2639519 - Комбинации элементов экспрессионного вектора, новые способы получения клеток-продуцентов и их применение для рекомбинантного получения полипептидов

Комбинации элементов экспрессионного вектора, новые способы получения клеток-продуцентов и их применение для рекомбинантного получения полипептидов

Иллюстрации

Показать все

Представлены способ селекции рекомбинантных клеток млекопитающих, способ получения антитела, экспрессионный вектор и его применение. Способы включают трансфекцию клеток млекопитающего экспрессионным вектором, содержащим

- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и последовательность терминатора hGT, и

- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и последовательность терминатора hGT,

где первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в одном направлении, и где указанный экспрессионный вектор дополнительно содержит селекционный маркер, и получение множества рекомбинантных клеток млекопитающего с последующей селекцией из этого множества единичных рекомбинантных клеток млекопитающего. Изобретения позволяют получать стабильные антитела. 5 н и22 з.п.ф-лы, 15 ил.

Реферат

В данном документе приведены новые комбинации элементов экспрессионного вектора, таких как промотор, поли(А)-сигнальная последовательность, терминатор транскрипции, структуры экспрессионного вектора, их комбинации, а также новые способы получения линий клеток-продуцентов, такие как новые, способы трансфекции и селекции, а также применение данных экспрессионных векторов и линий клеток-продуцентов для рекомбинантного получения интересующих полипептидов.

Предшествующий уровень техники

Уровень транскрипции гена может оказывать сильное влияние на его уровень экспрессии и таким образом определять продуктивность клетки. В основном он обусловлен тремя элементами вектора: промотором, поли(А)-сигнальной последовательностью и (если присутствует) терминатором транскрипции.

Нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, обычно содержит лидерную последовательность (сигнальную

последовательность) (приблизительно 57 п. н./19 а.к.), удаляемую при созревании белка, вариабельный участок, VH (приблизительно 350 п. н./115 а.к.), и константный участок, СН (приблизительно 990 п. н./330 а.к.). Нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, обычно состоит из лидерной последовательности (приблизительно 66 п. н./22 а.к.), которая удаляется при созревании белка, вариабельного участка, VK или VL (приблизительно 350 п. н./115 а.к.) и константного участка, CK или CL (приблизительно 321 п. н./107 а.к.).

Рекомбинантное получение антител в эукариотических клетках обычно включает создание экспрессионных систем (см., McCafferty, J., et al., (eds.), Antibody Engineering, A Practical Approach., IRL Press (1997)). При разработке систем экспрессии антител создают экспрессионную кассету, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь, фланкированную промотором и участком полиаденилирования (поли(А)). Также создают экспрессионную кассету тяжелой цепи, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь, фланкированную промотором и участком поли(А). Экспрессионная кассета тяжелой цепи может быть скомбинирована с экспрессионной кассетой легкой цепи в единый вектор, содержащий экспрессионный кассеты как тяжелой, так и легкой цепи, или кассеты могут быть встроены в два различных вектора.

Молекулы ДНК-кассет иммуноглобулинов, конструкты монотел, способы их получения и применения описаны в US 7,053,202. В US 5,168,062 описаны трансфекционные вектора и микроорганизмы, содержащие регуляторную последовательность ДНК предраннего промотора цитомегаловируса. Фрагмент ДНК, содержащий промоторный участок фактора элонгации-1α полипептидной цепи человека, его основная последовательность и экспрессионные плазмиды, содержащие фрагмент ДНК, имеющий высокую совместимость с широким рядом хозяйских клеток с высокой экспрессионной способностью, описан в US 5,225,348. В US 5,266,491 описаны экспрессионные плазмиды, содержащие ориджин репликации SV40 и фрагмент ДНК, содержащий промоторный участок для фактора элонгации-1α полипептидной цепи человека. Рекомбинантные соединения ДНК и экспрессия полипептидов, таких как tPA описаны в US 5,122,458. В US 7,422,874 описан экспрессионный вектор для животных клеток.

