Композиции и способы анализа рака предстательной железы

Композиции и способы анализа рака предстательной железы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

[0001] Эта заявка заявляет приоритет согласно 35 USC 119(е) на основании Предварительной заявки на патент США с номером 61/629886, поданной 29 ноября 2011 года, и Предварительной заявки на патент США с номером 61/703099, поданной 19 сентября 2012 года, содержания которых включены здесь посредством ссылки в их полном виде.

Область техники, к которой относится данное изобретение

[0002] Данное изобретение относится к области онкологии и диагностики рака и, более конкретно, к композициям и способам скрининга рака предстательной железы, определения стадии и мониторинга лечения.

Уровень техники

[0003] Рак предстательной железы является одним из наиболее преобладающего вида рака у мужчин. Хотя большинство видов рака предстательной железы при раннем появлении являются бессимптомными и медленно растущими, некоторые виды рака предстательной железы являются более агрессивными, болезненными и приводят к летальному исходу. В настоящее время, два основных типа неинвазивных тестов скрининга являются доступными для детектирования рака предстательной железы у мужчин. Один является пальцевым ректальным исследованием (DRE), которое позволяет доктору детектировать аномальности предстательной железы введением пальца в перчатке в прямую кишку и пальпированием предстательной железы, и другое является тестом на антиген поверхности предстательной железы (RSA-тестом), который измеряет уровень PSA-антигена в образце крови. Хотя FDA (Департамент по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США) одобрил применение PSA-теста вместе с DRE для содействия детектированию рака предстательной железы у мужчин, RSA-тест является противоречивым в скрининге, так как неясно, действительно ли тест спасает жизнь. В частности, United States Preventive Services Task Forces рекомендовала не проводить PSA-скрининг у здоровых людей, на основе открытий, что PSA-скрининг не уменьшает или мало уменьшает летальность рака предстательной железы, приводя к обработкам или тестам, которые вызывают ненужную боль и побочные эффекты (см., например, R. Chou et al, Ann. Intern. Med., October 7, 2011 E-375; Djulbegovic et al, BMJ 200, 341: c4543). Наиболее достоверной диагностикой рака предстательной железы является биопсия, где небольшой кусочек предстательной железы пациента с подозрением на заболевание удаляют для микроскопического испытания на присутствие опухолевых клеток. Несомненно, такая процедура является довольно инвазивной и менее желательной в раннем скрининге и раннем детектировании.

[0004] Как и во многих других видах рака, главной причиной смерти пациентов с раком предстательной железы является не первичная опухоль, а скорее метастазирование. Некоторые первичные опухолевые клетки могут сами отделяться от исходной ткани и входить в кровоток. Клетки называют циркулирующими опухолевыми клетками (CTC). Как только CTC засевают сами подходящий участок в теле, они могут развиваться в метастатические колонии, которые трудно детектировать, но могут быть угрожающими жизни, когда они прогрессируют во вторичные опухоли. Предпринимались попытки детектирования CTC. Однако, не были установлены способы, которые могут различать, происходят ли CTC из предстательной железы и каким образом прогрессирует рак предстательной железы. Ввиду недавнего открытия, что скрининг PSA не может уменьшать смертность, существует существенная потребность в развитии агентов и способов, которые могут обеспечивать достоверные результаты в диагностике и прогнозе рака предстательной железы.

Сущность изобретения

[0005] В одном аспекте данное описание обеспечивает способы диагностирования рака предстательной железы у испытуемого субъекта, предусматривающие: a) контактирование раковых клеток эпителиального происхождения с антителом, которое специфически связывается со специфическим для предстательной железы маркером, где раковые клетки являются клетками из образца крови, взятого у испытуемого субъекта; и b) определение, экспрессируют ли раковые клетки простата-специфический маркер, где присутствие раковых клеток, которые экспрессируют специфический для предстательной железы маркер, является прогностическим в отношении рака предстательной железы у испытуемого субъекта.

[0006] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает определение количества раковых клеток, которые экспрессируют простата-специфический маркер, где такое количество является прогнозирующим стадию рака предстательной железы у испытуемого субъекта.

[0007] В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает определение уровня экспрессии простата-специфического маркера на раковых клетках.

[0008] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает распределение по группам раковых клеток на основе их уровней экспрессии простата-специфического маркера и определение процентного содержания раковых клеток в каждой группе.

