Микрорнк - биомаркеры, указывающие на болезнь альцгеймера

Микрорнк - биомаркеры, указывающие на болезнь альцгеймера

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США 61/501,720, поданной 27 июня 2011 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Болезнь Альцгеймера - это прогрессирующее заболевание центральной нервной системы у человека. Оно проявляется деменцией, обычно у пожилых людей, а симптомы включают дезориентацию, потерю памяти, затрудненную речь, затруднения с вычислением или утрату зрительно-пространственных навыков, а также психиатрические проявления. Болезнь Альцгеймера связана с дегенерацией нейронов в нескольких областях мозга. Нейропатология болезни Альцгеймера характеризуется присутствием амилоидных бляшек, узлов нейрофибрилл, утратой синапсов и гибелью нейронов. Амилоидные бляшки являются результатом аномального уровня бета-амилоидного пептида, а узлы нейрофибрилл связаны с присутствием гиперфосфорилированного внутриклеточного тау-белка. Клинические симптомы обычно сначала проявляются как ухудшение памяти, а потом в форме нарушения других когнитивных функций и отклонений в поведении. Деменцией страдают приблизительно 24 миллиона человек в мире, причем большинство случаев (~60%) обусловлено болезнью Альцгеймера (Ferri C.P. et al. (2005) Lancet 366(9503):2112-2117). По оценкам более 5 миллионов американцев страдают болезнью Альцгеймера и предполагают, что к середине века это число возрастет до 14,3 миллионов, что соответствует увеличению на 350 процентов по сравнению с 2000 г. Рост числа пациентов с деменцией в развитом мире будет тяжелым бременем для общества и системы здравоохранения.

Ранняя диагностика является важным этапом лечения болезни Альцгеймера, поскольку ранняя постановка диагноза позволяет пациентам принимать лекарства, которые замедляют прогрессирование болезни Альцгеймера. В настоящее время болезнь Альцгеймера диагностируют с использованием комбинации клинических критериев, которые могут включать неврологическое обследование, оценку психического статуса и получение изображений мозга. Диагноз болезнь Альцгеймера часто ставят в результате исключения других видов деменции. По этим критериям может быть затруднительно поставить точный диагноз, особенно у пациентов с умеренной болезнью Альцгеймера или ранней стадией болезни Альцгеймера. Однозначный диагноз может быть поставлен путем исследования ткани головного мозга, однако его можно осуществить только после смерти субъекта. Соответственно, существует потребность в маркерах, указывающих на болезнь Альцгеймера, которые могли бы быть использованы в диагностических целях.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает новые микроРНК-биомаркеры, указывающие на болезнь Альцгеймера, которые можно применять для точной диагностики болезни Альцгеймера у субъекта. Эти биомаркеры включают miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d, miR-301a и miR-545. В некоторых вариантах осуществления способы включают обнаружение внеклеточных, циркулирующих микроРНК в пригодном образце, предпочтительно крови, плазмы, мочи или слюны.

Соответственно, в первом аспекте изобретения предложен способ диагностики болезни Альцгеймера у субъекта путем определения уровня по меньшей мере одной микроРНК в образце, содержащем циркулирующие микроРНК, взятом у субъекта, причем эта по меньшей мере одна микроРНК представляет собой miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d или их комбинации, и при этом отклонение уровня указанной по меньшей мере одной микроРНК от уровня у здорового субъекта, определенное по отношению к соответствующему контролю, указывает на то, что субъект страдает болезнью Альцгеймера. Например, в одном варианте осуществления способ включает определение уровня по меньшей мере одной микроРНК в образце, содержащем циркулирующие микроРНК, взятом у субъекта, причем эта по меньшей мере одна микроРНК представляет собой miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d или их комбинации, и при этом снижение уровня указанной по меньшей мере одной микроРНК относительно контроля указывает на то, что субъект страдает болезнью Альцгеймера. Способ может необязательно дополнительно включать диагностирование субъекта как страдающего или не страдающего болезнью Альцгеймера на основании уровня по меньшей мере одной микроРНК в указанном образце. В одном варианте осуществления способ может дополнительно включать определение корреляции отклонения уровня или уровней по меньшей мере одной микроРНК относительно соответствующего контроля с диагнозом болезнь Альцгеймера у субъекта.

