Применение вариантов протеазы

Применение вариантов протеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на список последовательностей

Заявка содержит список последовательностей в машиночитаемой форме. Машиночитаемая форма включена в настоящую заявку в качестве ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к применению новых вариантов субтилазы, содержащих, по сравнению с исходной субтилазой, изменения в одном или нескольких свойствах, включая характеристики мытья, термическую стабильность, стабильность при хранении или каталитическую активность. Варианты настоящего изобретения особенно подходят, например, для мытья твердых поверхностей, такого как мытье посуды. Следовательно, настоящее изобретение также относится к моющим композициям и композициям для мытья посуды, включающим композиции для автоматического мытья посуды, которые содержат варианты настоящего изобретения. Настоящее изобретение также относится к применению композиции настоящего изобретения для удаления белковых пятен, особенно пятен от вареных яиц.

Уровень техники изобретения

В промышленности по производству моющих средств более 30 лет используют моющие композиции, содержащие ферменты. Ферменты, входящие в состав таких композиций, содержат протеазы, липазы, амилазы, целлюлазы, маннозидазы и другие ферменты, или их смеси. Наиболее важными ферментами с коммерческой точки зрения являются протеазы.

Растущее число коммерчески используемых протеаз включает рекомбинантные варианты природных протеаз дикого типа, такие как DURAZYM®, RELASE®, ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURALASE®, ESPERASE®, OVOZYME®, RELASE® и KANNASE® (Novozymes A/S), AXAPEM® (Gist-Brocades N.V.), PURAFECT® (Genencor International, Inc.), MAXATASE^TM, MAXACAL^TM, MAXAPEM^TM, PROPERASE^TM, PURAFECT^TM, PURAFECT OxP^TM, FN2^TM, FN3^TM и FN4^TM (Genencor International, Inc.).

Кроме того, в данной области существуют описания ряда вариантов, например, WO 04/041979 (NOVOZYMES A/S) описывает варианты субтилазы, содержащие, по сравнению с исходной субтилазой, изменения в таких свойствах, как характеристики мытья, термическая стабильность, стабильность при хранении или каталитическая активность. Такие варианты подходят для применения в составе чистящих или моющих композиций.

Описан ряд полезных вариантов протеаз, многие из которых обладают улучшенными активностью, стабильностью и растворимостью в разных детергентах. Однако разные факторы могут дополнительно улучшить преимущества протеаз.

При мытье посуды особой проблемой является удаление белковых загрязнений, таких как яичные пятна, поэтому предпринимаются попытки разработать протеазы или варианты протеаз, эффективные против таких пятен.

Следовательно, целью настоящего изобретения является получение вариантов субтилизина, обладающих улучшенными характеристиками по сравнению с исходным ферментом.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к применению вариантов исходных субтилизинов, которые могут представлять собой субтилизины, описанные в SEQ ID NO:1. По меньшей мере одно свойство вариантов настоящего изобретения улучшено по сравнению с исходным субтилизином, который может представлять собой субтилизин, описанный в SEQ ID NO:1. В частности, варианты настоящего изобретения имеют улучшенные характеристики при мытье твердых поверхностей, таком как мытье посуды, в одном из аспектов изобретения варианты обладают повышенной способностью к удалению пятен от яиц, например, они могут более эффективно удалять вареные яйца с твердых поверхностей.

Таким образом, один из аспектов изобретения относится к применению варианта субтилизина для мытья твердых поверхностей, где вариант содержит замены 9R, 15T, 68A, 245R и 218{D,G,V} по сравнению с исходным субтилизином, причем положения соответствуют положениям зрелого полипептида SEQ ID NO:2 [BPN’].

В одном конкретном варианте осуществления замена в положении 218 представляет собой замену на D.