Sanna Pietro, Р., описывает экспрессию Fab-фрагментов антитела и целый иммуноглобулин в клетках млекопитающих (Meth. Mol. Biol. 178 (2002) 389-395). Библиотека клеточного дисплея для генного клонирования вариабельных участков антител человека к поверхностному антигену вируса гепатита описана в Higuchi, K., et al. (J. Immunol. Meth. 202 (1997) 193-204). Kim, D., et al., описывают улучшенные экспрессионные системы млекопитающих, полученные за счет манипулирования участками терминации транскрипции (Biotechnol. Progress 19 (2003) 1620-1622). Руководство по клеточному инженированию для получения моноклональных антител описано Costa, R.A., et al. (Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 74 (2010) 127-138). Kim, D.W., et al., описывают применение промотора фактора элонгации 1 альфа человека в качестве универсальной и эффективной экспрессионной системы (Gene 91 (1990) 217-223). Сравнение интрон-зависимой и интрон-независимой генной экспрессии описано Buchman, A.R., et al., (Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 4395-4405). Wang, F., et al., описывают экспрессию антител в клетках млекопитающих (в Therapeutic monoclonal antibodies - From bench to clinic, Wiley (2009) pages 557-572). Сравнительное исследование различных дизайнов векторов для экспрессии в клетках млекопитающих рекомбинантных антител IgG описано Li et al. (J. Immunol. Meth. 318 (2007) 113-124). Ho, S.C.L., et al. описывают "IRES-опосредованные трицистронные вектора для увеличения получения клеточных линий СНО с высокой экспрессией моноклональных антител (J. Biotechnol. 157 (2011) 130-139). Продукция рекомбинантными клетками животных химерных антител к CD2 описана Hotta, Α., et al. (J. Biosci. Bioeng. 98 (2004) 298-303). Lee, J-C, et al. описывают высокоэффективную экспрессию белка, опосредованную внутренней посадкой рибосомы энтеровируса 71 (Biotechnol. Bioeng. 90 (2005) 656-662). В WO 2008/142124 описано получение рекомбинантного белка в клетках Avian ЕВХ®. Краткое описание изобретения

Обнаружено, что создание экспрессионного вектора сильно зависит от его предназначения и что лучшие вектора для кратковременных трансфекций, стабильных пулов и селекции единичных клонов различаются.

Для ясности основные открытия: для кратковременной трансфекций выигрышными являются разнонаправленная экспрессия легкой и тяжелой цепи антитела и применение полноразмерного промотора hCMV, включая интрон А. Однако для стабильной трансфекций была выигрышна последовательность 1) легкая цепь антитела, 2) тяжелая цепь антитела и 3) селекционный маркер.

Промотор hEF1α явно превосходит промотор hCMV в стабильных пулах, однако был обнаружено явно противоположное влияние на уровне единичных клонов. В данном документе были получены клоны цитомегаловируса человека с предранним промотором/энхансером (hCMV) с наиболее высокой продуктивностью.

Более того, получение промотора hCMV может быть в дальнейшем улучшено за счет комбинации его с bGH поли(А)-сигнальной и терминальной последовательностью гена гастрина человека (hGT), который повышает как продуктивность, так и стабильность экспрессии.

Обнаружено, что применение экспрессионного вектора, содержащего экспрессионные кассеты для тяжелой цепи антитела и экспрессионную кассету для легкой цепи антитела, каждую содержащую промотор, структурный ген и поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность терминатора, приводит к более высокому числу клеточных клонов продуцирующих/секретирующих антитело после трансфекции если i) промотор представляет собой промотор цитомегаловируса человека (hCMV), поли(А)-сигнальная последовательность представляет собой поли(А)-сигнальную последовательность коровьего гормона роста (bGH поли(А)), и последовательность терминатора представляет собой

последовательность терминатора транскрипции гена гастрина человека (hGT), или 2) промотор представляет собой промотор фактора элонгации 1 альфа человека (hEF1alpha), поли(А)-сигнальная последовательность представляет собой поли(А)-сигнальную последовательность коровьего гормона роста (bGH поли(А)), и последовательность терминатора отсутствует.

Посредством применения экспрессионного вектора, как описано выше, может быть получено более высокое число клеток, продуцирующих/секретирующих антитело, после трансфекции, и, таким образом, снижены необходимые усилия для идентификации высокопродуцирующей клетки, приемлемой для крупномасштабного получения рекомбиантных антител.

Таким образом, один аспект, как описано в данном документе, представляет собой способ селекции рекомбинантных клеток млекопитающих, включающий следующий этап:

а) трансфекция клеток млекопитающих экспрессионным вектором, содержащим

- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,

- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последователь и hGT последовательность терминатора и

таким образом, получают множество рекомбинантных клеток млекопитающих,

b) селекция множества рекомбинантных клеток млекопитающих (единичных).

В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.

В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.

В одном воплощении первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в одном направлении для селекции стабильно трансфецированной клетки.

В одном воплощении первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для селекции кратковременно трансфецированных клеток.

В одном воплощении экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер. В одном воплощении экспрессионные кассеты и селекционный маркер расположены в одном направлении. В одном воплощении экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.

В одном воплощении клетки млекопитающих выбраны из клеток CHO, HEK, BHK, NS0 и клеток SP2/0. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО для селекции стабильно трансфецированных клеток. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки HEK для селекции кратковременно трансфецированных клеток.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой способ получения антител, включающий следующий этап:

а) культивирование клеток млекопитающих, содержащих

- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и hGT последовательность терминатора,

- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора, и

b) получение антитела из клетки или культуральной среды.