В одном варианте осуществления способ включает определение уровня одной микроРНК, например, miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g или Let-7d, в указанном образце, причем отклонение уровня указанной микроРНК от уровня у здорового субъекта представляет собой снижение.

В другом варианте осуществления способ включает определение уровня двух или более микроРНК в указанном образце. В этом варианте способ может дополнительно включать определение уровня miR-301a, miR-545 или miR-301a и miR-545 в указанном образце. Например, по меньшей мере одна микроРНК может быть выбрана из miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d или их комбинаций, и необязательно по меньшей мере одна микроРНК может быть выбрана из miR-301a, miR-545 или miR-301a и miR-545. В одном варианте осуществления способ включает определение уровня одной из следующих комбинаций микроРНК: miR-545, let7g и miR-15b; miR-15b и miR-545; miR-301a, miR-545, let-7g и miR-15b; miR-191 и miR-15b; Let-7g и miR-15b; miR-191, miR-301a и miR-545; miR-301a, let-7g и miR-15b; и miR-191, miR-301a, miR-545 и miR-15b.

В одном конкретном варианте осуществления способ может включать определение уровней двух или более микроРНК в образце, содержащем циркулирующие микроРНК, взятом у субъекта, сравнение уровней указанных двух или более микроРНК в указанном образце с массивом данных, представляющих уровни тех же микроРНК у здоровых субъектов и у субъектов с болезнью Альцгеймера, и постановку диагноза отсутствия болезни Альцгеймера у субъекта на основании сравнения. В некоторых вариантах осуществления две или более микроРНК могут включать следующие комбинации: miR-545, let7g и miR-15b; miR-15b и miR-545; miR-301a, miR-545, let-7g и miR-15b; miR-191 и miR-15b; Let-7g и miR-15b; miR-191, miR-301a и miR-545; miR-301a, let-7g и miR-15b; и miR-191, miR-301a, miR-545 и miR-15b.

Способ может необязательно включать выполнение по меньшей мере одного вспомогательного теста для диагностики болезни Альцгеймера. В некоторых вариантах осуществления дополнительный тест может представлять собой один или более из следующих: краткая шкала оценки психического статуса (MMSE), тест mini-cog, тест по шкале оценки когнитивных функций при болезни Альцгеймера (ADAS-cog test) и тест на рисование часов. В качестве необязательного варианта или дополнения, дополнительное тестирование включает оценку по меньшей мере одного дополнительного биомаркера болезни Альцгеймера.

Способ может необязательно включать введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного средства для лечения болезни Альцгеймера. В некоторых вариантах осуществления средство для лечения болезни Альцгеймера может представлять собой Razadyne® (Разадин, галантамин), Exelon® (Экселон, ривастигмин) или Aricept® (Арицепт, донепезил). В одном конкретном варианте осуществления средство для лечения болезни Альцгеймера представляет собой донепезил или его фармацевтически приемлемую соль или эфир (например, донепезил гидрохлорид).