Другой вариант осуществления относится к применению варианта, дополнительно содержащего по меньшей мере одну из следующих модификаций: G61{D,E}, N62{D,E}, N76{D,E}; *97aG, A98{G,S}, S99G, S101G, H120{N,Q,V,D}, P131{T,S}, Q137H, A194P, A228V, A230V, N261D, для мытья твердых поверхностей.

Отдельный вариант осуществления относится к применению варианта, содержащего следующие замены: S9R, A15T, V68A, N218D и Q245R, для мытья твердых поверхностей.

В других вариантах осуществления вариант дополнительно содержит одну или несколько из следующих замен: G61E, A98S и S99G.

Таким образом, отдельный вариант осуществления относится к применению варианта, содержащего следующие замены: S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D и Q245R, для мытья твердых поверхностей.

В другом варианте осуществления исходный субтилизин представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO:1.

Другой вариант осуществления относится к применению варианта, содержащего полипептидную последовательность по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO:3, для мытья твердых поверхностей.

Другой вариант осуществления относится к применению варианта, содержащего полипептидную последовательность по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO:4, для мытья твердых поверхностей.

В следующем варианте осуществления одно или несколько свойств варианта улучшены по сравнению с исходным субтилизином, причем улучшенные свойства включают повышенную эффективность мытья твердых поверхностей, например, мытья посуды.

В одном аспекте изобретения варианты обладают повышенной способностью удалять яйца, например, удалять вареные яйца с твердых поверхностей.

Другой вариант осуществления относится к моющей композиции, или к композиции для мытья посуды, содержащей вариант настоящего изобретения, и к применению такой композиции для мытья твердых поверхностей, в особенности, для мытья посуды. Один из аспектов изобретения относится к применению композиции, содержащей варианты настоящего изобретения, для удаления белковых пятен, в особенности пятен от вареных яиц.

В другом варианте осуществления предлагается способ удаления белковых пятен, в особенности пятен от вареных яиц, с твердых поверхностей или с белья, где способ предусматривает приведение в контакт твердых поверхностей, содержащих пятна от яиц или белья содержащего пятна от яиц, с чистящей или моющей композицией, предпочтительно, с композицией для стирки белья, или с композицией для мытья посуды, в состав которой входит вариант субтилизина, содержащий замены 9R, 15T, 68A, 245R и 218 {D,G,V} по сравнению с исходным субтилизином, где положения соответствуют положениям зрелого полипептида SEQ ID NO:2 [BPN’].

Фигуры

На фигурах 1 и 2 показана дельта-интенсивность в двух разных детергентах при разных концентрациях савиназы и вариантов V1 (S9R, A15T, V68A, Q245R), V2 (S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, Q245R), V3 (S9R, A15T, V68A, N218D, Q245R) и V4 (S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D, Q245R).

Подробное описание изобретения

Определения

Протеолитическая активность: В настоящем описании данный термин определяют как способность к разрушению белков посредством протеолиза, который представляет собой процесс катаболизма белков путем гидролиза пептидных связей, соединяющих аминокислоты в полипептидную цепь, образующую белок. Таким образом, под действием протеаз, обладающих протеолитической активностью, белки разрушаются до аминокислот. Термины "активность протеазы" и "протеолитическая активность" используются как взаимозаменяемые. См. также приведенное ниже определение термина "протеазы".

Вариант: Термин "вариант" в настоящем описании определяют как полипептид, содержащий изменение или модификацию (модификации), такую как замена, вставка и/или делеция, одного или более (нескольких) аминокислотных остатков по одному или более (нескольким) конкретным положениям. Измененный полинуклеотид получают путем модификации полинуклеотидной последовательности, осуществляемой человеком. Варианты могут представлять собой субтилизиновые варианты, т.е. варианты субтилизина, такие как полинуклеотидная последовательность, описанная в SEQ ID NO:1, или гомологичная ей последовательность. Термины "вариант протеазы" и "вариант субтилизина" используются как взаимозаменяемые. Варианты настоящего изобретения, предпочтительно, обладают активностью протеазы, или протеолитической активностью. Термины "один или более", "один или несколько" и "по меньшей мере один" используются как взаимозаменяемые.

