Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения

Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В данном документе описан способ отбора и получения мультиспецифичных групп с использованием транспептидазы, такой как сортаза А, в которых специфичности могут быть выбраны независимо друг от друга, и применение данного способа для получения новых мультиспецифичных антител с заданными свойствами.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Моноклональные антитела имеют большой терапевтический потенциал и играют важную роль в современной линейке медицинских продуктов. На протяжении последнего десятилетия значимой тенденцией в фармацевтической промышленности была разработка моноклональных антител (mAb) и слитых полипептидов с Fc антитела (слитые полипептиды с кристаллизуемым фрагментом) в качестве терапевтических агентов при различных клинических ситуациях, включающих онкологию, хронические воспалительные заболевания, трансплантацию, инфекционные заболевания, сердечно-сосудистую медицину или офтальмологические заболевания (Carter, J.P., Nature Reviews Immunology 6 (2006) 343-357; Chan, A.C. and Carter, J.P., Nature Reviews Immunology 10 (2010) 301-316).

Клиническая эффективность терапевтического антитела основывается, главным образом, на двух функциональных свойствах: i) специфичном в отношении мишени связывании, опосредованном доменом Fv, и ii) иммуноопосредованной эффекторной функции, такой как ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность), CDC (комплементзависимая цитотоксичность) и ADCP (антителозависимый клеточный фагоцитоз), которые опосредованы областью Fc антитела. Область Fc иммуноглобулина класса IgG содержит шарнирную область и два константных домена (СН2 и СН3). Область Fc также взаимодействует с неонатальным рецептором FcRn и, посредством этого, определяет период полувыведения антитела in vivo. Шарнирная область представляет собой область, в которой плечи молекулы антитела образуют Y-подобную структуру, обеспечивающую гибкость молекулы в данной точке.

Подкласс/подклассы IgG отличаются числом дисульфидных связей и длиной шарнирной области.

Эффекторные функции, ассоциированные с областью Fc антитела, отличаются в зависимости от класса и подкласса антитела и включают, например, связывание антитела через его область Fc со специфичным рецептором Fc (FcR) на клетке, что запускает разные биологические ответы (см., например, Jiang, X.-R., et al., Nature Reviews Drug Discovery 10 (2011) 101-110; Presta, L.G., Current Opinion in Immunology 20 (2008) 460-470).

Шарнирная область антитела или слитого полипептида или конъюгата, содержащего область Fc, участвует в по меньшей мере части функций антитела, таких как связывание антигена и эффекторные функции антитела, опосредованные областью Fc. В то время как связывание антигена (особенно двухвалентное авидное связывание антителом) зависит от гибкости, длины и пространственной ориентации конкретной/нативной шарнирной области, эффекторные функции, опосредованные областью Fc, зависят от класса и подкласса антитела. Функциональная одновалентность, наблюдаемая для некоторых человеческих антител lgG4, по сравнению с двухвалентностью других антител IgG представляет собой другой пример, демонстрирующий участие области Fc в антигенсвязывающих свойствах (Salfeld, J.G., Nature Biotechnology 12 (2007) 1369-1372; Presta, L.G., Current Opinion in Immunology 20 (2008) 460-470).

Levary, D.A., et al. сообщают о слиянии белок-белок, катализируемом сортазой A (PLOS ONE 6 (2011)). Конструирование антитела в одноцепочечном формате против рецептора эпидермального фактора роста и мечение лигированием белка, опосредованным сортазой А, описано Madej, М.Р., et al. (Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 1461-1470). Та, H.T., et al. описывают ферментативное мечение одноцепочечным антителом в качестве универсального подхода для направленной молекулярной визуализации и клеточной направленности при сердечно-сосудистых заболеваниях (Cir. Res. 109 (2011) 365-373). Рорр, М., et al. описывают белковую инженерию с получением и разрушением пептидных связей с использованием сортазы (Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 50 (2011) 5024-5032). В WO 2010/087994 описаны способы лигирования и их применения.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении описан способ предоставления высокоспецифичных терапевтических молекул с заданными свойствами для лечения заболевания, такого как рак, у пациента, нуждающегося в лечении, при этом терапевтическая молекула адаптирована к характеристикам заболевания пациента и/или к генотипу/фенотипу пациента.

Такая адаптация достигается получением молекулы с заданными свойствами, принимая во внимание генотип/фенотип клеток пациента, имеющих/пораженных заболеванием.