Уровень микроРНК можно определять любым пригодным способом. Например, микроРНК можно детектировать с использованием Гента, который специфично гибридизуется с данной микроРНК. В некоторых вариантах осуществления уровень микроРНК может быть определен с использованием методов амплификации. В одном варианте осуществления уровень микроРНк определяют с использованием количественной ПЦР.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу диагностики болезни Альцгеймера у субъекта, включающему измерение уровня по меньшей мере одной микроРНК в полученном из крови образце, взятом у субъекта, причем эта по меньшей мере одна микроРНК представляет собой miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d или их комбинацию, и определение корреляции разницы между уровнем у субъекта и соответствующим контролем с диагнозом болезни Альцгеймера у субъекта. В одном варианте способ может дополнительно включать измерение уровня miR-301a, miR-545 или miR-301a и miR-545 в указанном образце.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу мониторинга течения болезни Альцгеймера у субъекта путем определения уровня по меньшей мере одной микроРНК в первом образце, содержащем циркулирующую микроРНК, взятом у субъекта, определение уровня указанной по меньшей мере одной микроРНК во втором образце, содержащем циркулирующую микроРНК, взятом у субъекта, причем указанный второй образец берут позже первого образца, и сравнение уровней, определенных в первом образце, с уровнями, определенными во втором образце, причем указанные уровни указывают на прогрессирование болезни Альцгеймера, и при этом эта по меньшей мере одна микроРНК представляет собой miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d или их комбинации. В одном варианте способ может дополнительно включать измерение уровня miR-301a, miR-545, или miR-301a и miR-545 в указанных образцах.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения болезни Альцгеймера у субъекта путем определения уровня по меньшей мере одной микроРНК в образце, содержащем циркулирующие микроРНК, взятом у указанного субъекта, при этом отклонение уровня указанной по меньшей мере одной микроРНК от уровня у здорового субъекта, определенное по отношению к соответствующему контролю, указывает на то, что субъект страдает болезнью Альцгеймера; и в случае обнаружения отклонения уровня по меньшей мере одной микроРНК введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей средство для лечения болезни Альцгеймера. В одном варианте осуществления указанная по меньшей мере одна микроРНК представляет собой miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d или их комбинации. Способ может необязательно дополнительно включать определение уровня miR-301a, miR-545 или miR-301a и miR-545 в указанном образце.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения субъекта, страдающего болезнью Альцгеймера путем идентификации субъекта, страдающего болезнью Альцгеймера, такого что уровень по меньшей мере одной микроРНК в образце, содержащем циркулирующие микроРНК, взятом у субъекта, отличается (например, понижен) от соответствующего контроля, и введение субъекту терапевтически эффективного количества средства для лечения болезни Альцгеймера. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна микроРНК представляет собой miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d или их комбинации. Способ может необязательно включать идентификацию субъекта, у которого уровень miR-301a, miR-545 или miR-301a и miR-545 в указанном образце также отличается (например, понижен) от соответствующего контроля. В этих аспектах средство для лечения болезни Альцгеймера может представлять собой Razadyne® (Разадин, галантамин), Exelon® (Экселон, ривастигмин) или Aricept® (Арицепт, донепезил). В одном примере осуществления средство для лечения болезни Альцгеймера представляет собой донепезил или его фармацевтически приемлемую соль или эфир (например, донепезил гидрохлорид).

В другом аспекте настоящего изобретения предложен набор для диагностики болезни Альцгеймера у субъекта, включающий агент, селективно детектирующий присутствие по меньшей мере одной микроРНК в образце, содержащем циркулирующие микроРНК, взятом у субъекта, причем эта по меньшей мере одна микроРНК представляет собой miR-191, miR-15b, miR-142-3p, Let-7g, Let-7d или их комбинации, и инструкции по определению уровня указанной по меньшей мере одной микроРНК, при этом отклонение уровня указанной по меньшей мере одной микроРНК от уровня у здорового субъекта, определенное по отношению к соответствующему контролю, указывает на то, что субъект страдает болезнью Альцгеймера. Такой набор может дополнительно содержать агент, селективно детектирующий присутствие по меньшей мере одной дополнительной микроРНК в указанном образце, причем указанная дополнительная микроРНК представляет собой miR-301a, miR-545 или miR-301a и miR-545. В некоторых вариантах осуществления агент гибридизуется с микроРНК.

В некоторых вариантах осуществления способов и наборов, описанных в настоящем документе, субъект может представлять собой млекопитающее, например человека.

В описанных здесь способах и наборах отклонение уровня по меньшей мере одной микроРНК относительно соответствующего контроля может быть определено путем исполнения программного алгоритма классификации.

В некоторых вариантах осуществления способов и наборов образец может представлять собой физиологическую жидкость, например кровь, лимфу, мочу или слюну. Образец может представлять собой образец, не содержащий клеток, и/или образец, не содержащий микровезикул. В одном варианте осуществления образец представляет собой плазму. В другом варианте осуществления образец представляет собой сыворотку.

В некоторых вариантах осуществления способов и наборов, в которых выбирают или применяют одну микроРНК, указанная микроРНК представляет собой (a) микроРНК, отличную от miR-191, (b) микроРНК, отличную от miR-15b, (c) микроРНК, отличную от miR-142-3p, (d) микроРНК, отличную от Let-7g, и/или (e) микроРНК, отличную от Let-7d.

В некоторых вариантах осуществления способов и наборов, в которых указанный образец представляет собой спинно-мозговую жидкость, микроРНК представляет собой (a) микроРНК, отличную от miR-15b, и/или (b) микроРНК, отличную от miR-191.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР И ТАБЛИЦ

Фигуры 1A и 1B: Графики рассеяния нормированной экспрессии микроРНК из Группы 1 (20 пациентов с болезнью Альцгеймера (AD, БА) или умеренными когнитивными нарушениями (MCI, ЛКН) (11 AD; 9 MCI) и 20 пациентов нормального контроля (без заболевания, НК)), определенной с использованием теста микроРНК nCounter.