Модификация (модификации): Используемый в настоящем описании термин "модификация (модификации)" включает химическую модификацию субтилазы, а также генетические манипуляции с ДНК, кодирующей исходную протеазу. Модификация (модификации) может представлять собой замену (замены) аминокислотной боковой цепи (аминокислотных боковых цепей), замену (замены), делецию (делеции) и/или вставки представляющей интерес аминокислоты (представляющих интерес аминокислот).

Фермент дикого типа: Термин вариант протеазы "дикого типа" обозначает вариант протеазы, экспрессируемый природным микроорганизмом, включающим встречающиеся в природе бактерии, дрожжи или нитчатые грибы, то есть, полинуклеотид, кодирующий указанный вариант протеазы, не подвергался воздействию человека, приводящему к модификации полинуклеотидной последовательности.

Исходный фермент: Термин "исходный" вариант протеазы, например, "исходный" вариант субтилизина, в настоящем описании относится к протеазе, такой как субтилизин, которую подвергают модификации, такой как замена (замены), вставка (вставки), делеция (делеции) и/или усечение (усечения), с получением вариантов ферментов настоящего изобретения. Данный термин также относится к полипептиду, с которым сравнивают, или по отношению к которому выравнивают вариант. Исходный полипептид или вариант может представлять собой природный (дикого типа) полипептид или вариант. Например, исходный полипептид может представлять собой вариант природного полипептида, полученный путем модификации или изменения аминокислотной последовательности. Исходный полипептид также может представлять собой аллельный вариант, то есть полипептид, кодируемый любой из двух или более альтернативных форм гена, находящихся в одном хромосомальном локусе.

Выделенный вариант или полипептид: Термин "выделенный вариант" или "выделенный полипептид" в настоящем описании относится к варианту или полипептиду, выделенному из источника. В одном из аспектов чистота варианта или полипептида составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере 5%, более предпочтительно, по меньшей мере 10%, более предпочтительно, по меньшей мере 20%, более предпочтительно, по меньшей мере 40%, более предпочтительно, по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 80%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90% по данным анализа SDS-PAGE.

Практически чистый вариант или полипептид: Термин "практически чистый вариант" или "практически чистый полипептид" в настоящем описании относится к препарату полипептида, который содержит максимум 10%, предпочтительно, максимум 8%, более предпочтительно, максимум 6%, более предпочтительно, максимум 5%, более предпочтительно, максимум 4%, более предпочтительно, максимум 3%, еще более предпочтительно, максимум 2%, наиболее предпочтительно, максимум 1% и, еще более предпочтительно, максимум 0,5% по массе другого полипептидного вещества, с которым он нативно связан, или в результате рекомбинирования. Следовательно, чистота практически чистого варианта или полипептида, предпочтительно, составляет по меньшей мере 92%, предпочтительно, по меньшей мере 94%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, более предпочтительно, по меньшей мере 96%, более предпочтительно, по меньшей мере 96%, более предпочтительно, по меньшей мере 97%, более предпочтительно, по меньшей мере 98%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 99%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 99,5% и, еще более предпочтительно, 100% по отношению к общей массе полипептидного вещества, присутствующего в препарате. Варианты и полипептиды настоящего изобретения, предпочтительно, существуют в практически чистой форме. Практически чистый вариант или полипептид можно получить с помощью хорошо известных рекомбинантных способов или классических методов очистки.

Зрелый полипептид: Термин "зрелый полипептид" определяют в настоящем описании как полипептид, обладающий активностью варианта протеазы, то есть, находящийся в конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как N-концевой процессинг, C-концевое укорачивание, гликозилирование, фосфорилирование и др. В одном из аспектов зрелый полипептид представляет собой полипептид с последовательностью SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. С помощью сигнальной программы SignallP3.0 можно предсказать структуру зрелого полипептида.