[0009] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает расчет оценки (обычно балльной) для каждой группы умножением процентного содержания раковых клеток в группе с уникальным номером группы, приписанным к группе, на основе уровня экспрессии простата-специфического маркера, и суммирование всех оценок групп для получения Н-оценки, где Н-оценка указывает на стадию рака предстательной железы у испытуемого субъекта.

[0010] В некоторых вариантах осуществления раковые клетки идентифицируют из образца крови с захватыванием композиции, содержащей лиганд, который специфически связывается с раковыми клетками эпителиального происхождения. В некоторых вариантах осуществления лигандом является антитело, которое специфически связывается с эпителиальным антигеном, экспрессируемым на раковых клетках. В некоторых вариантах осуществления эпителиальным антигеном является Молекула Адгезии Эпителиальных Клеток (Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM)).

[0011] В некоторых вариантах осуществления идентифицированные раковые клетки являются обогащенными в клеточной фракции, отделенной от образца клеток. В некоторых вариантах осуществления эту клеточную фракцию отделяют в присутствии магнитного поля. В некоторых вариантах осуществления лиганд в захватывающей композиции связывается с магнитной частицей.

[0012] В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с простата-специфическим маркером, содержит анти-STEAP-1 антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-STEAP1-антитело связывается со STEAP-1 с KD≤1000 нМ. В некоторых вариантах осуществления анти-STEAP-1-антитело является мышиным моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления анти-STEAP-1-антителом является 15A5, продуцируемый гибридомной клеткой, имеющей номер депонирования микроорганизмов PTA-12259.

[0013] В некоторых вариантах осуществления раковые клетки идентифицируют с одним или несколькими реагентами, которые позволяют детектирование раковых клеток эпителиального происхождения. В некоторых вариантах осуществления реагенты содержат лиганд, который специфически связывается с цитокератином, и где лиганд является необязательно конъюгированным со второй детектируемой меткой. В некоторых вариантах осуществления реагенты дополнительно содержат краситель, который отличает клетки от неклеточных компонентов. В некоторых вариантах осуществления реагенты дополнительно содержат лиганд, который специфически связывается с маркером лейкоцитов.

[0014] В некоторых вариантах осуществления раковые клетки детектируют способом на основе иммунофлуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии, волоконно-оптической сканирующей цитометрии или лазерной сканирующей цитометрии.

[0015] В другом аспекте данное раскрытие сущности изобретения обеспечивает способы прогнозирования эффективности терапии рака предстательной железы у испытуемого субъекта.

[0016] В другом аспекте данное раскрытие обеспечивает способы мониторинга реакции на терапию рака предстательной железы у испытуемого субъекта.

[0017] В другом аспекте данное раскрытие обеспечивает антитела, которые связываются по существу с тем же самым эпитопом, с которым связывается антитело 15A5, где антитело 15A5 продуцируется клеткой гибридомы, имеющей номер депозирования микроорганизмов PTA-12259.

[0018] В другом аспекте данное раскрытие обеспечивает линию клеток гибридомы, имеющую номер депонирования микроорганизмов PTA-12259.

[0019] В другом аспекте данное изобретение обеспечивает тест-наборы для детектирования присутствия раковых клеток предстательной железы, экспрессирующих STEAP-1 в образце крови, содержащие антитело, которое специфически связывается со STEAP-1. В некоторых вариантах осуществления тест-наборы дополнительно содержат одну или несколько композиций, выбранных из группы, состоящей из магнитных частиц, связанных с первым лигандом, который специфически связывается с раковыми клетками эпителиального происхождения, вторым лигандом, который специфически связывается с эпителиальным маркером, третьим лигандом, который специфически связывается с маркером лейкоцитов, и красителя, который отличает клетки от неклеточных компонентов.

Краткое описание чертежей

[0020] Фигура 1 изображает репрезентативные количественные критерии для CTC на основе уровня окрашивания анти-STEAP-1-антителом.

[0021] Фигура 2 изображает экспрессию STEAP-1 и Н-оценки различных клеточных линий, определенные на системе CellSearch® с использованием овечьего поликлонального анти-STEAP-1-антитела, мышиного моноклонального анти-STEAP-1-антитела 37, и кроличьего поликлонального анти-STEAP-1-антитела: (a) экспрессию на LB50-клетках; (b) экспрессию на PC3-клетках; (c) H-оценку клеток LB50 и (d) H-оценку клеток PC3.