На первом этапе определяют генотип/фенотип клеток (например, присутствие и число/количество антигенов поверхности клетки, специфичных для заболевания), на которые предполагают оказать направленное воздействие терапевтической молекулы. Это может достигаться, например, методиками визуализации клеток, такими как иммуногистохимическое окрашивание (IHC, иммуногистохимия) клеток пациента, происходящих, например, из крови и/или материала биопсии, с использованием флуоресцентно меченых моноспецифичных (терапевтических или диагностических) антител. В качестве альтернативы, генотип/фенотип клеток можно анализировать после окрашивания мечеными терапевтическими или диагностическими антителами с использованием способов на основе FACS (флуоресцентная сортировка клеток). Для определения генотипа/фенотипа имеющих отношение к заболеванию клеток пациента также можно использовать методики визуализации in vivo, включающие оптическую визуализацию, молекулярную визуализацию, флуоресцентную визуализацию, биолюминисцентную визуализацию, MRI (магнитно-резонансная томография), PET (позитронно-эмиссионная томография), SPECT (однофотонная эмиссионная компьютерная томография), СТ (компьютерная томография) и прижизненную микроскопию. В зависимости от определенного генотипа/фенотипа клеток пациента, имеющих отношение к заболеванию, можно выбирать комбинацию направленно действующих/связывающих группировок с заданными свойствами и объединять их в терапевтической молекуле. Такая терапевтическая молекула может представлять собой, например, биспецифичное антитело.

Такие терапевтические молекулы с заданными свойствами i) будут высокоспецифичными, ii) будут иметь хорошую эффективность и iii) будут индуцировать меньше побочных эффектов по сравнению с традиционно выбираемыми терапевтическими средствами. Это может достигаться путем наделения терапевтической молекулы заданными свойствами улучшенного направленного действия и/или улучшенной доставки, например, для терапевтической загрузки в ее намеченное место действия.

Улучшенная доставка терапевтической молекулы к ее сайту действия, такому как, например, раковая клетка, может достигаться посредством повышенной/увеличенной селективности и/или специфичности терапевтической молекулы направленного действия по сравнению с традиционно выбираемыми терапевтическими молекулами. Терапевтическая молекула содержит по меньшей мере две группировки, которые специфично связываются с разными антигенами (например, с двумя разными поверхностными маркерами) или с разными эпитопами на том же самом антигене (например, два разных эпитопа на том же самом поверхностном маркере).

Повышенная селективность и/или специфичность терапевтической молекулы с заданными свойствами может достигаться одновременным связыванием обеих направленно действующих группировок с их соответствующими мишенями/эпитопами, т.е. она достигается посредством эффектов авидности. Особенно подходит комбинация двух связывающих группировок с аффинностью в отношении их соответствующих мишеней/эпитопов, варьирующей от низкой до средней. Кроме того, связывание вне мишени значительно снижается или даже может полностью устраняться.

Обнаружили, что могут быть предложены биспецифичные молекулы с заданными свойствами, обеспечивающие направленную доставку и связывание, с использованием реакции ферментативной конъюгации между первой связывающей группировкой, такой как связывающая группировка на основе домена дарпина, связывающая группировка на основе домена антикалина, связывающая группировка на основе домена scTCR, подобного фрагменту рецептора Т-клетки, связывающая группировка на основе домена VH верблюда, связывающая группировка на основе десятого домена фибронектина 3, связывающая группировка на основе домена тенасцина, связывающая группировка на основе домена кадгерина, связывающая группировка на основе домена ICAM, связывающая группировка на основе домена титина, связывающая группировка на основе домена GCSF-R (рецептор гранулоцитарного колониестимулирующего фактора), связывающая группировка на основе домена рецептора цитокина, связывающая группировка на основе домена ингибитора гликозидазы, связывающая группировка на основе домена супероксиддисмутазы или фрагмент антитела (фрагмент Fab или scFv), содержащий аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в его С-концевой области аминокислотной последовательности, и фрагментом в виде неполного одноплечего антитела (OA-Fc), который содержит тяжелую цепь полноразмерного антитела, образующую пару с когнатной полноразмерной легкой цепью, и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела с олигоглицином G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) на его N-конце, с использованием фермента сортазы А.

