лекарственного средства. В одном воплощении изобретения противолекарственное антитело направлено против вторичной модификации лекарственного средства, являющейся результатом рекомбинантного продуцирования лекарственного средства, представляющего собой антитело, в клетках, отличающихся от клеток человека, таких как клетки СНО (клетки яичника китайского хомячка; от англ. "Chinese hamster ovarian cells"), клетки НЕК (клетки мезонефроса человека; от англ. "human embryonic kidney cells") или клетки ВНК (клетки почек новорожденного хомяка; от англ. "baby hamster kidney cells"). Как правило, противолекарственные антитела направлены против антигенного участка лекарственного средства, распознаваемого иммунной системой животного, которому вводят лекарственное средство. Такое противолекарственное антитело представляет собой "специфичное противолекарственное антитело". Лекарственные средства разрабатывают таким образом, чтобы они содержали насколько возможно меньше антигенных областей. Например, лекарственные средства, предназначенные для применения в медицине, могут быть гуманизированы перед применением пациентом-человеком, чтобы свести к минимуму образование иммунного ответа против лекарственного средства. Данный иммунный ответ имел бы форму противолекарственных антител, направленных против участков такого гуманизированного лекарственного средства, не принадлежащих человеку (см., например, Pan, Y., et al., FASEB J. 9 (1995)43-49).

Термин "хромогены" означает флуоресцентные или люминесцентные группы и красители.

Термин "детектируемая метка" означает ферменты, ЯМР-активные группы или металлические частицы, гаптены, такие как, например, дигоскигенин. Детектируемая метка может также представлять собой фотоактивируемую сшиваемую группу, например, азидогруппу или азириновую группу. Хелаты металлов, которые могут быть обнаружены с помощью электрохемилюминесценции, также являются предпочтительными группами, испускающими сигнал, причем, особое предпочтение отдают хелатам рутения, например, хелату (биспиридил)₃²⁺рутения. Подходящие группы, меченые рутением, раскрыты, например, в следующих документах: ЕР 0580979, WO 90/05301, WO 90/11511 и WO 92/14138.

Термин "лекарственное средство" означает полипептид, такой как антитело или молекула, отличающаяся от антитела, который можно вводить индивидууму для лечения заболевания. Лекарственные средства (такие как терапевтические полипептиды или терапевтические моноклональные антитела) широко применяют для лечения различных заболеваний, таких как онкологические заболевания (например, гематологические и солидные злокачественные опухоли, включающие неходжкинскую лимфому, рак молочной железы и колоректальный рак), иммунологические заболевания, заболевания центральной нервной системы, сосудистые заболевания или инфекционные заболевания. Такие лекарственные средства описаны, например, в статье Levine, А.Р., et al., Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 145-152. Такие лекарственные средства представляют собой, например, антитела против CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3, HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, СЕА, антигена Levis Y, рецептора интерлейкина (ИЛ)-6 или рецептора IGF-1. Терапевтические антитела также описаны, например, в статье Groner, В., et al., Curr. Mol. Meth. 4 (2004) 539-547; и в статье Harris, М., Lancet Oncol. 5 (2004) 292-302.

Термин "млекопитающее" означает живое существо, принадлежащее к классу позвоночных животных. Термин "млекопитающее" в одном воплощении изобретения означает приматов, кошек, собак, овец, крыс, мышей и кроликов. В одном воплощении изобретения термин "млекопитающее" означает членов семейств отряда приматов, включающих игрунок и тамаринов (семейство игрунковых (Callitrichidae)), обезьян Нового Света (семейство капуцинов (Cebidae)), мартышек (семейство мартышковых (Cercopithecidae)), мышиных и карликовых лемуров (семейство Cheirogaleidae), мадагаскарских руконожек (семейство Daubentoniidae), галаго и сенегальских галаго (семейство Galagonidae), гиббонов и гиббоновых (семейство Hylobatidae), короткохвостого индри, хохлатого индри и их родственников (семейство Indridae), настоящих лемуров (семейство Lemuridae), лори (семейство Loridae), тонкотелых лемуров (семейство Megaladapidae), долгопятов (семейство Tarsiidae), а также их скрещивания. В одном воплощении изобретения млекопитающее выбрано из группы, состоящей из членов семейств игрунок и тамаринов, мартышек, мышиных и карликовых лемуров, гиббонов и гиббоновых, настоящих лемуров, а также их скрещивания. В данном конкретном воплощении изобретения ближайшие родственники людей, высшие приматы, в частности, группа шимпанзе, бонобо, горилл и орангутанов, исключены.