[0022] Фигура 3 изображает экспрессию STEAP-1 и H-оценки различных spiked-in образцов (образцов крови с введением клеток), определенные на системе CellSearch® с использованием овечьего поликлонального анти-STEAP-1-антитела: (a) экспрессия, (b) H-оценки.

[0023] Фигура 4 изображает H-оценки образцов крови 11 пациентов, определенные на системе CellSearch® с использованием овечьего поликлонального анти-STEAP-1-антитела.

[0024] Фигуры 5 изображают H-оценки образцов крови 10 пациентов, определенные на системе CellSearch® с использованием овечьего поликлонального анти-STEAP-1-антитела (a), и сравнение с результатами IHC (иммуногистохимии) на образцах опухолевой ткани из тех же самых пациентов (b-c).

[0025] Фигура 6 изображает экспрессию STEAP-1 и H-оценки различных spiked-in образцов (образцов крови с введением клеток), определенные на системе CellSearch® с использованием овечьего поликлонального анти-STEAP-1-антитела (a-b) и мышиного моноклонального анти-STEAP-1-антитела 15A5 (c-d).

[0026] Фигура 7 изображает воспроизводимость CTC-подсчета в дублируемых образцах пациента, как показано CTC-подсчет/пациент (a), и воспроизводимость уровней экспрессии биомаркера STEAP1 в CTC из дублируемых образцов пациента, как показано H-оценка/пациент (b).

[0027] Фигура 8 изображает сильную корреляцию в подсчете CTC из образцов крови, взятой при линии фона 1 и 2.

[0028] Фигура 9 изображает изменение в указанное число раз в CTC-подсчетах пациентов во время терапии с увеличением доз от Дозы 1-7 пред-дозы и пост-дозы.

[0029] Фигура 10 изображает изменение в CTC-подсчетах пациентов во время увеличения доз терапии от Дозы 1-7 пред-дозы и пост-дозы.

[0030] Фигура 11 изображает изменение в CTC-подсчетах пациентов во время увеличения доз терапии от Дозы 1-7 пред-дозы и пост-дозы.

Подробное описание данного изобретения

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0031] Термин "опухоль" или "рак", используемые взаимозаменяемо здесь, относится к любому медицинскому состоянию, характеризуемому неопластическим или злокачественным ростом клеток, пролиферацией или метастазированием, и включает как солидные опухоли, так и не-солидные опухоли, такие как лейкоз.

[0032] Термины "рак предстательной железы" или "опухоль предстательной железы", используемые здесь, относятся в данном контексте к раку или опухоли, которые происходят из ткани простаты (предстательной железы).

[0033] Термин "стадия" в контексте заболевания (такого как рак или опухоль) относится к состоянию прогрессирования заболевания, которое указывает на тяжесть заболевания.

[0034] Термин "определение стадии", используемый здесь, относится к идентификации конкретной стадии, при которой заболевание прогрессировало.

[0035] Термин "диагноз" (вместе с его грамматическими вариациями, такими как "диагностика" или "диагностический") относятся к идентификации молекулярного или патологического состояния, заболевания или состояния, например, идентификации рака, или относится к идентификации ракового пациента, который может иметь пользу от режима конкретного лечения.

[0036] Термин "прогноз" (и его грамматические вариации, такие как "прогнозирование" или "прогностический") относится к прогнозированию вероятности пользы от лечения, например, противораковой терапии.

[0037] Термин "прогнозирование" или "предопределение", используемый здесь для обозначения вероятности того, что пациент будет отвечать либо благоприятно, либо неблагоприятно на конкретную терапию против рака предстательной железы. В одном варианте осуществления прогнозирование или предопределение относится к степени этих реакций. В одном варианте осуществления прогнозирование или предопределение относится к тому, будет ли или не будет вероятность того, что пациент выживет или его состояние улучшится после лечения, например, лечения конкретным терапевтическим агентом, или в течение определенного периода времени не будет прогрессирования заболевания.

[0038] Термин "польза" используется в самом широком смысле и относится к любому желаемому эффекту и, конкретно, включает клиническую пользу, как определено здесь.

[0039] "Индивидуум (индивид)" или "субъект" обозначает млекопитающее. Млекопитающие включают, но не ограничиваются ими, домашних животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и приматов, не являющихся людьми, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах осуществления индивидуум или субъект является человеком.