Последовательность, кодирующая зрелый полипептид: Термин "последовательность, кодирующая зрелый полипептид" в настоящем описании относится к нуклеотидной последовательности, которая кодирует зрелый полипептид, обладающий активностью варианта протеазы. В одном из аспектов последовательность, кодирующая зрелый полипептид, включает нуклеотиды, кодирующие SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4.

Идентичность: Родство двух аминокислотных или двух нуклеотидных последовательностей определяется параметром "идентичность".

В целях настоящего изобретения степень идентичности двух аминокислотных последовательностей определяют с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), выполняемого программой Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277; http://emboss.org), предпочтительно, в версии 3.0.0 или в более поздней версии. Используемые необязательные параметры включают штраф за открытие гэпа 10, штраф за продолжение гэпа 0,5 и подстановочную матрицу EBLOSUM62 (EMBOSS-версия BLOSUM62). Результат Needle, обозначенный "идентичность для максимальной длины" (полученный с использованием опции -nobrief), используют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(Идентичные остатки×100)/(Длина выравнивания-суммарное число гэпов при выравнивании)

В целях настоящего изобретения степень идентичности двух дезоксирибонуклеотидных последовательностей определяют с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), выполняемого программой Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше; http://emboss.org), предпочтительно, в версии 3.0.0 или в более поздней версии. Используемые необязательные параметры включают штраф за открытие гэпа 10, штраф за продолжение гэпа 0,5 и подстановочную матрицу EDNAFULL (EMBOSS-версия NCBI NUC4.4). Результат Needle, обозначенный "идентичность для максимальной длины" (полученный с использованием опции -nobrief), используют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(Идентичные дезоксирибонуклеотиды×100)/(Длина выравнивания- суммарное число гэпов при выравнивании)

Гомологичная последовательность: Термин "гомологичная последовательность" в настоящем описании относится к полипептиду, который дает значение E (или показатель вероятности) менее 0,001 в поиске tfasty (Pearson, W.R., 1999, in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener and S. A. Krawetz, ed., pp. 185-219) при сравнении с вариантом протеазы CBS 100236 Micrododhium nivale.

Фрагмент полипептида: Термин "фрагмент полипептида" в настоящем описании относится к полипептиду, полученному в результате удаления одной или более (нескольких) аминокислот из амино- и/или карбокси-конца зрелого полипептида; или к гомологичной ему последовательности; где фрагмент обладает активностью варианта протеазы.

Субпоследовательность: Термин "субпоследовательность" в настоящем описании относится к полинуклеотидной последовательности, полученной в результате удаления одного или более (нескольких) нуклеотидов из 5’- и/или 3’-конца последовательности, кодирующей зрелый полипептид; или к гомологичной ей последовательности; где субпоследовательность кодирует фрагмент полипептида, обладающий активностью варианта протеазы.

Аллельный вариант: Термин "аллельный вариант" в настоящем описании относится к любой из двух или более альтернативных форм гена, находящихся в одном хромосомальном локусе. Изменение аллели, возникающее в природе в результате мутации, может приводить к образованию полиморфизма в популяциях. Мутации гена могут быть молчащими (не вызывающими изменений в кодируемом полипептиде), или они могут кодировать полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.

Выделенный полинуклеотид: Термин "выделенный полинуклеотид" в настоящем описании относится к полинуклеотиду, выделенному из источника. В одном из аспектов чистота выделенного полинуклеотида, определенная методом электрофореза на агарозном геле, составляет по меньшей мере 1%, предпочтительно, по меньшей мере 5%, более предпочтительно, по меньшей мере 10%, более предпочтительно, по меньшей мере 20%, более предпочтительно, по меньшей мере 40%, более предпочтительно, по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере 95%.

Практически чистый полинуклеотид: Термин "практически чистый полинуклеотид" в настоящем описании относится к препарату полинуклеотида, который не содержит посторонних или нежелательных нуклеотидов и находится в виде формы, подходящей для применения в рекомбинантных системах получения полипептида. Так, практически чистый полинуклеотид содержит максимум 10%, предпочтительно, максимум 8%, более предпочтительно, максимум 6%, более предпочтительно, максимум 5%, более предпочтительно, максимум 4%, более предпочтительно, максимум 3%, еще более предпочтительно, максимум 2%, наиболее предпочтительно, максимум 1% и, еще более предпочтительно, максимум 0,5% по массе другого полинуклеотидного вещества, с которым он нативно связан, или в результате рекомбинирования. Однако практически чистый полинуклеотид может содержать встречающиеся в природе 5’- и 3’-нетранслируемые участки, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительно, чистота практически чистого полинуклеотида составляет по меньшей мере 90%, предпочтительно, по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, более предпочтительно, по меньшей мере 96%, более предпочтительно, по меньшей мере 97%, более предпочтительно, по меньшей мере 98%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 99% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 99,5% по массе. Полинуклеотиды настоящего изобретения, предпочтительно, существуют в практически чистой форме, т.е., в виде препарата полинуклеотида, который практически не содержит другого полинуклеотидного вещества, с которым он нативно связан, или в результате рекомбинирования. Полинуклеотиды могут иметь геномное, кДНК, РНК, полусинтетическое, синтетическое происхождение, или происхождение, представляющее собой сочетание указанных.

Кодирующая последовательность: Используемый в настоящем описании термин "кодирующая последовательность" обозначает полинуклеотид, который непосредственно отвечает за аминокислотную последовательность своего полипептидного продукта. Границы кодирующей последовательности, как правило, определяются открытой рамкой считывания, которая обычно начинается с инициирующего кодона ATG или альтернативных инициирующих кодонов, таких как GTG и TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как TAA, TAG и TGA. Кодирующая последовательность может представлять собой ДНК, кДНК, синтетический или рекомбинантный полинуклеотид.

кДНК: Термин "кДНК" в настоящем описании относится к молекуле ДНК, которую можно получить путем обратной транскрипции молекулы зрелой, образовавшейся после сплайсинга, мРНК, полученной из эукариотической клетки. кДНК не содержит последовательности интронов, которые обычно присутствуют в соответствующей геномной ДНК. Исходный, первичный транскрипт РНК представляет собой предшественник мРНК, который подвергается процессингу, включающему ряд стадий, с образованием зрелой сплайсированной мРНК. Указанные стадии включают удаление последовательностей интронов посредством процесса, называемого сплайсингом. Следовательно, кДНК, полученная из мРНК, не содержит последовательностей интронов.

Конструкция нуклеиновой кислоты: Термин "конструкция нуклеиновой кислоты" в настоящем описании относится к молекуле одно- или двухцепочечной нуклеиновой кислоты, которая представляет собой молекулу, выделенную из встречающегося в природе гена, или молекулу, полученную в результате модификации, включающей вставку сегментов нуклеиновых кислот в таком порядке, который не встречается в природе, или синтетическую молекулу. Термин конструкция нуклеиновой кислоты является синонимом термину "кассета экспрессии", если конструкция нуклеиновой кислоты содержит регулирующие последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности настоящего изобретения.

Регулирующие последовательности: Термин "регулирующие последовательности" в соответствии с настоящим описанием включает все компоненты, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид настоящего изобретения. Каждая регулирующая последовательность может быть нативной или чужеродной по отношению к полинуклеотиду, кодирующему полипептид, или регулирующие последовательности могут быть нативными или чужеродными по отношению друг к другу. Такие регулирующие последовательности включают, без ограничения, лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промоторную последовательность, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Как минимум, регулирующие последовательности включают промотор и сигналы завершения транскрипции и трансляции. Регулирующие последовательности можно вводить вместе с линкерами, которые обеспечивают вставку специфических участков рестрикции, облегчающих лигирование регулирующих последовательностей с участком полинуклеотида, кодирующим полипептид.

Функционально связанный: Термин "функционально связанный" в настоящем описании относится к такому расположению регулирующей последовательности относительно кодирующей полинуклеотидной последовательности, которое позволяет регулирующей последовательности управлять экспрессией последовательности, кодирующей полипептид.

Экспрессия: Термин "экспрессия" охватывает все стадии, участвующие в продукции полипептида, которые включают, без ограничения, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Вектор экспрессии: Термин "вектор экспрессии" в настоящем описании относится к линейной или циклической молекуле ДНК, содержащей полинуклеотид, который кодирует полипептид настоящего изобретения и находится в функциональной связи с другими нуклеотидами, обеспечивающими его экспрессию.

Клетка-хозяин: Термин "клетка-хозяин" в настоящем описании охватывает все типы клеток, поддающиеся трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п. с использованием конструкции нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид настоящего изобретения. Термин "клетка-хозяин" включает любое потомство родительской клетки, которое не является идентичным родительской клетке вследствие мутаций, возникающих в процессе репликации.

Улучшенное свойство: Термин "улучшенное свойство" в настоящем описании относится к характеристике варианта, улучшенной по сравнению с исходным вариантом протеазы. Такие улучшенные свойства включают, без ограничения, характеристики мытья, такие как эффективность удаления пятен, например, эффективность удаления белок-содержащих загрязнений и пятен, таких как яичные пятна, стабильность, например, термостабильность, окислительная стабильность, химическая стабильность, pH-стабильность или стабильность в порошкообразных, жидких или гелеобразных моющих составах или композициях для мытья посуды. Варианты настоящего изобретения также могут иметь измененные профиль зависимости активности от температуры и pH, субстратную специфичность, специфичность к продукту. В одном из вариантов осуществления улучшенные свойства включают улучшенные характеристики мытья и улучшенную стабильность, а также сочетание улучшенных характеристик мытья посуды и улучшенной стабильности. В одном из вариантов осуществления улучшенные свойства включают повышенную эффективность стирки или мытья посуды, например, удаления белковых загрязнений, таких как яичные пятна.

Характеристики мытья: В контексте настоящего описания термин "характеристики мытья" используется для обозначения способности фермента удалять белковые или органические пятна, присутствующие на объекте, подлежащем чистке, в процессе, например, стирки или мытья твердых поверхностей. Улучшение характеристик мытья также можно количественно оценить путем расчета так называемой величины интенсивности (Int), определенной в примере 3 настоящего описания. См. также тест на характеристики стирки, приведенный в примере 3 настоящего описания. Термин характеристики стирки и характеристики мытья посуды используются как взаимозаменяемые.

Улучшенные характеристики мытья: Термин "улучшенные характеристики мытья" в настоящем описании относится к измененным характеристикам мытья варианта протеазы по сравнению с характеристиками мытья исходного варианта протеазы, например, к более эффективному удалению пятен. Термин "характеристики мытья" включает характеристики мытья при стирке, а также при мытье посуды.

Мытье твердых поверхностей: Термин включает "мытье посуды" и мытье твердых объектов, таких как типичные объекты для мытья посуды, которые включают, без ограничения, тарелки, чашки, стаканы, чаши, и столовые приборы, такие как ложки, ножи, вилки, сервантные приборы, керамические изделия, пластиковые изделия, металлические изделия, фарфоровые изделия, стеклянные изделия и акриловые изделия.

Композиция для мытья посуды: Термин "композиция для мытья посуды" относится ко всем формам композиций для мытья твердых поверхностей. Настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным типом композиций для мытья посуды или каким-либо конкретным стиральным средством.

Протеазы

Ферменты, расщепляющие амидные связи в белковых субстратах, относят к протеазам или (взаимозаменяемый термин) пептидазам (см. Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3).

