Способ определения генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда

Способ определения генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда

Реферат

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для определения степени индивидуального генетического риска атеросклероза, ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда.

При различных заболеваниях и патологиях человека имеется связь с наследуемыми или возникающими в процессе онтогенеза дефектами митохондриального генома (точечными мутациями в кодирующих областях генов ферментов, транспортных РНК и рибосомальных РНК). В последние годы установлено, что некоторые мутации митохондриального генома ассоциированы с хроническими неинфекционными заболеваниями, например атеросклерозом, ишемической болезнью сердца, инфарктом миокарда и гипертонической болезнью.

Митохондриальный геном наследуется по материнскому типу. Он отличается выраженной нестабильностью, поэтому в нем нередки как наследуемые, так и соматические мутации, возникающие в течение жизни индивида. Митохондриальная ДНК накапливает мутации более чем в десять раз быстрее по сравнению с ядерным геномом; это связано с тем, что мтДНК лишена защитных гистонов, а ее окружение богато реактивными формами кислорода, являющимися побочным продуктом метаболических процессов, протекающих в митохондриях; кроме того, восстановительные механизмы мтДНК малоэффективны по сравнению с ядерной ДНК. Пенетрантность и экспрессивность мутаций мтДНК варьируют от семьи к семье и между родственниками по материнской линии и зависят от многих факторов, но главным образом, от генотипа и степени гетероплазмии (смеси мутантных и нормальных молекул ДНК).

Как правило, патогенные мутации в митохондриальных генах приводят к нарушению синтеза белка в митохондриях, снижают эффективность окислительного фосфорилирования и продукцию АТФ. Для своего фенотипического выражения патогенная мутация мтДНК должна накопиться в достаточной мере, чтобы превысить определенное пороговое значение гетероплазмии (показателя, характеризующего долю мутантных молекул мтДНК в общем пуле мтДНК в клетке или ткани). Фенотипическое проявление мутации зависит от степени гетероплазмии. Как правило, для возникновения выраженной митохондриальной патологии требуется высокое содержание мутантной мтДНК в определенной ткани, превышающее 50-60% от общего пула мтДНК. При этом степень гетероплазмии определенных патогенных мутаций мтДНК, не превышающая 20-40%, уже значительно повышает риск развития таких хронических неинфекционных заболеваний, как гипертрофия левого желудочка миокарда, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца.

Мутация мтДНК m.652delG (однонуклеотидная делеция гуанина в позиции 652 мтДНК, локализованная в гене MT-RNR1, кодирующем 12S субъединицу рибосомальной РНК) приводит к изменению вторичной и третичной структуры продукта, а также его термодинамических характеристик (повышение энтальпии вторичной радиальной структуры с -168,5 ккал до -167,0 ккал, повышение энтальпии матрицы с -204,7 ккал до -202,8 ккал).

Известен способ диагностики предрасположенности к ишемической болезни сердца, заключающийся в сравнении количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК в образце крови больного субъекта с аналогичным уровнем в образце крови контрольного субъекта, не страдающего атеросклерозом. При этом определяют количественную степень повреждений митохондриальной ДНК методом количественной ПЦР, где ДНК обрабатывают гликозилазой FAPY до указанного уровня ПЦР-амплификации (патент РФ №2243558, МПК G01N 33/48, опубл. 27.12.2004 г.).

Однако в известном решении исследуются крупные приобретенные делеции митохондриальной ДНК, то есть качественные изменения, что недостаточно для обеспечения точности диагностики.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ оценки индивидуального генетического риска атеросклероза на основе определения вариантов митохондриального генома, состоящий в том, что у человека берут кровь, выделяют ДНК и проводят генотипирование митохондриальной ДНК; наличие варианта A1811G свидетельствует о высоком генетическом риске атеросклероза, а наличие вариантов Т204С, G8251A, Т10238С, G12501A свидетельствует о низком генетическом риске атеросклероза (Патент РФ №2592233, МПК G01N 33/50, опубл. 20.07.2016 г.).