[0040] Термин «Шесть-Трансмембранный Эпителиальный Антиген предстательной железы 1» (Six-Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate 1), также называемый STEAP-1, относится к антигену клеточной поверхности, преимущественно экспрессируемому в ткани предстательной железы, и было обнаружено, что он регулируется повышающим образом во множественных раковых клеточных линиях. Hubert et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(25), 14523-8. Один примерный STEAP-1 человека имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, описанную в US 2009/0280056 A1, поданном 26 октября 2007 года, все описание которого особо включено здесь посредством ссылки.

[0041] Термины "анти-STEAP-1-антитело" и "антитело, которое связывается со STEAP-1", относятся к антителу, которое способно связывать STEAP-1 с достаточной аффинностью, так что антитело применимо в качестве диагностического агента в нацеливании на STEAP-1. В одном варианте осуществления степень связывания анти-STEAP-1-антитела с неродственным, не-STEAP-1-белком является меньшим, чем приблизительно 10% связывания антитела со STEAP-1, как измерено, например, при помощи радиоиммуноанализа (RIA). В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывается со STEAP-1, имеет константу диссоциации (Kd) ≤1 мкΜ, ≤100 нM, ≤10 нM, ≤1 нM, ≤0,1 нM, ≤0,01 нM или ≤0,001 нM (например, 10^-8 M или менее, например, от 10^-8 M до 10^-13 M, например, от 10^-9 M до 10^-13 M). В некоторых вариантах осуществления анти-STEAP-1-антитело связывается с эпитопом STEAP-1, который является консервативным среди STEAP-1 из различных видов.

[0042] "Аффинность" относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между единственным связывающим сайтом молекулы (например, антитела) и его партнером связывания (например, антигеном). Если нет других указаний, в данном контексте "аффинность связывания" относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антитела и антигена). Аффинность молекулы Х в отношении ее партнера Y может быть обычно представлена константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерена обычными способами, известными в данной области, в том числе способами, описанными здесь. Конкретные иллюстративные и примерные варианты осуществления для измерения аффинности связывания описаны в последующем описании.

[0043] Термин "антитело" используется здесь в самом широком смысле и включает различные структуры антител, включающие, но не ограничивающиеся ими, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, пока они проявляют антигенсвязывающую активность.

[0044] "Фрагментом антитела" называют молекулу, другую, чем интактное антитело, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител (например, scFv); и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

[0045] "Антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом", что и ссылочное антитело, относится к антителу, которое блокирует связывание ссылочного антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более, и, наоборот, ссылочное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более. Примерный конкурентный анализ обеспечен здесь.

[0046] Термин "антитело 15A5" относится в данном контексте к мышиному моноклональному анти-STEAP-1-антителу, продуцируемому гибридомной клеточной линией, имеющей номер депонирования микроорганизмов PTA-12259. Информация депонирования микроорганизмов гибридомной клеточной линии является следующей: ATCC Deposit №: PTA-12259; Дата депонирования: 17 ноября, 2011 года; и Депонированный материал: гибридома 15A5.1.1.1 (также называемая 7284), которая продуцирует антитело 15A5.

[0047] "Классом" антитела называют тип константного домена или константного района, имеющего его тяжелую цепь. Имеются пять главных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и несколько из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG_1, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, названы α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

[0048] Термин "полноразмерное антитело", "интактное антитело" и "цельное антитело" используются здесь взаимозаменяемо для ссылки на антитело, имеющее структуру, по существу сходную со структурой нативного антитела, или имеющую тяжелые цепи, которые содержат Fc-область, как определено здесь.

[0049] Термин "моноклональное антитело" относится в данном контексте к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е., индивидуальные антитела, содержащие эту популяцию, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих природно-встречающиеся мутации, или возникающих во время получения препарата моноклонального антитела, причем такие варианты обычно присутствуют в минорных количествах. В противоположность препаратам поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против единственной детерминанты на антигене. Таким образом, определение "моноклональный" указывает на характер антитела, которое было получено по существу из гомогенной популяции антител и не было сконструировано, как требует получение антитела по любому конкретному способу. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с данным изобретением могут быть изготовлены разнообразными способами, в том числе, но не только, гибридомным способом, способами рекомбинантных ДНК, способами фагового дисплея и способами с использованием трансгенных животных, содержащих все или часть локусов иммуноглобулина человека, причем такие способы и другие примерные способы получения моноклональных антител описываются здесь.