Обнаружили, что с использованием описанного здесь способа можно задавать свойства, например, биспецифичных антител, специфично направленных на два поверхностных маркера, находящихся на поверхности клетки, такой как раковая клетка. Поскольку специфичности связывания индивидуально предоставлены исходными компонентами, можно задавать свойства мультиспецифичной направленной доставки и связывания молекулы просто путем определения поверхностных маркеров, присутствующих на клетке, например, на раковой клетке, и конъюгирования соответствующих фрагментов антител, которые специфично связываются с данными поверхностными маркерами или их соответствующими лигандами, посредством ферментативной методики. Поскольку ферментативная конъюгация осуществляется ферментом сортазой А, образующееся биспецифичное антитело характеризуется присутствием аминокислотной последовательности LPX1TG ((SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком).

Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения мультиспецифичной связывающей молекулы, включающий стадию инкубирования

(i) первой связывающей группировки, содержащей аминокислотную последовательность LPX1TG ((SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков,

(ii) фрагмента антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела,

при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт,

при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела и

при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце,

и

(iii) фермента сортазы А,

и получения, посредством этого, мультиспецифичной связывающей молекулы.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения мультиспецифичной связывающей молекулы, включающий следующие стадии:

(i) определение маркеров поверхности клетки, присутствующих в образце, содержащем клетки, и i) выбор из них по меньшей мере первого маркера поверхности клетки и второго маркера поверхности клетки или ii) выбор из них совокупности маркеров поверхности клетки, соответствующих числу специфичностей связывания мультиспецифичной связывающей молекулы,

(ii) инкубирование (а) первой связывающей группировки, которая специфично связывается с первым маркером поверхности клетки или ее лигандом, и которая содержит аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, (б) фрагмента антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым маркером поверхности клетки или его лигандом, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) фермента сортазы А

и получение, посредством этого, мультиспецифичной связывающей молекулы.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ отбора по меньшей мере двух связывающих группировок из набора/библиотеки связывающих группировок, которые собираются в одну мультиспецифичную связывающую молекулу путем инкубирования (а) первой связывающей группировки, которая специфично связывается с эпитопом или антигеном, и которая содержит аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, (б) фрагмента антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым эпитопом или антигеном, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (гл равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) фермента сортазы А, для применения в качестве терапевтического агента. Такой агент имеет улучшенные свойства направленного действия/доставки.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения биспецифичного антитела, включающий стадию инкубирования

(i) фрагмента Fab антитела или scFv антитела, содержащего аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков,

(ii) фрагмента в виде неполного одноплечего антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела,

при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт,

при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и

при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце,

и

(iii) фермента сортазы А,

и получение, посредством этого, биспецифичного антитела.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения биспецифичного антитела, включающий следующие стадии:

(i) определение маркеров поверхности клетки, присутствующих в образце, содержащем клетки, и выбор из них по меньшей мере первого маркера поверхности клетки и второго маркера поверхности клетки,

(ii) инкубирование (а) фрагмента Fab антитела или scFv антитела, содержащего аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом фрагмент Fab антитела или scFv антитела специфично связывается с первым маркером поверхности клетки или его лигандом (б) фрагмента в виде неполного одноплечего антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым маркером поверхности клетки или его лигандом, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) фермента сортазы А

и получение, посредством этого, биспецифичного антитела.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения комбинации связывающих группировок для мультиспецифичной связывающей молекулы, включающий следующие стадии:

(i) определение специфичности связывания и/или селективности, и/или аффинности, и/или эффекторной функции, и/или периода полувыведения in vivo множества мультиспецифичных связывающих молекул, при этом в множестве мультиспецифичных связывающих молекул содержится каждая (возможная) комбинация связывающих группировок,

и

(ii) выбор мультиспецифичной связывающей молекулы с подходящей специфичностью связывания и/или селективностью, и/или аффинностью, и/или эффекторной функцией, и/или периодом полувыведения in vivo и, посредством этого, определение комбинации антигенсвязывающих сайтов.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ определения комбинации антигенсвязывающих сайтов, включающий следующие стадии:

(i) определение специфичности связывания и/или селективности, и/или аффинности, и/или эффекторной функции, и/или периода полувыведения in vivo множества биспецифичных антител, полученных объединением (а) каждого члена первого множества фрагментов Fab антитела или фрагментов scFv антитела, при этом каждый член содержит аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом фрагмент Fab или scFv антитела специфично связывается с первым эпитопом или антигеном, с (б) каждым членом из множества фрагментов в виде неполного одноплечего антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются когнатными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым эпитопом или антигеном, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и при этом полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (в) ферментом сортазой А

и

(ii) выбор биспецифичного антитела с подходящей специфичностью связывания и/или селективностью, и/или аффинностью, и/или эффекторной функцией, и/или периодом полувыведения in vivo и, посредством этого, определение комбинации антигенсвязывающих сайтов.

В одном воплощении связывающие группировки независимо друг от друга выбраны из следующих: связывающая группировка на основе домена дарпина, связывающая группировка на основе домена антикалина, связывающая группировка на основе домена scTCR, подобного фрагменту рецептора Т-клетки, связывающая группировка на основе домена VH верблюда, связывающая группировка на основе десятого домена фибронектина 3, связывающая группировка на основе домена тенасцина, связывающая группировка на основе домена кадгерина, связывающая группировка на основе домена ICAM, связывающая группировка на основе домена титина, связывающая группировка на основе домена GCSF-R, связывающая группировка на основе домена рецептора цитокина, связывающая группировка на основе домена ингибитора гликозидазы, связывающая группировка на основе домена супероксиддисмутазы или фрагменты антитела, подобные фрагментам Fab или scFv.

В одном воплощении всех аспектов мультиспецифичная связывающая молекула представляет собой биспецифичное антитело, и/или первая связывающая группировка представляет собой фрагмент Fab антитела или scFv антитела.

В одном воплощении объединение характеризуется инкубированием фрагмента Fab антитела или фрагмента scFv антитела и фрагмента антитела, содержащего тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела, с ферментом сортазой А.

В одном воплощении фрагмент Fab или фрагмент scFv антитела содержит аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков.

В одном воплощении тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела фрагмента в виде одноплечего антитела представляют собой когнатные цепи антитела, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образует антигенсвязывающий сайт, который специфично связывается со вторым поверхностным маркером, при этом тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через одну или более чем одну дисульфидную связь, образующую шарнирную область антитела, и полипептид области Fc тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m равен 2 или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность GnSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, с n, равным 1, 2 или 3) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 03, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность GGGSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 04, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность X2GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 05, где X1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность G_nSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 06, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, с n, равным 1, 2 или 3) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом Х3 представляет собой метку в виде аминокислотной последовательности.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент Fab антитела или scFv антитела содержит аминокислотную последовательность X2GSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 07, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в пределах 20 С-концевых аминокислотных остатков, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G, и при этом Х3 представляет собой метку в виде аминокислотной последовательности.

В одном воплощении всех аспектов полипептид области Fc тяжелой цепи антитела содержит два остатка глицина на его N-конце.

В одном воплощении всех аспектов фрагмент в виде одноплечего антитела содержит аминокислотную последовательность GGCPX4C (SEQ ID NO: 08) на N-конце его тяжелой цепи, при этом Х4 представляет собой S или Р.

В одном воплощении всех аспектов Х1 представляет собой Е.

Одним аспектом, как здесь описано, является описанная здесь мультиспецифичная связывающая молекула.

Одним аспектом является мультиспецифичная связывающая молекула, содержащая аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в одной из ее тяжелых цепей.

В одном воплощении мультиспецифичная связывающая молекула содержит аминокислотную последовательность G_nSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, с n, равным 1, 2 или 3) в одной из ее тяжелых цепей.

В одном воплощении мультиспецифичная связывающая молекула содержит аминокислотную последовательность G_nSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 09, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, где Х4 может представлять собой S или Р, с n, равным 1, 2 или 3) в одной из ее тяжелых цепей.

В одном воплощении мультиспецифичная связывающая молекула содержит аминокислотную последовательность X2GSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 10, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком, где Х4 может представлять собой S или Р) в одной из ее тяжелых цепей, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G.

Одним аспектом, как здесь описано, является биспецифичное антитело, полученное описанным здесь способом.

Одним аспектом является биспецифичное антитело, содержащее аминокислотную последовательность LPX1TG (SEQ ID NO: 01, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком) в одной из его тяжелых цепей.

В одном воплощении биспецифичное антитело содержит аминокислотную последовательность G_nSLPXUG (SEQ ID NO: 02, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, с n, равным 1, 2 или 3) в одной из его тяжелых цепей.

В одном воплощении биспецифичное антитело содержит аминокислотную последовательность G_nSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 09, где X1 может быть любым аминокислотным остатком, где Х4 может представлять собой S или Р, с n, равным 1, 2 или 3) в одной из его тяжелых цепей.