Однако известный метод не описывает количественные показатели гетероплазмии, пороговые значения и диагностические характеристики, описываемые в заявляемом изобретении.

Задачей изобретения является создание эффективного способа определения генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда, позволяющего на ранних этапах выявлять развитие болезни и принимать адекватные меры для профилактики и своевременного лечения.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности и точности определения предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни и инфаркту миокарда.

Технический результат достигается тем, что в заявляемом способе определения генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда, состоящем в том, что из крови пациента выделяют ДНК и проводят генотипирование митохондриальной ДНК, согласно изобретению определяют степень гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG и при величине показателя выше 22,5% судят об индивидуальной генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда.

Осуществление способа.

В заявляемом способе генетической диагностики атеросклероза у пациента берут кровь, выделяют ДНК из клеток крови, определяют степень гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG и при превышении порогового значения данного показателя, принятого равным 22,5%, диагностируют наличие атеросклероза и индивидуальной генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда.

Было обследовано 450 человек, а именно 223 человека без клинических признаков атеросклероза и 227 больных ишемической болезнью сердца (ИБС), в том числе 82 больных ИБС с перенесенным инфарктом миокарда. Количественная диагностика атеросклероза была проведена с помощью ультрасонографии сонных артерий с последующим измерением толщины интимо-медиального слоя общих сонных артерий и размера атеросклеротических бляшек. К здоровым лицам относили тех участников исследования, у которых отсутствовало патологическое утолщение интимо-медиального слоя общих сонных артерий и отсутствовали возвышающиеся поражения. К больным атеросклерозом относили тех участников исследования, у которых имелось патологическое утолщение интимо-медиального слоя общих сонных артерий в сочетании с возвышающимися поражениями, занимающими не менее 10% просвета сонных артерий. Цельную кровь брали утром натощак в количестве 5 мл и выделяли из нее ДНК методом фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы K. Степень гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG определяли с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием одной пары праймеров и двух зондов (на нормальный и мутантный участки мтДНК), вычисляя значение ACt (разность пороговых циклов для кривых плавления зондов, комплементарным нормальным или мутантным участкам ДНК), определяя коэффициент эффективности амплификации по формуле E=(R2/R1)^1/C(t), где R1 и R2 - уровни флуоресценции в начале и в конце экспоненциальной фазы, и рассчитывая степень гетероплазмии G по формуле G(%)=100/(1+E^ΔCt). У здоровых лиц без атеросклероза среднее значение гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG составило 19,2% (стандартное отклонение 7,7), у больных ИБС - 24,3% (стандартное отклонение 7,6), в том числе у больных ИБС с перенесенным инфарктом миокарда - 26,3% (стандартное отклонение 7,2) (p<0,001). При анализе результатов методом построения кривых операторского теста, в котором оцениваемым реальным состоянием являлось наличие атеросклеротических бляшек со стенозированием более 20% просвета артерии, площадь под кривой составила 0,601±0,027 (p<0,0001; 95% доверительный интервал 0,548-0,653). Пороговое значение гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG составило 21,5% (чувствительность 56,5%, специфичность 58,1%). При анализе, в котором оцениваемым реальным состоянием являлось наличие гемодинамически значимых атеросклеротических бляшек со стенозированием более 50% просвета артерии, площадь под кривой составила 0,660±0,035 (p<0,0001; 95% доверительный интервал 0,591-0,729). Пороговое значение гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG составило 23,5% (чувствительность 65,4%, специфичность 60,1%). При анализе, в котором оцениваемым реальным состоянием являлось наличие ИБС, площадь под кривой составила 0,683±0,025 (p<0,0001; 95% доверительный интервал 0,634-0,732). Пороговое значение гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG составило 21,5% (чувствительность 60,8%, специфичность 63,7%). При анализе, в котором оцениваемым реальным состоянием являлось наличие инфаркта миокарда в анамнезе, площадь под кривой составила 0,698±0,030 (p<0,0001; 95% доверительный интервал 0,638-0,757). Пороговое значение гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG составило 23,5% (чувствительность 68,3%, специфичность 62,8%). Таким образом, по 4 оцениваемым реальным состояниям среднее пороговое значение гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG определено равным 22,5%. При этом условии в отношении диагностики атеросклероза количество истинно положительных результатов составило 148 случаев, истинно отрицательных - 127 случаев, ложноположительных - 62 случая, ложноотрицательных - 113 случаев. Чувствительность генодиагностики составила 56,8%, специфичность - 67,2%, отношение шансов - 2,68 (95% доверительный интервал 1,78-4,04), относительный риск - 1,50 (95% доверительный интервал 1,27-1,75) (p<0,001). В отношении диагностики ИБС количество истинно положительных результатов составило 134 случая, истинно отрицательных - 147 случаев, ложноположительных - 76 случаев, ложноотрицательных - 93 случая. Чувствительность генодиагностики составила 59,1%, специфичность - 66,0%, отношение шансов - 2,78 (95% доверительный интервал 1,87-4,17), относительный риск - 1,65 (95% доверительный интервал 1,36-1,99) (p<0,001). В отношении диагностики инфаркта миокарда количество истинно положительных результатов составило 60 случаев, истинно отрицательных - 218 случаев, ложноположительных - 150 случаев, ложноотрицательных - 22 случая. Чувствительность генодиагностики составила 73,2%, специфичность - 59,3%, отношение шансов - 3,96 (95% доверительный интервал 2,26-6,99), относительный риск - 3,12 (95% доверительный интервал 1,95-5,08) (p<0,001).