[0050] Термин "нативные антитела" относится к природно-встречающимся молекулам иммуноглобулинов с варьирующимися структурами. Например, нативные антитела IgG являются гетеротетрамерными гликопротеинами приблизительно 150000 дальтон, состоящими из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые являются дисульфид-связанными. От N-конца до C-конца, каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также называемую вариабельным тяжелым доменом или вариабельный домен тяжелой цепи, за которым следуют три константных домена (CH1, CH2 и CH3). Подобным образом, от N-конца до C-конца, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также называемую вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которым следует константный легкий (CL) домен. Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых kappa (κ) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности ее константного домена.

[0051] Термин "цитотоксический агент" в данном контексте относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает клеточную функцию и/или вызывает смерть или деструкцию. Цитотоксические агенты включают, но не ограничиваются ими, радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², Р³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды винка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); ингибирующие рост агенты; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; и токсины, такие как токсины с малой молекулой или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, в том числе, их фрагменты и/или варианты. Неограничивающие примеры цитотоксических агентов, подходящих для данного изобретения, включают агенты, описанные в US 2009/0280056 A1, поданном 26 октября 2007 года, полное описание которого особо включено здесь посредством ссылки. Например, в некоторых вариантах осуществления цитотоксическим агентом является монометилауристатин Е (MMAE).

[0052] "Выделенное" антитело является антителом, которое было отделено от компонента его природной среды. В некоторых вариантах осуществления антитело очищают до чистоты, большей, чем 95% или 99%, как определено, например, электрофорезом (например, ДСН-ПААГ-электрофорезом, изоэлектрическим фокусированием (IEF), капиллярным электрофорезом) или хроматографически (например, ионообменной ВЖХ или ВЖХ с обращенной фазой). Для обзора способов определения чистоты антитела, см., например, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

[0053] Термин "выделенная" нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может быть выделена из компонента ее природного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или в хромосомном местоположении, которое является отличающимся от ее природного хромосомного местоположения.

[0054] Термин "выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая анти-STEAP-1-антитело" относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим тяжелую и легкую цепи антитела (или их фрагменты), в том числе такую молекулу (такие молекулы) нуклеиновых кислот в едином векторе или раздельных векторах, и такая молекула нуклеиновой кислоты (такие молекулы нуклеиновых кислот) присутствуют в одном или нескольких местоположениях в клетке-хозяине.

[0055] Термин "вектор", в данном контексте, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной размножать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин включает вектор в качестве самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны управлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются здесь "экспрессирующими векторами".

[0056] Термины "клетка-хозяин", "линия клеток-хозяев" и "культура клеток-хозяев" используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, в том числе к потомству таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформанты" и "трансформированные клетки", которые включают первичную трансформированную клетку и потомство, произведенное из них, без учета количества пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным по содержанию нуклеиновых кислот с родительской клеткой, но может содержать мутации. Мутантное потомство, которое имеет ту же самую функцию или биологическую активность при скрининге или отборе на исходно трансформированную клетку, включено здесь.

[0057] Термин "вкладыш упаковки" используется в отношении инструкций, включенных в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировании, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предостережениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.

II. СПОСОБЫ

[0058] В одном аспекте данное раскрытие изобретения обеспечивает способы диагностики или определения стадии рака у испытуемого субъекта, использующие образцы крови испытуемого субъекта. В частности, данное описание обеспечивает способ для диагностики или определения стадии рака предстательной железы у испытуемого субъекта определением, экспрессируют ли циркулирующие опухолевые клетки (CTC) один или несколько специфических для предстательной железы маркеров.

[0059] В способах, представленных здесь, CTC анализируют на экспрессию одного или нескольких специфических для предстательной железы маркеров. Детектирование специфических для предстательной железы маркеров на CTC обеспечивает дополнительную информацию в отношении диагностики и определения стадии рака предстательной железы.

[0060] В некоторых вариантах осуществления данное раскрытие изобретения обеспечивает способы диагностики или определения стадии рака предстательной железы у испытуемого субъекта, предусматривающие: a) контактирование раковых клеток эпителиального происхождения с антителом, которое специфически связывается со специфическим для предстательной железы маркером, где раковые клетки являются клетками из образца крови, взятого у испытуемого субъекта; и b) определение, экспрессируют ли любые из раковых клеток специфический для предстательной железы маркер, где присутствие раковых клеток, которые экспрессируют специфический для предстательной железы маркер, является прогнозирующим наличие рака предстательной железы у испытуемого субъекта.