Фигура 2: Графики рассеяния значений линейных кратных изменений, нормированных по средним значениям НК (нормального контроля), для отдельных кандидатных микроРНК-биомаркеров, полученных в Группе 1 (20 пациентов с БА или ЛКН и 20 пациентов НК) с использованием ОТ-кПЦР TaqMan.

Фигура 3: Графики рассеяния значений линейных кратных изменений, нормированных по средним контрольным значениям для отдельных кандидатных микроРНК-биомаркеров, полученных в Группе 2 (20 пациентов с БА и 17 пациентов НК) с использованием ОТ-кПЦР TaqMan.

Таблица 1: Доступные сведения о пациентах из Группы 1, включая диагноз, возраст, пол, баллы MMSE и число посещений, полученные от PrecisionMed, Inc.

Таблица 2: Последовательности и номер доступа в базе miRBASE микроРНК-биомаркеров и микроРНК, использованных для нормировки.

Таблица 3: Корреляция средних значений кратных изменений для кандидатных микроРНК-биомаркеров между платформами Nanostring и TaqMan для образцов Группы 1 (20 БА или ЛКН (11 БА; 9 ЛКН) и 20 НК).

Таблица 4: Данные об относительном значении Ct, полученные путем кПЦР TaqMan с использованием подмножества образцов Группы 1 (11 БА и 20 НК); данные использовали для получения сигнатурных профилей микроРНК-биомаркеров, позволяющих отличать пациентов с БА от пациентов НК.

Таблица 5: Доступные сведения о пациентах из Группы 2, включая диагноз, возраст, пол, баллы MMSE и число посещений, полученные от PrecisionMed, Inc.

Таблица 6: Корреляция средних значений кратных изменений (нормированных по средним контрольным значениям) для кандидатных микроРНК-биомаркеров между Группой 1 и Группой 2, полученных с использованием исследования микроРНК методом ОТ-кПЦР TaqMan.

Таблица 7: Данные об относительном значении Ct, полученные путем кПЦР TaqMan с использованием образцов Группы 2 (20 БА и 17 НК), которые использовали в качестве входных данных для алгоритма предсказания статуса пациентов с БА и НК с использованием сигнатур, полученных по данным Группы 1 (Таблица 4).

Таблица 8A-8C: Сигнатуры кандидатных микроРНК-биомаркеров, указывающие на болезнь Альцгеймера.

Таблица 9A-9B: Точность, специфичность, чувствительность и AUC (площадь под кривой) для сигнатур микроРНК-биомаркеров с точностью >75%.

Таблица 10: Точность, специфичность, чувствительность и AUC (площадь под кривой) для сигнатурных комбинаций 8 микроРНК с использованием образцов Группы 2 для предсказания.

Таблица 11: Точность, специфичность, чувствительность и AUC (площадь под кривой) для отдельных микроРНК с использованием образцов Группы 2 для предсказания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

1. Введение

Настоящее изобретение обеспечивает новые микроРНК-биомаркеры, указывающие на болезнь Альцгеймера, которые можно применять для точной диагностики болезни Альцгеймера у субъекта. Дополнительно предложены способы мониторинга течения болезни Альцгеймера у субъекта, способы лечения субъекта с болезнью Альцгеймера и наборы для диагностики болезни Альцгеймера. В некоторых вариантах осуществления способы включают детектирование внеклеточных, циркулирующих микроРНК в пригодном образце, предпочтительно крови, плазме, сыворотке, моче или слюне.

2. Определения

Перед подробным описанием настоящего изобретения ниже приведены определения некоторых терминов, используемых в данном тексте. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют значение, принятое среди специалистов в соответствующей области.

Применение терминов единственного и множественного числа, а также аналогичных обозначений в контексте описания настоящего изобретения (в частности, в контексте приведенной ниже формулы) следует понимать как включающее форму единственного и множественного числа, если не указано иное или если контекст явно не подразумевает обратного. Термины “содержащий», “имеющий”, “включающий” и “заключающий в себе” следует понимать как неограничивающие термины (т.е. означающие “включающий, но не ограниченный перечисленным”), если не указано обратное. Указание диапазонов значений в данном тексте служит исключительно упрощенным способом конкретного перечисления каждого отдельного значения, попадающего в этот диапазон, если в тексте не указано иное, каждое отдельное значение включено в описание так, как если бы оно было конкретно приведено.