В одном воплощении первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в одном направлении для стабильной продукции антитела.

В одном воплощении первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для кратковременной продукции антитела.

В одном воплощении клетки млекопитающих выбраны из клеток CHO, HEK, BHK, NS0 и клеток SP2/0. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО для стабильной продукции антитела. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки HEK для кратковременной продукции антитела.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой экспрессионный вектор, содержащий

- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора.

В одном воплощении первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в одном направлении для селекции стабильно трансфецированных клеток.

Обнаружено, что для получения клеточных линий, экспрессирующих/секретирующих стабильное рекомбинантное антитело, при применении промотора фактора элонгации человека 1 альфа (hEF1 alpha) в сочетании с bGH поли(А)-сигнальной последовательностью, присутствие hGT последовательности терминатора уменьшает получаемый экспрессионный выход.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой способ селекции рекомбинантных клеток млекопитающих, включающий следующий этап:

a) трансфекция клеток млекопитающих экспрессионным вектором, содержащим

- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, и bGH поли(А)-сигнальную последовательность.

- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и

таким образом, получая множество рекомбинантных клеток млекопитающих,

b) селекция множества рекомбинантных клеток млекопитающих (единичных).

В одном воплощении промотор фактора элонгации человека 1 альфа содержит интрон А.

В одном воплощении экспрессионный вектор является свободным от каких-либо последовательностей терминатора транскрипции. В одном воплощении последовательность терминатора представляет собой hGT последовательность.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой способ получения антитела, содержащий следующий этап:

a) культивирование клеток млекопитающих, содержащих

- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, и bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и

b) получение антитела из клеток или культуральной среды.

В одном воплощении промотор фактора элонгации человека 1 альфа содержит интрон А.

В одном воплощении экспрессионный вектор свободен от каких-либо последовательностей терминатора транскрипции. В одном воплощении последовательность терминатора представляет собой hGT последовательность.

В одном воплощении клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО, HEK, BHK, NS0 и клеток SP2/0. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО для стабильной продукции антитела. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки HEK для кратковременной продукции антитела.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой экспрессионный вектор, содержащий

- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ альфа промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, и bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и

В одном воплощении промотора фактора элонгации человека 1 альфа содержит интрон А.

Обнаружено, что для стабильной рекомбинантной продукции антитела применение экспрессионного вектора, содержащего

- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ первый промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, первую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно первую последовательность терминатора транскрипции,

- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ второй промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, вторую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно вторую последовательность терминатора транскрипции, и

- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ третий промотор, нуклеиновую кислоту, придающую устойчивость к селекционному агенту, третью поли(А)-сигнальную последовательность и возможно третью последовательность терминатора транскрипции,

в соответствии с чем три экспрессионные кассеты расположены противоположно и в последовательности первая экспрессионная кассета-вторая экспрессионная кассета-третья экспрессионная кассета, приводит к улучшенному экспрессионному выходу в стабильно трансфецированных рекомбинантных клетках млекопитающих.

В противоположность вышеуказанному обнаружено, что для кратковременной рекомбинантной продукции антитела, применение экспрессионного вектора, содержащего

В соответствии с этим экспрессионные кассеты расположены в двух направлениях, в соответствии с чем первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в противоположном направлении, что приводит к улучшению экспрессионного выхода в кратковременно трансфецированных рекомбинантных клетках млекопитающих.

Термин в противоположном направлении означает, что одна экспрессионная кассета транскрибируется в направлении 5ʹ->3ʹ и одна экспрессионная кассета транскрибируется в направлении 3ʹ->5ʹ.

Таким образом, один аспект, как описано в данном документе, представляет собой применение экспрессионного вектора, содержащего

В соответствии с чем три экспрессионные кассеты расположены в противоположном направлении в последовательности первая экспрессионная кассета-вторая экспрессионная кассета-третья экспрессионная кассета, для стабильной рекомбинантной продукции антитела в клетках млекопитающих.

В одном воплощении первый и второй промотор представляют собой промотор hCMV, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и последовательность терминатора транскрипции присутствует и представляет собой hGT последовательность терминатора.

В одном воплощении первый и второй промотор представляют собой промотор hEF1alpha, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность и экспрессионные кассеты являются свободными от какой-либо последовательности терминатора транскрипции.