[0061] Термин "раковые клетки эпителиального происхождения" относится к раковым клеткам, которые экспрессируют по меньшей мере один эпителиальный маркер. Термин "маркер" в данном контексте относится к молекуле антигена, которая преимущественно экспрессируется на конкретном типе клеток и способствует отличению этих клеток от других типов клеток. Например, эпителиальным маркером может быть молекула антигена, универсально экспрессируемая на эпителиальных клетках, но в норме не обнаруживаемая на лейкоцитах. Раковые клетки эпителиального происхождения могут также экспрессировать опухолевый маркер, например, молекулу антигена, преимущественно обнаруживаемую на опухолевых клетках, но менее часто обнаруживаемую на нормальных клетках. В некоторых вариантах осуществления раковые клетки эпителиального происхождения содержат CTC.

[0062] В некоторых вариантах осуществления раковые клетки эпителиального происхождения экспрессируют по меньшей мере один эпителиальный маркер, который обнаруживается также преимущественно в раковых клетках. Детектирование такого эпителиального маркера служит признаком раковой клетки эпителиального происхождения. В некоторых вариантах осуществления таким эпителиальным маркером является Молекула Адгезии Эпителиальной Клетки (Epithelial Cell Adhesion Molecule) (EpCAM).

[0063] Раковые клетки эпителиального происхождения являются клетками из образца крови, полученного от испытуемого субъекта. Образцами крови может быть любой образец, который получен из крови человека, например, образец плазмы, образец сыворотки, цельная кровь или кровь, которая была обработана определенными агентами, такими как антикоагулянт. Образцы крови могут быть получены непосредственно от испытуемых субъектов или могут быть получены из организаций, которые собирают образцы от испытуемых субъектов.

[0064] В некоторых вариантах осуществления раковые клетки идентифицируют из образца крови с захватывающей композицией. В некоторых вариантах осуществления захватывающая композиция содержит лиганд, который специфически связывается с раковыми клетками эпителиального происхождения. В некоторых вариантах осуществления лиганд является антителом, которое специфически связывается с эпителиальным антигеном, преимущественно экспрессируемым на раковых клетках. В некоторых вариантах осуществления эпителиальным антигеном является EpCAM.

[0065] Термин "идентичность" или "идентификация" относится в данном контексте по существу к дифференциации раковых клеток эпителиального происхождения от остальных компонентов в образце крови. Например, раковые клетки эпителиального происхождения могут быть связаны или захвачены захватывающей композицией, тогда как остальные компоненты являются несвязанными или незахваченными.

[0066] Идентифицированные раковые клетки могут быть или могут не быть отделены от остальных компонентов в образце крови. В некоторых вариантах осуществления идентифицированные раковые клетки не являются отделенными или обогащенными от других компонентов в образце. Например, образец крови, например, образец сыворотки, может быть нанесен на предметное стекло, идентифицирован захватывающей композицией, и, без любых операций разделения или обогащения, образец может быть контактирован с другими реагентами.

[0067] В некоторых вариантах осуществления идентифицированные раковые клетки отделяют от образца крови. Термин "обогащенные" относится в данном контексте к плотности идентифицированных раковых клеток в клеточной фракции, которая является более высокой, чем в образце крови. Для отделения клеточной фракции могут быть использованы любые подходящие способы. Способы, обычно используемые в данной области, включают, без ограничения, гравитационное разделение, магнитное разделение или аффинное разделение, например, после того как раковые клетки образуют комплекс с захватывающей композицией, который позволяет отделять раковые клетки. Для гравитационного разделения захватывающая композиция может быть связана с частицами или бусинами, которые могут центрифугироваться в результате направленного вниз спина частиц или бусин для обогащения идентифицированных раковых клеток. Для магнитного разделения, захватывающая композиция может быть связана с магнитными частицами, которые могут быть отделены в подходящих магнитных полях. Для аффинного разделения, захватывающая композиция может быть иммобилизована на устройстве, таком как предметное стекло, и позволяет захватывание идентифицированных клеток.