Нумерация аминокислотных положений/остатков

Если не указано иначе, используемая здесь нумерация соответствует нумерации последовательности субтилазы BPN’ (BASBPN). Дополнительное описание последовательности BPN’ приведено в SEQ ID NO:2 или Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737.

Сериновые протеазы

Сериновая протеаза представляет собой фермент, который катализирует гидролиз пептидных связей и обязательно содержит остаток серина в активном центре (White, Handler and Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272).

Молекулярная масса бактериальных сериновых протеаз варьирует в диапазоне от 20000 до 45000 Дальтон. Их действие ингибирует диизопропилфторфосфат. Они гидролизуют простые концевые эфиры и обладают таким же действием, как и химотрипсин эукариотов, которые также представляют собой сериновую протеазу. Более узкий термин, щелочная протеаза, охватывает подгруппу сериновых протеаз, обладающих оптимальным уровнем активности при высоких значениях pH, 9,0-11,0 (обзор можно найти в Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753).

Субтилазы

Подгруппа сериновых протеаз, в предварительном варианте названных субтилазы, описана Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 и Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Данные ферменты были определены в результате анализа гомологии более 170 аминокислотных последовательностей сериновых протеаз, ранее упоминающихся как субтилизин-подобные протеазы. Ранее субтилизин определяли как сериновую протеазу, продуцируемую грамположительными бактериями или грибками, а сейчас, в соответствии с Siezen et al., относят к подгруппе субтилаз. Идентифицирован широкий ряд субтилаз и определены аминокислотные последовательности некоторых из них. Более подробное описание таких субтилаз и их аминокислотных последовательностей можно найти в Siezen et al. (1997).

Одна подгруппа субтилаз, I-S1 или "истинные" субтилизины, включает "классические" субтилизины, такие как субтилизин 168 (BSS168), субтилизин BPN’, субтилизин Carlsberg (ALCALASE®, NOVOZYMES A/S) и субтилизин DY (BSSDY).

Другая подгруппа субтилаз, I-S2 или высокощелочные субтилизины, описана Siezen et al. (выше). Подгруппа протеаз I-S2 описана как высокощелочные субтилизины и включает такие ферменты, как субтилизин PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Genencor International Inc.), субтилизин 309 (SAVINASE®, NOVOZYMES A/S), субтилизин 147 (BLS147) (ESPERASE®, NOVOZYMES A/S) и щелочная эластаза YaB (BSEYAB).

"SAVINASE®"

SAVINASE® поставляет NOVOZYMES A/S. Она представляет собой субтилизин 309 из B. Lentus и отличается от BAALKP только по одному положению (N87S). SAVINASE® имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.

Исходная субтилаза

Термин "исходная субтилаза" описывает субтилазу, определенную Siezen et al. (1991 и 1997). Другие детали описаны в приведенном выше разделе "Субтилазы". Исходная субтилаза также может представлять собой субтилазу, выделенную из природного источника, которая была подвергнута модификациям, позволяющим сохранять характеристики субтилазы. Кроме того, исходная субтилаза может представлять собой субтилазу, полученную методом перестановки в ДНК, например, как описано J.E. Ness et al., Nature Biotechnology, 17, 893-896 (1999).

Альтернативно термин "исходная субтилаза" может включать "субтилазу дикого типа".

Ниже приведена таблица сокращенных названий разных упомянутых здесь субтилаз, другие сокращенные названия можно найти в Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 и Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523.