Термин “субъект” включает животных, которые могут страдать от деменции или могут быть поражены деменцией, связанной с нарушением ЦНС, включая нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, или любое нарушение, включающее, прямо или опосредованно, болезнь Альцгеймера. Примеры субъектов включают млекопитающих, например людей, приматов, не являющихся людьми, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных, не являющихся людьми. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека, например человека, страдающего от деменции, ассоциированной с болезнью Альцгеймера, подверженного риску возникновения деменции, ассоциированной с болезнью Альцгеймера, или который потенциально может страдать от деменции, ассоциированной с болезнью Альцгеймера.

Термин “лечить” в данном тексте означает облегчать, снижать или ослаблять по меньшей мере один симптом заболевания у субъекта. Например, применительно к болезни Альцгеймера термин “лечить” включает облегчение, снижение или ослабление нарушения когнитивных функций (такого, как нарушение памяти и/или ориентации), или нарушения глобальной функциональности (общей функциональности, включая виды активности повседневной жизни) и/или замедление или обращение прогрессирующих общих или когнитивных нарушений. Соответственно, термин “лечить” включает также задержку или предотвращение начала заболевания или симптома заболевания до его клинического проявления и/или снижение риска развития или ухудшения симптома заболевания.

“Терапевтически эффективное количество” терапевтического агента или содержащих его комбинаций представляет собой количество, достаточное для лечения заболевания у субъекта. Например, в случае средства для лечения болезни Альцгеймера терапевтически эффективное количество может представлять собой количество, для которого показано, что оно обеспечивает наблюдаемый полезный терапевтический эффект по сравнению с клиническим фоном наблюдаемых признаков и симптомов болезни Альцгеймера.

Термин “примерно” или “приблизительно” обычно означает отклонение в пределах 5% или, более предпочтительно, в пределах 1% от данного значения или диапазона.

3. МикроРНК-биомаркеры болезни Альцгеймера

Настоящее изобретение относится к микроРНК (“miRNA”), представляющим собой биомаркеры, присутствие которых в образцах, взятых у субъектов с болезнью Альцгеймера, может отличаться от присутствия у субъектов, являющихся «нормальными», т.е. у тех, которые не страдают болезнью Альцгеймера. Присутствие микроРНК-биомаркера или набора микроРНК-биомаркеров может различаться в образцах, если установлено, что различие в уровнях экспрессии микроРНК-биомаркера или набора микроРНК-биомаркеров в указанных образцах статистически значимо. Обычные критерии статистической значимости включают, но не ограничиваясь перечисленными: t-критерий, вариационный анализ ANOVA, критерий Краскела-Уоллиса, критерий Уилкоксона, критерий Манна-Уитни и соотношение неравенства. МикроРНК-биомаркеры отдельно или в комбинации можно применять для обеспечения меры относительного риска того, что субъект страдает или не страдает болезнью Альцгеймера.

МикроРНК представляют собой маленькие некодирующие РНК, которые участвуют в регуляции экспрессии генов посредством различных механизмов, включая подавление трансляции. МикроРНК исходно транскрибируются с ДНК как длинные первичные микроРНК транскрипты (“pri-miRNAs”, первичная микроРНК), размер которых варьирует от сотен до тысяч нуклеотидов. В ядре происходит процессинг первичной микроРНК с участием комплекса ферментов Drosha-DGCR8, в результате чего образуется предшественник микроРНК, имеющий структуру петля-стебель (“pre-miRNA”, пре-микроРНК). Пре-микроРНК транспортируется белком экспортином 5 в цитоплазму, где ее расщепляет фермент Dicer, в результате чего образуется зрелая (функциональная) микроРНК. В геноме человека закодировано более 1300 микроРНК, которые собраны в базе “miRBase: The microRNA Database” (http://www.mirbase.org/). Есть информация об экспрессии микроРНК в большом количестве различных типов клеток и тканей, а также во внеклеточных структурах, например в биологических жидкостях.