[0068] В некоторых вариантах осуществления клеточную фракцию отделяют под действием магнитного поля. В некоторых вариантах осуществления лиганд в захватывающей композиции связан с магнитной частицей.

[0069] Магнитные частицы, подходящие для описанных здесь способов, могут быть получены с использованием способов, известных в данной области, см., например, патенты США 5597531, 5698271 и 6365362, а также процедур, описанных в Liberti et al., In Fine Particles Science and Technology, 777-90, E. Pelizzetti (ed.) (1996). Вкратце, магнитные частицы содержат магнитную сердцевину (магнитный кор) (например, оксиды железа), которая покрыта полимерами или белками (например, бычьим сывороточным альбумином и казеином). Магнитная масса и размер магнита магнитных частиц могут регулироваться, так что магнитные частицы являются чувствительными к магниту, но по существу являются невидимыми для аналитических способов клеток, таких как детектирование иммунофлуоресценции. Подходящий размер магнитных частиц может быть меньшим, чем 200 нм, предпочтительно с подходящим диапазоном магнитных частиц, например, в пределах 90-150 нм. Магнитная масса магнитных частиц может находиться между 70-90%.

[0070] В некоторых вариантах осуществления магнитная частица является коллоидной. Такие коллоидные магнитные частицы являются по существу стабильными в растворе на протяжении продолжительного периода времени, и не имеют тенденции агрегировать при силе тяготения или в отсутствие приложенного магнитного поля. В некоторых вариантах осуществления магнитные частицы являются коллоидными наночастицами.

[0071] Лиганд в захватывающей композиции может быть связан с магнитными частицами с использованием любых подходящих способов, известных в данной области. Например, захватывающая композиция может быть непосредственно связана с магнитной частицей с использованием гетеробифункциональных линкеров, таких как сукцинимидилпропионо-дитиопиридин (SPDP), и сульфосукцинимидил-4-[малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат (SMCC)). Для другого примера, захватывающая композиция, содержащая биотинилированное антитело, может быть связана с магнитной частицей, конъюгированной со стрептавидином. Захватывающая композиция и магнитные частицы могут быть также быть введены с другими конъюгирующими парами, которые могут осуществлять связывание, например, с парами авидин-биотин, белок А-антитело Fc, рецептор-лиганд и лектин-карбогидрат.

[0072] В некоторых вариантах осуществления захватывающая композиция содержит антитело EpCAM, связанное с магнитными коллоидными наночастицами. В некоторых вариантах осуществления может быть использована система CellSearch^® (Veridex, New Jersey) для выделения клеточной фракции, обогащенной идентифицированными клетками.

[0073] Раковые клетки эпителиального происхождения контактируют с антителом, которое специфически связывается с простата-специфическим маркером. Термин "простата-специфический" в данном контексте указывает на то, что маркер преимущественно обнаруживается в тканях предстательной железы (простаты) и по существу отличает ткани или клетки предстательной железы от других тканей или клеток. В некоторых вариантах осуществления простата-специфический маркер является маркером поверхности или мембраны клеток предстательной железы (простаты). В некоторых вариантах осуществления простата-специфический маркер выбран из группы, состоящей из: Шесть-трансмембранного эпителиального антигена предстательной железы (STEAP-1) (см., например, Hubert et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14523-14528), простата-специфического мембранного антигена (PSM) (см., например, Israeli, R. S. et al., (1993) Cancer Res. 53, 227-230), опухолевого антигена рака предстательной железы (PCTA-1) (см., например, Su, Z. Z. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7252-7257) и антигена стволовых клеток предстательной железы (PSCA) (см., например, Reiter, R. E. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA 95, 1735-1740). Один примерный STEAP-1 человека имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, описанную в US 2009/0280056 A1, поданной 26 октября 2007 года, полное описание которой особо включено здесь посредством ссылки.

[0074] В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с простата-специфическим маркером, содержит анти-STEAP-1-антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-STEAP-1-антитело связывается со STEAP-1 с K_D≤1000 нМ. Анти-STEAP-1-антитело может быть поликлональным антителом или моноклональным антителом и может быть антителом любого подходящего вида, таким как, например, овечье антитело, кроличье антитело или мышиное антитело.

[0075] В некоторых вариантах осуществления анти-STEAP-1-антителом является мышиное моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-STEAP-1-антителом является 15A5, продуцируемое гибридомной клеткой, имеющей номер депозит