Термин "образец" означает любое количество вещества от млекопитающего, которому введено лекарственное средство. Такие вещества включают, но не ограничены ими, цельную кровь, сыворотку или плазму от такого млекопитающего, являющиеся самыми широко используемыми источниками образцов в рутинной доклинической практике. В одном воплощении изобретения образец представляет собой жидкий образец, такой как слюна, моча, синовиальная жидкость, цельная кровь, плазма или сыворотка. В одном воплощении изобретения образец представляет собой цельную кровь, плазму или сыворотку.

Термин "твердая фаза" означает нетекучее вещество и включает частицы (включая микрочастицы и гранулы), полученные из материалов, таких как полимер, металл (парамагнитные, ферромагнитные частицы), стекло и керамика; гелеобразные вещества, такие как кремнезем, глинозем и полимерные гели; капилляры, которые могут быть получены из полимера, металла, стекла и/или керамики; цеолиты и другие пористые вещества; электроды; микротитрационные планшеты; твердые полоски и кюветы, пробирки или другие контейнеры для спектрофотометрических образцов. Твердофазный компонент анализа отличается от инертных твердых поверхностей, с которыми анализ может находиться в контакте, тем, что "твердая фаза" содержит по меньшей мере одну группировку на его поверхности, предназначенную для взаимодействия с иммобилизованным антителом. Твердая фаза может представлять собой стационарный компонент, такой как пробирка, полоска, кювета или микротитрационный планшет, либо может представлять собой нестационарный компонент, такой как гранулы и микрочастицы. Микрочастицы можно также применять в качестве твердой фазы для гомогенных форматов анализа. Можно использовать разнообразные микрочастицы, дающие возможность либо нековалентного, либо ковалентного присоединения полипептидов и других веществ. Такие частицы включают полимерные частицы, такие как частицы полистирола и поли(метилметкарилат); частицы золота, такие как наночастицы золота и коллоиды золота; и керамические частицы, такие как частицы кремнезема, стекла и оксида металла. См., например, статью Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, May 1, 1998, 322A-327A, включенную в данное описание посредством ссылки.

Способ мультиплексного анализа иммунокомплексов

Обнаружено, что при способе обнаружения и определения (размера и композиции) иммунокомплексов, направленных против введенного лекарственного средства, в биологической среде, включающем многоступенчатый способ с использованием эксклюзионной хроматографии (ЭХ) в сочетании с иммуноанализом, может быть установлена корреляция с измененной фармакокинетикой, утратой или снижением эффективности, нейтрализацией природных аналогов, а также общими иммунными реакциями и реакциями гиперчувствительности, включающими сывороточную реакцию/реакцию гиперчувствительности типа III/заболевание, опосредованное иммунокомплексами.

Таким образом, в качестве одного аспекта в данном изобретении раскрыт способ анализа/определения циркулирующих иммунокомплексов (ЦИК), образовавшихся in vivo, включающий эксклюзионную хроматографию образца, полученного от млекопитающего, которому было введено лекарственное средство по меньшей мере один раз, для определения массы/размера иммунокомплексов, необязательно вторую хроматографию, отличающуюся от ЭХ, и по меньшей мере один иммуноанализ, где иммунокомплекс определяют на основании корреляции размера иммунокомплекса и результата/считывания данных иммуноанализа.

Далее в качестве одного аспекта в данном изобретении раскрыт способ определения комплексов противолекарственное антитело-лекарственное средство (ПЛА-ЛС), образовавшихся in vivo, включающий эксклюзионную хроматографию образца, полученного от млекопитающего, которому было введено лекарственное средство по меньшей мере один раз, для определения массы/размера иммунокомплексов ПЛА-ЛС, и по меньшей мере один твердофазный иммуноферментный анализ для обнаружения противолекарственных антител, где иммунокомплекс определяют как низкомолекулярный комплекс на основании положительного твердофазного иммуноферментного анализа и массы от примерно 150 кДа до примерно 400 кДа, как комплекс средней молекулярной массы на основании положительного твердофазного иммуноферментного анализа и массы от примерно 400 кДа до примерно 1500 кДа или как высокомолекулярный комплекс на основании положительного твердофазного иммуноферментного анализа и массы от примерно 1500 кДа до примерно 7000 кДа.

В данном изобретении также раскрыто применение способа, раскрытого в данном изобретении, для определения корреляции с измененной фармакокинетикой, утратой или снижением эффективности, нейтрализацией природных аналогов, а также общими иммунными реакциями и реакциями гиперчувствительности, включающими сывороточную реакцию/реакцию гиперчувствительности типа III/заболевание, опосредованное иммунокомплексами.

Например, после введения лекарственного средства млекопитающему иммунная система этого млекопитающего может распознать введенное лекарственное средство как чужеродное и продуцировать противолекарственные антитела с целью нейтрализации введенного чужеродного вещества. Если лекарственное средство содержит элементы, эндогенные для млекопитающего, противолекарственные антитела могут быть также направлены против этого элемента лекарственного средства, и подобным образом также нацелены на эндогенный аналог у млекопитающего.

Такие события, как иммунный ответ/образование ПЛА/активация комплемента против введенного терапевтического лекарственного средства, могут привести к образованию иммунокомплексов. Образование иммунокомплексов (комплексов ПЛА-ЛС) может привести к измененным фармакокинетическим свойствам или клиническим последствиям, например, к синдромам, подобным сывороточной реакции.

Следующие свойства иммунокомплексов могут быть важными детерминантами индуцированных последующих эффектов:

- Размер комплекса

Образование комплексов большого размера может привести к усиленному клиренсу ретикулоэндотелиальной системой (РЭС).

Образование комплексов среднего размера может привести к фиксации комплемента с последующим отложением в ткани и к "сывороточной реакции".

Образование комплексов малого размера может не обладать выраженным эффектом.

- Заряд комплекса

Катионные иммунокомплексы могут быть отложены на мембранах/ассоциированы с мембранами клеток/тканей (с анионной клеточной поверхностью).

- Полярность комплекса

- Связывание или связывающая способность с C1q.

Таким образом, тщательное определение иммунокомплексов является предпосылкой для корреляции с эффектами in vivo (фармакокинетическими изменениями и/или токсикологическими эффектами).

Отдельная информация, например, о встречаемости противолекарственного антитела (ПЛА), тем не менее, не обеспечивает глубокую корреляцию с клинической картиной и измененной фармакокинетикой.

Количество и размер образовавшихся иммунокомплексов, таких как комплексы противолекарственное антитело-лекарственное средство (комплексы ПЛА-ЛС), зависит от нескольких параметров, например, от концентрации/соотношений, а также от эпитопа и валентности.

Размер комплекса является важной детерминантой клиренса комплекса или индукции побочных эффектов. В характерном случае комплексы большего размера выводятся ретикулоэндотелиальной системой, комплексы малого размера обычно не запускают воспаление, тогда как комплексы среднего размера могут фиксировать комплемент, и могут вызвать повреждение ткани.