МикроРНК-биомаркеры болезни Альцгеймера были обнаружены в результате сравнения уровня экспрессии микроРНК в биологических образцах, взятых у субъектов, страдающих болезнью Альцгеймера, с образцами, взятыми у субъектов, являющихся «нормальными», т.е. субъектов, которые не страдают болезнью Альцгеймера, и идентификации микроРНК, которые представлены по-разному. Таким образом было идентифицировано семь по-разному представленных микроРНК-биомаркеров, которые неожиданно оказались указывающими на болезнь Альцгеймера в случае изменения в плазме: miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a, и miR-545 (см. Таблицу 2). Теперь эти микроРНК-биомаркеры можно применять для определения статуса субъекта в отношении болезни Альцгеймера, например субъекта, статус которого в отношении болезни Альцгеймера исходно не известен или у которого подозревают наличие болезни Альцгеймера. Это может быть выполнено путем определения уровня одной или более из miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a и miR-545 или их комбинаций в биологическом образце, взятом у субъекта. Отличие уровня одного или более из этих микроРНК-биомаркеров по сравнению с уровнем в биологическом образце, взятом у здорового субъекта, указывает на то, что субъект страдает болезнью Альцгеймера.

Субъект, у которого определено отклонение уровня одного или большего числа микроРНК-биомаркеров от здорового субъекта, возможно страдает болезнью Альцгеймера, включая раннюю стадию болезни Альцгеймера, умеренную или переходную стадию болезни Альцгеймера или тяжелую или позднюю стадию болезни Альцгеймера. В одном варианте осуществления уровень одного или большего числа микроРНК-биомаркеров можно применять для диагностики болезни Альцгеймера у субъекта с симптомами, характерными для ранней стадии болезни Альцгеймера, также известной как продромальная болезнь Альцгеймера. У субъектов с ранней стадией болезни Альцгеймера балл MMSE обычно составляет 24-30. Часто встречаются жалобы на умеренную потерю памяти и снижение способности выполнять сложные операции со стороны самих пациентов, их партнеров или ухаживающих за ними лиц.

В другом варианте осуществления уровень одного или большего числа микроРНК-биомаркеров можно применять для диагностики болезни Альцгеймера у субъекта с симптомами, характеризующимися как “снижение когнитивных способностей средней тяжести”, также называемое “умеренной” или “промежуточной” болезнью Альцгеймера. Снижение когнитивных способностей средней тяжести характеризуется большими провалами в памяти и началом нарушения когнитивных функций. На этой стадии показана некоторая помощь в повседневной деятельности.

В другом варианте осуществления уровень одного или большего числа микроРНК-биомаркеров можно применять для диагностики болезни Альцгеймера у субъекта с симптомами, характерными для «тяжелого снижения когнитивных функций», также называемого “умеренной” или “промежуточной” болезнью Альцгеймера. При тяжелых нарушениях когнитивных функций усугубляются проблемы с памятью и могут возникнуть значительные изменения личности. Пораженным лицам обычно требуется серьезная помощь в выполнении обычных повседневных дел.

В другом варианте осуществления уровень одного или большего числа микроРНК-биомаркеров можно применять для диагностики болезни Альцгеймера у субъекта с симптомами, характерными для “очень тяжелого снижения когнитивных функций”, также называемого «тяжелой» болезнью Альцгеймера или «поздней стадией» болезни Альцгеймера. Поздняя стадия болезни Альцгеймера или очень тяжелое снижение когнитивных функций является последней стадией заболевания. Субъекты обычно теряют способность реагировать на окружение, способность говорить и, наконец, способность контролировать движение (см., например, http://www.alz.org).