В одном воплощении биспецифичное антитело содержит аминокислотную последовательность X2GSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 10, где Х1 может быть любым аминокислотным остатком, где Х4 может представлять собой S или Р) в одной из его тяжелых цепей, при этом Х2 может быть любым аминокислотным остатком, за исключением G.

Одним аспектом, как здесь описано, является фармацевтическая композиция, содержащая мультиспецифичную связывающую молекулу, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение мультиспецифичной связывающей молекулы, как здесь описано, в изготовлении лекарственного средства.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения рака.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ лечения индивида, имеющего рак, включающий введение индивиду эффективного количества мультиспецифичной связывающей молекулы, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ разрушения раковых клеток у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества мультиспецифичной связывающей молекулы, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является фармацевтическая композиция, содержащая биспецифичное антитело, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение биспецифичного антитела, как здесь описано, в изготовлении лекарственного средства.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения рака.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ лечения индивида, имеющего рак, включающий введение индивиду эффективного количества биспецифичного антитела, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ разрушения раковых клеток у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества биспецифичного антитела, как здесь описано. В одном воплощении всех аспектов, как здесь описано, область Fc представляет собой человеческую область Fc или ее вариант.

В одном воплощении область Fc человеческого антитела принадлежит к человеческому подклассу lgG1 или человеческому подклассу lgG2, или человеческому подклассу lgG3, или человеческому подклассу lgG4.

В одном воплощении область Fc антитела представляет собой область Fc человеческого антитела человеческого подкласса lgG1 или человеческого подкласса lgG4.

В одном воплощении область Fc человеческого антитела содержит мутацию встречающегося в природе аминокислотного остатка по меньшей мере в одном из следующих положений аминокислот: 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 329 и/или 331 до другого остатка, где остатки в области Fc антитела пронумерованы согласно индексу EU (Европейсткий Союз) по Kabat.

В одном воплощении область Fc человеческого антитела содержит мутацию встречающегося в природе аминокислотного остатка в положении 329 и по меньшей мере одну другую мутацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка, выбранного из группы, содержащей аминокислотные остатки в положении 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 и 331, до другого остатка, где остатки в области Fc пронумерованы согласно индексу EU по Kabat. Замена данных конкретных аминокислотных остатков приводит к изменению эффекторной функции области Fc по сравнению с немодифицированной областью Fc (дикого типа).

В одном воплощении область Fc человеческого антитела имеет пониженную аффинность с человеческим FcγRIIIA и/или FcγRIIA, и/или FcγRI по сравнению с конъюгатом, содержащим соответствующую область Fc IgG дикого типа.

В одном воплощении аминокислотный остаток в положении 329 области Fc человеческого антитела заменен глицином или аргинином, или достаточно большим аминокислотным остатком для разрушения пролиновой слоистой структуры в области Fc.

В одном воплощении мутацией встречающегося в природе аминокислотного остатка в области Fc человеческого антитела является по меньшей мере одна из S228P, Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, P329G и/или P331S.

В одном воплощении мутацией является L234A и L235A, если область Fc антитела принадлежит к человеческому подклассу lgG1, или S228P и L235E, если область Fc антитела принадлежит к человеческому подклассу lgG4.

В одном воплощении область Fc антитела содержит мутацию P329G.

В одном воплощении область Fc антитела содержит мутацию T366W в полипептиде области Fc первой тяжелой цепи и мутации T366S, L368A и Y407V в полипептиде области Fc второй тяжелой цепи, где нумерация осуществляется согласно индексу EU по Kabat.

В одном воплощении область Fc антитела содержит мутацию S354C в полипептиде области Fc первой тяжелой цепи и мутацию Y349C в полипептиде области Fc второй тяжелой цепи.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящем описании и формуле изобретения нумерацией остатков в области Fc тяжелой цепи иммуноглобулина является нумерация согласно индексу EU по Kabat (Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242, прямо включенная сюда посредством ссылки).

Термин «изменение» обозначает мутацию, присоединение или делецию одного или более чем одного аминокислотного остатка в родительской аминокислотной последовательности, например, антитела или слитого полипептида, содержащего по меньшей мере часть области Fc, связывающуюся FcRn, с получением варианта антитела или слитого полипептида.