В одном воплощении клетки млекопитающих выбраны из клеток CHO, HEK, BHK, NS0 и клеток SP2/0. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой экспрессионный вектор, содержащий

- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ второй промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, вторую поли(А)-сигнальную последовательность, и возможно последовательность терминатора транскрипции, и

В соответствии с чем экспрессионные кассеты расположены в противоположном направлении и в последовательности первая экспрессионная кассета-вторая экспрессионная кассета-третья экспрессионная кассета.

В одном воплощении первый и второй промотор представляют собой промотор hCMV, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность и последовательность терминатора транскрипции присутствует и представляет собой hGT последовательность терминатора.

В одном воплощении первый и второй промотор представляют собой промотор hEF1alpha, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляет собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность и экспрессионные кассеты являются свободными от последовательности терминатора транскрипции.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой применение экспрессионного вектора, содержащего

в соответствии с чем экспрессионные кассеты расположены в двух направлениях, в соответствии с чем первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в противоположном направлении для кратковременной рекомбинантной продукции антитела в клетках млекопитающих.

В одном воплощении первый и второй промотор представляют собой промотор hCMV, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность и последовательность терминатора транскрипции присутствует и представляет собой hGT последовательность терминатора.

В одном воплощении первый и второй промотор представляют собой промотор hEF1alpha, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляет собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и экспрессионные кассеты свободны от последовательности терминатора транскрипции.

В одном воплощении клетки млекопитающих выбраны из клеток CHO, HEK, BHK, NS0 и клеток SP2/0. В одном воплощении клетки млекопитающих представляют собой клетки HEK.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой экспрессионный вектор, содержащий

- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ первый промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, первую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность терминатора транскрипции,

В одном воплощении первый и второй промотор представляют собой промотор hCMV, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность и последовательность терминатора транскрипции присутствует и представляет собой hGT последовательность терминатора.

В одном воплощении первый и второй промотор представляют собой промотор hEF1alpha, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность и экспрессионные кассеты свободны от последовательности терминатора транскрипции.

Кроме того, обнаружено среди прочего, что экспрессионные вектора, содержащие промотор hCMV и промотор Ef1α с интроном А вместо короткого промотора CMV человека без интрона А, усиливают кратковременную экспрессию и экспрессию пула генов.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой экспрессионную плазмиду, содержащую

- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ первый промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, и первую поли(А)-сигнальную последовательность,

- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ второй промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела и вторую поли(А)-сигнальную последовательность,

где одна или обе экспрессионные кассеты после поли(А)-сигнальной последовательности дополнительно содержат последовательность терминатора гастрина человека.

В одном воплощении первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность выбраны независимо друг от друга из SV40 поли(А)-сигнальной последовательности и поли(А)-сигнальной

последовательности коровьего гормона роста.

В одном воплощении первый и второй промотор выбраны независимо друг от друга из промотора CMV человека, промотора SV40 и промотора фактора элонгации человека 1 альфа.

В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержат по меньшей мере один интрон.

В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляют собой кДНК.

В одном воплощении первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в одном направлении.

В одном воплощении экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер. В одном воплощении экспрессионные кассеты и селекционный маркер расположены в разных направлениях.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой применение экспрессионной плазмиды, как описано в данном документе, для кратковременной экспрессии антитела или стабильной экспрессии антитела.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой эукариотические клетки, содержащие экспрессионную плазмиду, как описано в данном документе.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой способ продукции антитела, включающий этапы

- культивирование эукариотических клеток, содержащих экспрессионную плазмиду, как описано в данном документе,

- получение антитела из эукариотических клеток или культуральной среды.

В одном воплощении эукариотические клетки представляют собой клетки млекопитающих. В одном воплощении клетки млекопитающих выбраны из клеток CHO, HEK, BHK, NS0 и клеток SP2/0.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой экспрессионную плазмиду, содержащую

- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5ʹ-3ʹ второй промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, и вторую поли(А)-сигнальную последовательность,

где первый и/или второй промотор представляют собой промотор фактора элонгации человека 1 альфа.

В одном воплощении одна или обе экспрессионные кассеты не содержат дополнительно после поли(А)-сигнальной последовательности последовательность терминатора гастрина человека.

В одном воплощении одна или обе экспрессионные кассеты свободны от последовательности терминатора гастрина человека.

В одном воплощении промотор фактора элонгации человека 1 альфа содержит интрон А.

В одном воплощении экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.

В одном воплощении экспрессионные кассеты и селекционный маркер расположены в разных направлениях.

Один аспект, как описано в данном документе, представляет собой способ получения антитела, включающий этапы культивирование эукариотических клеток, содержащих экспрессионную плазмиду, как описано в д

Комбинации элементов экспрессионного вектора, новые способы получения клеток-продуцентов и их применение для рекомбинантного получения полипептидов

Патент 2639519