В другом варианте осуществления уровень одного или большего числа микроРНК-биомаркеров можно применять для диагностики болезни Альцгеймера у субъекта с баллом по шкале MMSE от 0 до 26, например, с баллом MMSE, равным 0-10, с баллом MMSE, равным 0-20, с баллом MMSE, равным 0-26, и т.д. “MMSE” обозначает краткую шкалу оценки психического статуса, используемую среди специалистов по оценке когнитивных способностей. В ходе теста MMSE врач или другой медицинский специалист задает пациенту ряд вопросов, направленных на оценку диапазона обычных психических навыков. Часто задаваемые вопросы включают, например, запоминание или повторение названий обычных объектов, указание года, даты, времени года, дня недели, счет в обратом порядке от ста с шагом 7, произнесение по буквам в обратном порядке слова “world” (мир), именование показываемых исследователем обычных объектов, указание расположения кабинета исследователя, повторение обычных фраз после произнесения их исследователем, копирование рисунка двух сцепленных форм и выполнение серии инструкций из трех частей (например, взять лист бумаги, согнуть пополам и положить на пол). Максимальный балл по шкале теста MMSE составляет 30 очков. Обычно считают, что пациенты с оценкой 27-30 по шкале MMSE не имеют нарушения когнитивных функций, что пациенты с оценкой 21-26 по шкале MMSE имеют легкие когнитивные нарушения, что пациенты с оценкой 11-20 по шкале MMSE имеют умеренные (moderate) когнитивные нарушения, а пациенты с оценкой 0-10 по шкале MMSE имеют тяжелые когнитивные нарушения. В некоторых вариантах осуществления пациентов считают страдающими болезнью Альцгеймера на поздней стадии (средней тяжести или тяжелой).

В одном варианте осуществления уровень одного или большего числа микроРНК-биомаркеров можно применять для мониторинга течения болезни Альцгеймера у субъекта. Статус (состояние) болезни Альцгеймера у субъекта может меняться с течением времени. Например, со временем болезнь может улучшаться или ухудшаться (усугубляться). При таком улучшении или ухудшении уровень одного или большего числа микроРНК-биомаркеров, определяемый во взятых у пациента образцах, может меняться. Например, уровень одной или более из miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a и/или miR-545 снижается при развитии болезни Альцгеймера. Соответственно, течение болезни Альцгеймера можно мониторировать путем определения уровня одного или большего числа микроРНК-биомаркеров в первом образце, взятом у субъекта, и определение уровня одного или большего числа микроРНК-биомаркеров во втором образце, взятом у субъекта, где второй образец взят позже, чем первый образец. Уровни во втором образце по отношению к уровням в первом образце являются показателем прогрессирования заболевания. Например, снижение уровня одной или более из miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a и/или miR-545 от первого образца ко второму образцу указывает на то, что у субъекта развилась болезнь Альцгеймера, или на то, что заболевание ухудшилось. И наоборот, повышение уровня одной или более из miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a и/или miR-545 от первого образца ко второму образцу указывает на улучшение заболевания. В одном варианте осуществления один или большее число микроРНК-биомаркеров представляют собой miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p и их комбинаций.

Имеет ли место отклонение уровня микроРНК-биомаркера в биологическом образце, взятом у субъекта, от уровня микроРНК-биомаркера у здорового субъекта, можно определить путем сравнения уровня микроРНК-биомаркера в указанном образце, взятом у исследуемого субъекта, с соответствующим контролем. Специалист сможет выбрать подходящий контроль для данного способа анализа (теста). Например, соответствующий контроль может представлять собой биологический образец, взятый у известного субъекта, например субъекта, о котором известно, что он является нормальным (т.е. не страдает болезнью Альцгеймера), или субъекта, о котором известно, что он страдает болезнью Альцгеймера. В случае, когда соответствующий образец берут у здорового субъекта, статистически значимое отклонение уровня микроРНК-биомаркера у исследуемого субъекта относительно соответствующего контроля указывает на то, что субъект страдает болезнью Альцгеймера. В случае, когда соответствующий образец берут у субъекта, о котором известно, что он страдает болезнью Альцгеймера, уровни, сравнимые с или более низкие, чем в таком контроле, являются показателем болезни Альцгеймера с учетом разницы в уровнях для образцов, взятых у здорового субъекта. В одном варианте осуществления отклонение уровня микроРНК-биомаркера представляет собой снижение. Соответствующий контроль может также представлять собой эталонный стандарт. Эталонный стандарт служит эталонным уровнем для сравнения, при котором исследуемые образцы сравнивают с эталонным стандартом с целью установления статуса субъекта по болезни Альцгеймера. Эталонный стандарт может представлять уровень одного или большего числа микроРНК-биомаркеров у известного субъекта, например субъекта, о котором известно, что он является нормальным (т.е. не страдает болезнью Альцгеймера), или субъекта, о котором известно, что он страдает болезнью Альцгеймера. Аналогично, эталонный стандарт может представлять уровень одного или большего числа микроРНК-биомаркеров в популяции известных субъектов, например популяции субъектов, о которых известно, что они являются нормальными (здоровыми), или в популяции субъектов, о которых известно, что они страдают болезнью Альцгеймера.