Термин «мутация аминокислот» обозначает модификацию аминокислотной последовательности родительской аминокислотной последовательности. Типичные модификации включают аминокислотные замены, вставки и/или делеции. В одном воплощении мутация аминокислоты представляет собой замену. Термин «мутации аминокислот в положении» обозначает замену или делецию определенного остатка или вставку по меньшей мере одного аминокислотного остатка рядом с определенным остатком. Термин «вставка рядом с определенным остатком» обозначает вставку в пределах одного-двух остатков рядом с ним. Вставка может быть N-концевой или С-концевой по отношению к определенному остатку.

Термин «аминокислотная замена» обозначает замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка в заданной родительской аминокислотной последовательности другим «заменяющим» аминокислотным остатком. Заменяющий остаток или остатки может быть «аминокислотным остатком, встречающимся в природе» (т.е. кодируемым генетическим кодом), и выбранным из группы, состоящей из следующих: аланин (Ala); аргинин (Arg); аспарагин (Asn); аспарагиновая кислота (Asp); цистеин (Cys); глутамин (Gln); глутаминовая кислота (Glu); глицин (Gly); гистидин (His); изолейцин (Ilе): лейцин (Leu); лизин (Lys); метионин (Met); фенилаланин (Phe); пролин (Pro); серии (Ser); треонин (Thr); триптофан (Тrр); тирозин (Туr) и валин (Val). В одном воплощении заменяющий остаток не является цистеином. Замена на один или более чем один аминокислотный остаток, не встречающийся в природе, также здесь охватывается определением аминокислотной замены. Термин «аминокислотный остаток, не встречающийся в природе» обозначает остаток, отличный от перечисленных выше аминокислотных остатков, встречающийся в природе, который способен ковалентно связываться со смежным(ми) аминокислотным(ми) остатком(ами) в полипептидной цепи. Примеры аминокислотных остатков, не встречающихся в природе, включают норлейцин, орнитин, норвалин, гомосерин, Aib (α-аминомасляная кислота) и другие аналоги аминокислотных остатков, такие как аналоги, описанные в Ellman, et al., Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336. Для получения таких аминокислотных остатков, не встречающихся в природе, можно использовать методики Noren, et al. (Science 244 (1989) 182) и/или Ellman, et al. (выше). Вкратце, данные методики включают химическую активацию супрессорной тРНК аминокислотным остатком, не встречающимся в природе, с последующей транскрипцией in vitro и трансляцией РНК. Не встречающиеся в природе аминокислоты также могут быть включены в пептиды посредством химического пептидного синтеза и последующего слияния данных пептидов с полипептидами, полученными рекомбинантно, такими как антитела или фрагменты антител.

Термин «вставка аминокислоты» обозначает включение по меньшей мере одного дополнительного аминокислотного остатка в заданную родительскую аминокислотную последовательность. В то время как вставка обычно будет состоять во вставке одного или двух аминокислотных остатков, в настоящей заявке рассматриваются большие «пептидные вставки», например, вставка от примерно трех до примерно пяти или даже вплоть до примерно десяти аминокислотных остатков. Вставленный(ные) остаток(тки) может(гут) быть встречающим(ми)ся в природе или не встречающим(ми)ся в природе, как определено выше.

Термин «делеция аминокислоты» обозначает удаление по меньшей мере одного аминокислотного остатка в заданном положении в аминокислотной последовательности.

В пределах данной заявки всякий раз, когда упоминается изменение аминокислоты, оно представляет собой преднамеренное изменение аминокислоты, а не случайную модификацию аминокислоты.

Термин «метка в виде аминокислотной последовательности» обозначает последовательность аминокислотных остатков, соединенных друг с другом пептидными связями, которая имеет свойства специфичного связывания. В одном воплощении метка в виде аминокислотной последовательности представляет собой аффинную метку или метку для очистки. В одном воплощении метка в виде аминокислотной последовательности выбрана из метки, содержащей Аrg, метки, содержащей His, метки Flag, метки 3xFlag, метки Strep, метки Nano, метки SBP, метки с-myc, метки S, кальмодулинсвязывающего пептида, целлюлозосвязывающего домена, хитинсвязывающего домена, метки GST (глутатион-S-трансфераза) или метки МВР (основной белок миелина). В одном воплощении метка в виде аминокислотной последовательности выбрана из SEQ ID NO: 11 (RRRRR) или SEQ ID NO: 12 (RRRRRR), или SEQ ID NO: 13 (HHHHHH)