Таблица III
Организм	фермент	сокращенное название
Бактерии: грамположительные
Bacillus subtilis 168	Субтилизин I168,apr	BSS168
Bacillus amyloliquefaciens	Субтилизин BPN’ (NOVO)	BASBPN
Bacillus subtilis DY	Субтилизин DY	BSSDY
Bacillus licheniformis	Субтилизин Carlsberg	BLSCAR
Bacillus lentus	Субтилизин 309	BLSAVI
Bacillus lentus	Субтилизин 147	BLS147
Bacillus alcalophilus PB92	Субтилизин PB92	BAPB92
Bacillus YaB	щелочная эластаза YaB	BYSYAB
Bacillus sp. NKS-21	Субтилизин ALP I	BSAPRQ
Bacillus sp. G-825-6	субтилизин Sendai	BSAPRS
Thermoactinomyces vulgaris	термитаза	TVTHER

Модификация (модификации) субтилазы

Термин "модификация (модификации)" в соответствии с настоящим описанием включает химическую модификацию субтилазы, а также генетическую манипуляцию с ДНК, кодирующей субтилазу. Модификация (модификации) может включать замещение (замещения) аминокислотной боковой цепи (цепей), замену (замены), делецию (делеции) и/или вставку (вставки) представляющей интерес аминокислоты (аминокислот).

Вариант субтилазы

Термин "вариант" и термин "вариант субтилазы" определены выше.

Гомологичные последовательности субтилазы

В целях настоящего изобретения гомология двух аминокислотных последовательностей в данном контексте описывается параметром "идентичность", причем степень идентичности двух аминокислотных последовательностей определяют с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша, как описано выше. Помимо выравнивания аминокислотных последовательностей с помощью стандартной программы можно рассчитать "процент идентичности" двух последовательностей.

На основе настоящего описания специалист в данной области может легко идентифицировать подходящие гомологичные субтилазы, которые можно модифицировать в соответствии с настоящим изобретением.

В одном из аспектов исходная протеаза содержит аминокислотную последовательность, степень идентичности которой по отношению к SEQ ID NO:1 составляет, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 81%, более предпочтительно, по меньшей мере 82%, более предпочтительно, по меньшей мере 83%, более предпочтительно, по меньшей мере 84%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 86%, более предпочтительно, по меньшей мере 87%, более предпочтительно, по меньшей мере 88%, более предпочтительно, по меньшей мере 89%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 91%, более предпочтительно, по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 93%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%, или даже 100%.

Варианты, практически гомологичные исходной протеазе, могут содержать одну или более (несколько) замен, делеций и/или вставок аминокислот, в контексте настоящего изобретения термин "один или более" используется как взаимозаменяемый с термином "один или несколько". Указанные изменения, предпочтительно, являются минорными по природе, такими как описанные выше консервативные аминокислотные замены и другие замены, которые не оказывают существенного влияния на трехмерную укладку или активность белка или полипептида; небольшие делеции, как правило, примерно от одной до 30 аминокислот; и небольшие амино- или карбокси-концевые удлинения, такие как добавление амино-концевого остатка метионина, небольшого линкерного пептида длиной примерно до 20-25 остатков, или небольшое удлинение, которое облегчает очистку (аффинный маркер), такое как поли-гистидиновый участок или белок A (Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4: 1075; Nilsson et al., 1991, Methods Enzymol. 198: 3. Общее описание также можно найти в Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Хотя описанные выше изменения, предпочтительно, являются минорными по природе, они также могут быть значительными, такими как гибриды с более крупными полипептидами, содержащими до 300 аминокислот или более, существующие в виде амино- или карбокси-концевых удлинений.

Исходная протеаза может содержать или включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или ее аллельный вариант; или ее фрагмент, обладающий протеазной активностью. В одном из аспектов исходная протеаза содержит или включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.

Варианты субтилазы

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что варианты, содержащие замены в определенных положениях, обладают повышенной эффективностью, особенно, в отношении белковых пятен, таких как яичные пятна.

В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что варианты, которые содержат замену на R в положении 9, замену на T в положении 15, замену на A в положении 68, замену на R в положении 245, и которые дополнительно содержат замену на D, S, G, V в положении 218, обладают значительно улучшенными характеристиками в отношении мытья твердых поверхностей, особенно, в отношении удаления белковых пятен при мытье посуды.

Таким образом, первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к