Эталонный стандарт может быть получен, например, путем объединения образцов от множества индивидов и определения уровня микроРНК-биомаркера в объединенных образцах, что позволяет получить стандарт по усредненной популяции. Такой эталонный стандарт представляет средний уровень микроРНК-биомаркера в популяциях индивидов. Также может быть получен эталонный стандарт, например, путем усреднения уровня микроРНК-биомаркера, присутствие которого было определено в отдельных образцах, взятых у множества лиц. Такой стандарт также представляет средний уровень микроРНК-биомаркера в популяции лиц. Эталонный стандарт также может представлять собой набор значений, каждое из которых представляет собой уровень микроРНК-биомаркера у известного субъекта в популяции лиц. В некоторых вариантах осуществления может быть осуществлено сравнение исследуемых образцов с таким набором значений, чтобы установить статус субъекта по болезни Альцгеймера. В некоторых вариантах осуществления эталонный стандарт представляет собой абсолютное значение. В таких вариантах осуществления возможно сравнение исследуемых образцов с абсолютным значением с целью определения статуса субъекта по болезни Альцгеймера. В одном варианте осуществления сравнение уровня одной или большего числа микроРНК в образце с соответствующем контролем может быть выполнено путем исполнения программного алгоритма классификации. Специалист легко сможет представить дополнительные соответствующие контроли, которые могут быть подходящими в зависимости от рассматриваемого способа анализа. Упомянутые выше соответствующие контроли представляют собой примеры и не являются ограничивающими.

В целом, снижение уровня одной или более из miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a и/или miR-545 в биологическом образце, полученном у субъекта, относительно соответствующего контроля, представляющего уровень одной или более из miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a и/или miR-545 соответственно у здорового субъекта, указывает на то, что субъект страдает болезнью Альцгеймера. В случаях, когда соответствующий контроль представляет уровень микроРНК-биомаркеров у субъекта, страдающего болезнью Альцгеймера, обычно уровни одной или более из miR-191, miR-15b, let-7d, let-7g, miR-142-3p, miR-301a и/или miR-545, сравнимые или более низкие, чем уровни такого контроля, указывают на болезнь Альцгеймера.

В некоторых случаях, когда у исследуемого субъекта определяют уровни двух или более микроРНК-биомаркеров, может наблюдаться снижение уровня одного или большего числа микроРНК-биомаркеров, при отсутствии изменения или повышении уровня одного или большего числа микроРНК-биомаркеров относительно соответствующего контроля. В таких примерах различие в уровне одного или большего числа микроРНК-биомаркеров относительно соответствующего контроля, представляющего уровень микроРНК-биомаркеров у здорового субъекта, указывает на то, что исследуемый субъект страдает болезнью Альцгеймера. Определение такого различия можно выполнять с помощью алгоритма классификации, описанного в настоящем тексте.

4. Биологические образцы

Уровень экспрессии одного или большего числа микроРНК-биомаркеров может быть определен во взятом у субъекта биологическом образце. Взятый у субъекта образец представляет собой образец, происходящий от субъекта. Такой образец после взятия у субъекта может быть подвергнут дальнейшей обработке. Например, из образца может быть выделена РНК. В указанном примере выделенная из образца РНК представляет собой также и взятый у субъекта образец . A биологический образец, подходящий для определения уровня одного или большего числа микроРНК-биомаркеров, может быть получен по существу из любого источника, так как было показано, что экспрессия микроРНК происходит в клетках, тканях и жидкостях всего организма. При этом в одном из аспектов настоящего изобретения уровни одного или более биомаркера, указывающего на болезнь Альцгеймера, могут быть определены в образце, взятом у субъекта неинвазивным путем. Существующие биомаркеры болезни Альцгеймера (например, Aβ_1-42, тау-белок, т.д.) часто измеряют в образце, полученном из спинномозговой жидкости (СМЖ) или из тканей головного мозга. СМЖ чаще всего получают с помощью люмбальной пункции, которая представляет собой болезненную процедуру, связанную с факторами риска, в том числе кровотечением в спинномозговой канал, постпункционной головной болью и инфекцией. Обнаружение биомаркеров в образце ткани головного мозга в настоящее время нецелесообразно для диагностики болезни Альцгеймера у живого субъекта и используется в основном для посмер