Для глубокой оценки иммунного ответа, потенциально образующиеся иммунокомплексы следует определять в отношении их размера. Кроме того, если существует эндогенный аналог лекарственного средства, информация о том, обладают ли образующиеся ПЛА перекрестной реактивностью с этими молекулами, и составляют ли эндогенные аналоги также часть иммунокомплексов, является ценной информацией.

Информация может быть согласована с клинической картиной, такой как измененная фармакокинетика или побочные эффекты вследствие образования иммунокомплексов, и может обеспечить дополнительную информацию, объясняющую различия, например, субъектов, положительных по иммунокомплексам, без какого-либо воздействия и субъектов, положительных по иммунокомплексам, с измененной фармакокинетикой или клиническими последствиями, либо синдромы, подобные сывороточной реакции, только у некоторых субъектов, положительных по иммунокомплексам.

В целях обнаружения образования иммунокомплексов у млекопитающего, которому было введено лекарственное средство, и в целях определения образующихся иммунокомплексов необходим двухступенчатый способ.

Способ, раскрытый в данном изобретении, можно применять для определения любого иммунокомплекса, например, комплексов ПЛА-ЛС, а также аутоиммунокомплексов (аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, волчанка и т.д.).

Эксклюзионная хроматография

На первой стадии образовавшиеся иммунокомплексы разделяют в отношении их размера с целью определения предполагаемого числа компонентов в комплексе. Это может быть выполнено с помощью эксклюзионной хроматографии (ЭХ) и фракционирования (в одном воплощении изобретения аликвотирования) элюата.

Исходя из предположения, что противолекарственное антитело относится к классу IgG, и имеет молекулярную массу примерно 150 кДа, и что молекулярная масса терапевтических полипептидов находится в диапазоне от примерно 2,5 кДа (полипептидное лекарственное средство; полипептид, состоящий из 20 аминокислотных остатков) до примерно 250 кДа (лекарственное средство, представляющее собой антитело; полноразмерное терапевтическое антитело класса IgG, содержащее дополнительные слитые эффекторные полипептиды, или мультиспецифическое антитело) стехиометрический комплекс 1:1 противолекарственного антитела и лекарственного средства имеет молекулярную массу, составляющую по меньшей мере примерно 150 кДа в случае низкомолекулярного полипептидного лекарственного средства и вплоть до примерно 400 кДа в случае комплексного лекарственного средства, представляющего собой антитело.

Выбор времени фракционирования определяет информацию о разделении по размеру.

Образец (биологическая среда), который может представлять собой сыворотку, плазму (например, для обнаружения противолекарственного антитела) или синовиальную жидкость (как, например, при ревматоидных заболеваниях), фракционируют, используя эксклюзионную хроматографию. Эксклюзионная хроматография обеспечивает первую информацию: размер аналита (комплекса).

Индивидуальные фракции эксклюзионной хроматографии можно анализировать, используя вторую хроматографию по размеру, такую как разделение ионообменной хроматографией (ИЭХ), чтобы определить заряд комплекса, либо хроматографию с обращенной фазой (ОФ), либо ГФЛХ разделение, чтобы определить полярность комплекса.

Индивидуальные фракции эксклюзионной хроматографии можно анализировать на активность связывания комплемента.

Индивидуальные фракции эксклюзионной хроматографии можно также анализировать, используя твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

Твердофазный иммуноферментный анализ

Фракционирование элюата эксклюзионной хроматографии дает возможность мультиплексирования анализа ЭХ, поскольку для определения различных комплексов можно проводить различные иммуноанализы, такие как следующие анализы:

- ELISA мостикового типа ("классический скрининговый анализ ПЛА): обнаружение ПЛА во фракции более высокой молекулярной массы указывает на то, что ПЛА составляли часть фракции более высокой молекулярной массы;

- анализ комплексного типа: обнаружение комплексов ПЛА-ЛС, используя иммобилизацию, специфичную к лекарственному средству, и антивидовое обнаружение, представляет собой общий подход для моно