Таким образом, в ДНК из клеток крови человека определяют степень гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG и при превышении порогового значения данного показателя, принятого равным 22,5%, диагностируют наличие атеросклероза и индивидуальной генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда.

Примеры осуществления способа.

Пример 1. Женщина, 60 лет, значение гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG составляет 7% (существенно ниже порогового значения; нет генетической предрасположенности к атеросклерозу). Толщина интимо-медиального слоя общих сонных артерий 0,67 мм (ниже возрастной нормы, нет предрасположенности к атеросклерозу), атеросклеротические бляшки не выявлены, ИБС нет, инфаркта миокарда в анамнезе нет. Результаты генодиагностики соответствуют реальной клинической картине.

Пример 2. Мужчина, 63 года, значение гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG составляет 20% (ниже порогового значения; нет генетической предрасположенности к атеросклерозу). Толщина интимо-медиального слоя общих сонных артерий 0,74 мм (соответствует возрастной норме, нет предрасположенности к атеросклерозу), атеросклеротические бляшки не выявлены, ИБС нет, инфаркта миокарда в анамнезе нет. Результаты генодиагностики соответствуют реальной клинической картине.

Пример 3. Мужчина, 53 года, значение гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG составляет 25% (выше порогового значения; есть генетическая предрасположенность к атеросклерозу). Толщина интимо-медиального слоя общих сонных артерий 0,79 мм (выше возрастной нормы, есть предрасположенность к атеросклерозу), выявлены атеросклеротические бляшки со стенозированием более 20% просвета сосудов, ИБС есть, инфаркта миокарда в анамнезе нет. Результаты генодиагностики соответствуют реальной клинической картине.

Пример 4. Мужчина, 68 лет, значение гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG составляет 31% (выше порогового значения; есть генетическая предрасположенность к атеросклерозу). Толщина интимо-медиального слоя общих сонных артерий 1,61 мм (значительно выше возрастной нормы, есть предрасположенность к атеросклерозу), выявлены атеросклеротические бляшки со стенозированием более 50% просвета сосудов, болен ИБС, перенесенный инфаркт миокарда в анамнезе. Результаты генодиагностики соответствуют реальной клинической картине.

Таким образом, заявляемый способ позволяет на ранних этапах выявлять развитие болезни и принимать адекватные меры для профилактики и своевременного лечения.

Способ определения генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда, состоящий в том, что из крови пациента выделяют ДНК и проводят генотипирование митохондриальной ДНК, отличающийся тем, что определяют степень гетероплазмии мтДНК по мутации m.652delG и при величине показателя выше 22,5% судят о высоком генетическом риске атеросклероза, ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда.