Пробиотические штаммы для лечения и/или профилактики диареи

Пробиотические штаммы для лечения и/или профилактики диареи

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Основная патентная заявка

Настоящая патентная заявка заявляет приоритет Французской патентной заявки номер FR 1261916, поданной 12 декабря 2012. Содержание Французской патентной заявки полностью включается в настоящее описание путем отсылки.

Область техники

Изобретение имеет отношение к области пробиотических штаммов, в частности пробиотических штаммов Bacillus, предназначенных для применения при лечении и/или профилактике диареи. Данное изобретение также имеет отношение к способу отбора пробиотических штаммов, обладающих особенным свойством воздействовать на абсорбцию (всасывание) воды в толстой кишке.

Уровень техники

В случае нормального функционирования толстый кишечник человека абсорбирует около 99% воды, поступающей в ее просвет, что составляет около 2 литров воды в день. Толстый кишечник обладает способностью всасывать дополнительно до 4 литров воды. Однако при количестве воды свыше 6 литров его способность к абсорбции подавляется и развивается диарея.

Диарея является распространенной проблемой (около двух миллиардов случаев в мире каждый год), которая характеризуется стулом жидкой или мягкой консистенции, более обильным и частым, чем обычно (более 3 дефекаций в день). В экстремальных случаях в день может быть потеряно более 20 литров жидкости.

Диарея является не болезнью, а симптомом. Наиболее общей причиной диареи является проглатывание загрязненной воды или пищи; в таком случае она продолжается один-два дня и не требует лечения. Однако собственно диарея может вызвать обезвоживание, которое может оказаться фатальным, особенно у младенцев, причем при потере веса, достигающей 10%, требуется неотложная больничная помощь. С точки зрения Всемирной организации здравоохранения диарея является второй наиболее общей причиной детской смертности в развивающихся странах и обуславливает 18% смертей детей младше 5 лет (Bryce et al. Lancet, 2005, 365: 1147-1152).

Вызванное диареей обезвоживание происходит в тех случаях, когда потери жидкости не компенсируются. В нормальной ситуации в толстой кишке вода удаляется из экскрементов. Явление обратного всасывания воды, содержащейся в поглощенном веществе, происходит на уровне клеток толстой кишки путем сочетания активного и пассивного транспорта воды и электролитов. На уровне крипт эпителия толстой кишки происходит секреция воды из крови в окружающую среду. У здорового человека эти два явления уравновешивают друг друга и способны сохранять соответствующую гидратацию стула, которая способствует прохождению содержимого через кишечник и улучшает условия циркуляции молекул.

Существует множество различных причин диареи, включая диарею инфекционного происхождения, вызванную вирусным, бактериальным или паразитарным патогеном, и неинфекционную диарею, такую как диарея, вызванная пищевой непереносимостью, жирной пищей, алкоголем, психологическим фактором, введением лекарственного средства, применением терапевтической процедуры, диарея, связанная с болезнью или с клиническим состоянием, или диарея, связанная с отменой лекарственного средства.

В зависимости от продолжительности симптомов различают острую диарею и хроническую диарею, симптомы которой продолжаются менее двух недель и по меньшей мере две недели, соответственно.

Классическим медикаментозным лечением диареи является, например, лоперамид, оказывающий действие как путем стимулирования абсорбции воды и электролитов так и путем уменьшения времени транзита. Однако уменьшение времени транзита может быть проблематичным при тяжелых инфекциях типа Salmonella, Shigella или Clostridium difficile, так как патогенная бактерия остается в кишечнике в течение длительного времени.

Привлекательной альтернативой для лечения и/или предотвращения диареи являются пробиотики. Наиболее широко используемыми при этом показании пробиотиками являются лактобактерии. Как правило, считается, что пробиотики оказывают благоприятное действие на иммунную систему и на равновесие внутрикишечной флоры.

Другие исследования пытаются определить новые мишени для лечения и предотвращения диареи. Так, документ WO 2004/028480 описывает соединения типа тиазолидинона для уменьшения эффективности транспорта ионов хлора посредством белка CFTR (муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости) и его применения при лечении секреторной диареи. Bradford et al. (Am. J. Physiol. Gastrointes. Liver Physiol., 2009, 296: G886-G898) рассматривают средства лечения непроходимости кишечника и обезвоживания у пациентов с муковисцидозом (при котором наблюдается измененная экспрессия CFTR).

Более того, было описано, что частичная или полная потеря белка NHE3 (натрий-водородный ионообменный белок 3) у мышей с муковисцидозом уменьшала число случаев непроходимости кишечника, а именно посредством увеличения жидкости в кишечнике, и был сделан вывод о том, что NHE3 представляет собой потенциальную мишень для регулирования жидкости в кишечнике у пациентов с муковисцидозом и с измененной экспрессией CFTR.

Следовательно, по-прежнему существует необходимость в новых стратегиях лечения и/или предотвращения диареи.

Раскрытие изобретения

В общем, настоящее изобретение основывается на открытии того факта, что определенные пробиотические штаммы способны действовать непосредственно на диарею, вызывая абсорбцию (поглощение) воды, присутствующей в избытке в толстой кишке. Изобретатели неожиданно обнаружили, что некоторые пробиотические штаммы способны ингибировать экспрессию транспортеров, участвующих в секреции воды в толстой кишке, и/или стимулировать экспрессию транспортеров, участвующих в абсорбции воды в толстой кишке, и могут использоваться для лечения и/или предотвращения диареи.

Итак, эти пробиотические штаммы не действуют как ингибиторы транспортеров, т.е. не действуют путем связывания с транспортерами, затрудняя, таким образом, их функционирование, а влияют на их экспрессию и, следовательно, на количество присутствующих транспортеров.

Более того, учитывая, что эти пробиотические штаммы влияют непосредственно на абсорбцию воды, присутствующей в избытке в толстой кишке, они обладают преимуществом, которое позволяет использовать их для предотвращения и/или лечения любого типа диареи, в частности, независимо от того, является ли диарея инфекционной или неинфекционной и при наличии или при отсутствии дисбиоза.

Таким образом, настоящее изобретение имеет отношение к способу отбора пробиотического штамма для лечения и/или предотвращения диареи, указанный способ включает стадии:

- оценку воздействия по меньшей мере одного тестируемого штамма на экспрессию по меньшей мере одного транспортера, вовлеченного в абсорбцию или секрецию воды в толстой кишке, и

- отбор по меньшей мере одного штамма, который вызывает уменьшение экспрессии по меньшей мере одного транспортера, вовлеченного в секрецию воды в толстой кишке, и/или увеличение по меньшей мере одного транспортера, вовлеченного в абсорбцию воды в толстой кишке.

Конкретнее, в первом аспекте настоящее изобретение имеет отношение к способу отбора пробиотического штамма для лечения и/или предотвращения диареи, при этом указанный способ включает стадии:

- оценку воздействия по меньшей мере одного тестируемого штамма на экспрессию белка CFTR (муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости) и/или на экспрессию белка NHE3 (натрий-водородный ионообменный белок 3), и

- отбор по меньшей мере одного штамма, который вызывает уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3.

В некоторых вариантах осуществления тестируемый штамм представляет собой дрожжевой штамм или бактериальный штамм. В частности, бактериальным штаммом, предназначенным для тестирования, может быть штамм Bacillus, предпочтительно штамм Bacillus subtilis.

В определенных вариантах осуществления экспрессия белка CFTR и/или белка NHE3 оценивается при помощи электрофореза, вестерн-блоттинга, иммуноанализа, иммуногистохимического анализа, иммуноцитохимического анализа, масс-спектрометрии, RT-ПЦР или нозерн-блоттинга.

В другом аспекте настоящее изобретение имеет отношение к пробиотическому штамму, выбранному с использованием метода согласно изобретению и предназначенному для лечения и/или предотвращения диареи.

В определенных вариантах осуществления пробиотический штамм является штаммом Bacillus subtilis, предпочтительно штаммом Bacillus subtilis CU1, размещенном на хранение в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes / Национальная коллекция культур микроорганизмов, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) 25 октября 2001 под номером I-2745.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение имеет отношение к клеткам, полученным путем культивирования пробиотического штамма, выбранного с помощью способа согласно изобретению и предназначенного для лечения и/или предотвращения диареи.

В частности, данное изобретение имеет отношение к клеткам Bacillus subtilis, полученным путем культивирования штамма Bacillus subtilis CU1, размещенного на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745, предназначенного для применения при лечении и/или предотвращении диареи.

Настоящее изобретение также имеет отношение к способу лечения и/или профилактики диареи у пациента, при этом данный способ включает введение пациенту эффективного количества клеток, полученных путем культивирования пробиотического штамма, выбранного с помощью способа согласно изобретению.

В определенных вариантах осуществления способ лечения и/или предотвращения диареи включает введение клеток Bacillus subtilis, полученных путем культивирования пробиотического штамма Bacillus subtilis, предпочтительно штамма Bacillus subtilis CU1, размещенного на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745.

В другом аспекте настоящее изобретение имеет отношение к композиции, предназначенной для применения при лечении и/или предотвращении диареи, при этом указанная композиция содержит по меньшей мере один пробиотический штамм согласно изобретению, или клетки, полученные культивированием указанного штамма. В частности, композиция содержит клетки Bacillus subtilis, полученные культивированием штамма Bacillus subtilis CU1, размещенного на хранение в CNCM 25 октября 2001 под номером I-2745.

Формы диареи, которые можно лечить профилактически и/или терапевтически в соответствии с изобретением, включают острую диарею и хроническую диарею.

В определенных вариантах осуществления диарея, которую лечат в соответствии с изобретением, является диареей инфекционной природы, которая вызвана вирусным, бактериальным или паразитарным патогеном.

В других вариантах осуществления диарея, которую лечат в соответствии с изобретением, является диареей неинфекционной природы.

Диарея неинфекционной природы может быть, например, диареей, вызванной пищевой непереносимостью, диареей, вызванной жирной диетой, диареей, вызванной алкоголем, диареей, вызванной психологическим фактором, диареей, вызванной введением лекарственного препарата, диареей, вызванной применением терапевтической процедуры, диареей, связанной с болезнью или с клиническим состоянием, или диареей, связанной с отменой лекарственного средства.

Более подробное описание определенных предпочтительных вариантов осуществления изобретения приведено ниже.

Подробное описание изобретения

Как было упомянуто выше, настоящее изобретение имеет отношение к установлению пробиотических штаммов, способных влиять на абсорбцию воды в толстой кишке посредством прямого воздействия на уровень транспортеров, участвующих в регуляции жидкости в кишечнике, и их применению в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения и/или предотвращения диареи.

I. Способ отбора пробиотических штаммов

Целью способа отбора согласно изобретению является установление пробиотического штамма, пригодного для лечения и/или предотвращения диареи.

Таким образом, настоящее изобретение имеет отношение к отбору пробиотического штамма, предназначенного для лечения и/или предотвращения диареи, при этом указанный способ включает следующие стадии:

- оценку воздействия по меньшей мере одного тестируемого штамма на экспрессию по меньшей мере одного транспортера, вовлеченного в абсорбцию или секрецию воды в толстой кишке, и

- отбор по меньшей мере одного штамма, который вызывает уменьшение экспрессии по меньшей мере одного транспортера, вовлеченного в секрецию воды в толстой кишке, и/или увеличение по меньшей мере одного транспортера, вовлеченного в абсорбцию воды в толстой кишке.

Примером транспортера, связанного с секрецией воды в толстой кишке, является белок CFTR (муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости).

Примером транспортера, связанного с абсорбцией воды в толстой кишке, является белок NHE3 (натрий-водородный ионообменный белок 3).

Предпочтительный способ согласно изобретению отличается тем, что он включает следующие стадии:

- оценку воздействия по меньшей мере одного тестируемого штамма на экспрессию белка CFTR и/или на экспрессию белка NHE3, и

- отбор по меньшей мере одного штамма, который вызывает уменьшение экспрессии белка CFTR и/или увеличение экспрессии белка NHE3.

Штамм, выбранный в результате применения способа согласно изобретению, таким образом, является пробиотическим штаммом, пригодным для лечения и/или предотвращения диареи.

Термин "пробиотический штамм" в данном описании предназначен для обозначения штамма живого микроорганизма, который оказывает благоприятное воздействие на здоровье хозяина.

Как правило, хозяином является человек, однако можно допустить, что хозяином может быть другое млекопитающее, например собака, кошка, жвачное животное, а именно, овца, коза, теленок, корова, олень, верблюд, лошадь, кабан, в частности свиньи и поросята, leporids (заячьи), муридовые (мышиные) и грызуны семейства Caviidae (свинковые).

Тестируемые штаммы

Штаммом, тестируемым с использованием способа согласно изобретению, может быть любой штамм микроорганизма.

В определенных вариантах осуществления тестируемым штаммом является дрожжевой штамм. В числе дрожжей, которые могут проходить тестирование, можно упомянуть, например, дрожжи рода Saccharomyces, в частности виды Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae, дрожжи рода Kluyveromyces, в частности вид Kluyveromyces marxianus.

В других вариантах осуществления тестируемым штаммом является бактериальный штамм.

Тестируемый штамм предпочтительно выбирают из бактерий, признанных безопасными для людей и/или животных.

В числе бактерий, которые могут проходить тестирование, можно упомянуть, например, бактерии рода Bifidobacterium, в частности виды Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve; бактерии рода Lactobacillus, в частности виды Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosu и Lactobacillus salivarius; бактерии рода Weisella, в частности виды Weisella cibaria, Weisella kimchii, Weisella thailandensis; бактерии рода Bacillus, в частности виды Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus и Bacillus clausii; бактерии рода Lactococcus, в частности вид Lactococcus lactis; бактерии рода Enterococcus, в частности виды Enterococcus faecium, Enterococcus fecalis; бактерии рода Streptococcus, в частности вид Streptococcus thermophilus; бактерии рода Escherichia, в частности вид Escherichia coli.

Экспрессия CFTR и/или NHE3

Способ согласно изобретению включает оценку воздействия тестируемого штамма на экспрессию по меньшей мере одного транспортера, связанного с абсорбцией или секрецией воды в толстой кишке, в частности на экспрессию белка CFTR и/или белка NHE3.

При использовании в описании "белок CFTR" подразумевает белок, который у человеческого вида кодируется геном CFTR ("муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости"), который располагается на локусе 7q31.2, на участке q31.2 длинного плеча хромосомы 7. Ген CFTR является высоко консервативным среди видов. У человека белок CFTR имеет, например, полипептидную последовательность с учетным номером в GenBank NP_00483, которая содержит 1480 аминокислот.

Белок CFTR формирует проницаемый для ионов хлора и тиоцианата канал в эпителиальных клетках.

Белок CFTR экспрессируется на апикальном полюсе эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы, желчных протоков, кишечных крипт, трахео-бронхиального дерева, почечных канальцев, половой системы и потовых желез.

Было продемонстрировано, что ингибиторы CFTR, такие как тиазолидинон, находят применение при лечении и/или профилактике диареи (Verkman et al., Curr. Pharm. Des., 2006, 12: 2235-2247).

Следовательно, протестированный в методе отбора согласно изобретению штамм, вызывающий уменьшение экспрессии белка CFTR, можно использовать для лечения и/или предотвращения диареи.

При использовании в описании "белок NHE3" подразумевает белок, который у человеческого вида кодируется геном NHE3 ("натрий-водородный ионообменный белок 3", также известный под названием SLC9A3 "представитель 3 семейства 9 переносчиков растворенных веществ"), который располагается на хромосоме 13. У людей белок NHE3 имеет, например, полипептидную последовательность с учетным номером в GenBank NP_004165, которая содержит 834 аминокислоты.

Белок NHE3 экспрессируется в нефроне почки и в апикальной мембране эндотелиальных клеток стенки кишечника, где он, главным образом, отвечает за поддержание баланса натрия.

Показано, что генетически модифицированные мыши с инактивированным геном NHE3 страдают от диареи (Schultheis et al., 1998, Nat. Genet 19: 282-285).

Следовательно, протестированный в методе отбора согласно изобретению штамм, вызывающий увеличение экспрессии белка NHE3, можно использовать для лечения и/или предотвращения диареи.

В контексте настоящего изобретения количественное определение воздействия тестируемого штамма на экспрессию транспортера, участвующего в абсорбции или секреции воды в толстой кишке, в частности на экспрессию белка CFTR и/или белка NHE3, может осуществляться с помощью любого метода, известного специалисту в данной области техники (см., например, Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", 1988, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY), так как сущность используемого способа не является критическим или ограничивающим фактором.

В общем, уровень экспрессии белка может быть определен с помощью прямого метода, такого как метод электрофореза, вестерн-блоттинг, метод иммуноанализа, иммуногистохимический метод, иммуноцитохимический метод или метод масс-спектрометрии.

Кроме того, уровень экспрессии белка может быть определен непрямым способом.

Непрямой метод может включать измерение уровня транскрипции соответствующего гена, например, с помощью RT-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой), предпочтительно с помощью количественной RT-ПЦР, или с помощью нозерн-блоттинга.

Другим примером непрямого метода является метод, который включает в себя измерение активности белка, активности белка, который коррелирует с количеством присутствующего функционального белка.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью электрофореза.

Электрофорез позволяет разделить белки в соответствии с их молекулярной массой. Обычно используется электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем лаурилсульфат натрия (также называемый SDS-PAGE - электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Также можно использовать двухмерный электрофорез, такой как изоэлектрическое фокусирование, при этом возможно разделение белков в соответствии с их молекулярной массой и их изоэлектрической точкой.

В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью Вестерн-блоттинга.

Вестерн-блоттинг включает разделение белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, а затем перенос белков из полиакриламидного геля на поддерживающую мембрану, на которой интересующие белки обнаруживают путем использования меченых антител, специфических к указанным белкам.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью иммуноанализа. При использовании в описании "иммуноанализ" означает какой-либо метод, использующий реакцию антиген-антитело для обнаружения и определения количества антигенов, антител или сходных субстанций. Комплекс антиген-антитело можно визуализировать несколькими способами. В большинстве случаев антитело является антителом, конъюгированным с ферментом (например, пероксидазой), который может катализировать реакцию, вызывающую окрашивание (например, иммунопероксидазное окрашивание). Альтернативно, антитела могут быть помечены флуорофором (например, FITC, родамином, техасским красным или Alexa Fluor). Затем комплекс антитело-антиген обнаруживают с помощью иммунофлуоресценции.

Моноклональные антитела, специфические к человеческому белку CFTR и человеческому белку NHE3, хорошо известны в данной области техники и коммерчески доступны.

В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью иммуногистохимического анализа. Термин "иммуногистохимический анализ" имеет отношение к методу, основанному на использовании антител и предназначенному для определения локализации белка в тканях. Ткань в большинстве случаев фиксируют, промывают, а затем пермеабилизируют. Затем ткань инкубируют с первичными антителами, специфически распознающими нужный белок (в данной ситуации, например, белок CFTR или белок NHE3). Добавляют вторичные антитела, соединенные с системой обнаружения. Системой обнаружения является, например, флуорохром или фермент, который в присутствии субстрата вызывает цветную реакцию. Это вторичное антитело распознает константную область Fc первичного антитела, причем оно должно происходить из видов, отличных от видов первичного антитела. После заключения в среду, защищающую флюоресценцию образца, в том случае, если это флуорохром, или в присутствии субстрата, в том случае, если это фермент, ткань исследуют, используя флуоресцентный или конфокальный микроскоп. Затем уровень экспрессии представляющего интерес белка может быть определен с помощью денситометрии (измерения оптической плотности), путем измерения интенсивности флуоресценции или с помощью спектрофотометрии.

В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью иммуноцитохимического анализа.

Иммуноцитохимический анализ является методом, сходным с иммуногистохимическим анализом, кроме того, что исходный образец является цитологическим препаратом, а не тканью.

В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью масс-спектрометрии.

В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью RT-ПЦР.

RT-ПЦР состоит из обратной транскрипции РНК в ДНК с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР). RT-ПЦР предпочтительно является количественной RT-ПЦР, которая позволяет количественно определить исходную РНК, соответствующую нужному белку.

В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень экспрессии транспортера и, в частности, белка CFTR и/или белка NHE3 определяется с помощью нозерн-блоттинга.

Нозерн-блоттинг представляет собой метод, состоящий из разделения РНК в соответствии с размером с помощью гель-электрофореза, затем переноса РНК из геля на мембрану, где она может быть обнаружена с помощью меченого гибридизационного зонда, который является специфическим к РНК белка, который нужно определить количественно.

Биологический образец

Один метод согласно изобретению включает оценку воздействия тестируемого штамма на экспрессию по меньшей мере одного транспортера, участвующего в абсорбции или секреции воды в толстой кишке, в частности на экспрессию белка CFTR и/или белка NHE3, в биологическом образце.

Использованный в описании термин "биологический образец" используется в его широком смысле. Биологический образец может быть любой биологической тканью, в которой экспрессируется представляющий интерес белок (в частности, белок CFTR или белок NHE3) и, следовательно, может быть обнаружен и количественно определен.

Биологическими образцами, которые могут использоваться при применении способа отбора согласно изобретению, могут быть, например, образцы кишечника, протоков поджелудочной железы, желчных протоков, почечных канальцев, трахеобронхиального дерева, половой системы, потовых желез и нефрон почки.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления биологический образец является образцом кишечника, предпочтительно, образцом толстой кишки.

Образец ткани предпочтительно получают от животной модели, например, с помощью биопсии. Животная модель предпочтительно является млекопитающим, например мышью, крысой, кроликом, свиньей, обезьяной, или цыпленком. Животное-модель может быть трансгенным животным.

Предпочтительным биологическим образцом согласно изобретению является образец ткани, содержащей колоноциты, т.е. клетки слизистой оболочки толстой кишки.

Биологический образец также может быть биологическим материалом, полученным из ткани, в которой экспрессируется представляющий интерес белок.

Полученный биологический материал, например, выбирают из клеток, выделенных из образца ткани, или из белков, экстрагированных из клеток, выделенных из образца ткани.

Термин "биологический образец" также включает клетки клеточной линии, экспрессирующей представляющий интерес белок, в частности белок CFTR и/или белок NHE3.

Примеры клеточных линий, экспрессирующих белок CFTR, включают Сасо-2 клетки, выделенные из толстой кишки, НТ-29 клетки, выделенные из толстой кишки, или Т84 клетки, выделенные из толстой кишки.

Примеры клеточных линий, экспрессирующих белок NHE3, включают Сасо-2 клетки, выделенные из толстой кишки, НТ-29 клетки, выделенные из толстой кишки, или Т84 клетки, выделенные из толстой кишки.

Эти клеточные линии имеются в продаже, например, от АТСС (Американская коллекция типовых культур).

В некоторых вариантах осуществления биологический образец является белковым экстрактом, выделенным из клеток или из тканей, экспрессирующих представляющий интерес белок, в частности белок CFTR и/или NHE3. Методы выделения белков хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, "Protein Methods", D.M. Bollag et al. 2^nd Ed., 1996, Wiley-Liss; "Protein Purification Methods: A Practical Approach", E.L. Harris and S. Angal (Eds.), 1989; "Protein Purification Techniques: A Practical Approach", S. Roe, 2^nd Ed., 2001, Oxford University Press; "Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization", H. Ahmed, 2005, CRC Press: Boca Raton, FL). Кроме того, имеются коммерческие наборы для выделения белков из тканей или из биологических жидкостей. Такие наборы продают, например, компании BioRad Laboratories (Hercules, СА), BD Biosciences Clontech (Mountain View, CA), Chemicon International, Inc. (Temecula, CA), Calbiochem (San Diego, CA), Pierce Biotechnology (Rockford, IL) и Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Специалисту в данной области техники ясно, как выбрать набор, наиболее подходящий для определенной ситуации.

Действие тестируемого штамма

В способе согласно изобретению воздействие тестируемого штамма на экспрессию транспортера, участвующего в абсорбции или секреции воды в толстой кишке, в частности белка CFTR и/или белка NHE3, определяется путем сравнения уровня экспрессии представляющего интерес белка, измеренного в биологическом образце, полученном от животного-модели, которого лечили тестируемым штаммом, и уровня экспрессии нужного белка, измеренного в биологическом образце (того же вида) полученном от животного-модели (того же вида), которое не подвергалось лечению тестируемым штаммом. Последнее из упомянутых животных называется контрольным животным.

Таким образом, например, при применении способа согласно изобретению, при котором биологический образец берется у животного-модели, установленное количество клеток, полученных культивированием тестируемого штамма, вводится животному-модели.

Данное количество клеток может быть введено однократно.

Альтернативно, данное количество клеток может быть введено несколько раз или в один и тот же день или в течение нескольких дней или недель.

Клетки, полученные культивированием тестируемого штамма, могут быть введены с помощью любого способа, подходящего для используемой животной модели. Например, введение может осуществляться с помощью инъекции, в частности внутрижелудочной инъекции, раствора или суспензии, содержащей подходящий разбавитель (среду) и установленное количество клеток, полученных культивированием тестируемого штамма. Такой же объем раствора, содержащего только разбавитель, вводится контрольному животному.

Более того, при применении способа согласно изобретению, в котором биологический образец является линией клеток, воздействие тестируемого штамма определяется путем сравнения уровня экспрессии интересующего белка, измеренного в клетках клеточной линии, которые были обработаны тестируемым штаммом, и уровня экспрессии нужного белка, измеренного в клетках (той же самой клеточной линии), которые не подвергались обработке тестируемым штаммом. Последние из упомянутых клетки называются контрольными клетками.

Таким образом, например, при применении способа согласно изобретению, в котором биологический образец представляет собой клеточную линию, клетки клеточной линии инкубируют с установленным количеством раствора или суспензии, содержащей подходящий разбавитель и установленное количество клеток, полученных при культивировании тестируемого штамма. Контрольные клетки клеточной линии инкубируют в тех же самых условиях в присутствии того же самого объема раствора, содержащего только разбавитель.

Методы культивирования штамма, является ли он дрожжевым штаммом или бактериальным штаммом, известны в данной области техники, при этом специалист в данной области техники знает, каким образом оптимизировать условия культивирования для каждого штамма в зависимости от природы.

Более того, специалист в данной области техники знает, как определить оптимальное количество клеток, полученных путем культивирования тестируемого штамма, предназначенных для введения животному-модели или для инкубации с клетками клеточной линии.

Например, клетки Bacillus subtilis получают культивированием штамма Bacillus subtilis в культуральной среде, в частности, как описано в книге Biotechnology, 5th edition, R. Scriban, Edition Tec. & Doc., 1999, ISBN: 2-7430-0309-X.

Как правило, метод получения клеток Bacillus subtilis культивированием штамма Bacillus subtilis включает стадии:

- посев в культуральную среду инокулума штамма Bacillus subtilis,

- культивирование в аэробных условиях для размножения клеток,

- отделение биомассы от культуральной среды для получения клеток Bacillus subtilis.

Полученные таким образом клетки Bacillus subtilis находятся преимущественно в вегетативной форме.

Выражение "преимущественно в вегетативной форме" означает, что по меньшей мере 70% клеток находятся в вегетативной форме, предпочтительно по меньшей мере 80% и более предпочтительно по меньшей мере 90%.

"Вегетативная форма" бактерии обозначает форму бактерии, помещенной в благоприятные условия.

Примером благоприятных условий является нелимитирующая культуральная среда при температуре и значении pH, благоприятных для размножения бактерий.

Нелимитирующая культуральная среда содержит все ингредиенты, необходимые для размножения клеток.

Способ получения клеток Bacillus subtilis также может включать промежуточную стадию размещения клеток в неблагоприятные условия, между стадией культивирования в аэробных условиях и стадией отделения биомассы. Клетки Bacillus subtilis, полученные в конце такого способа получения, преимущественно находятся в спорулирующей форме.

Выражение "преимущественно в спорулирующей форме" означает, что по меньшей мере 70% клеток находятся в спорулирующей форме, предпочтительно по меньшей мере 80% и более предпочтительно по меньшей мере 90%.

"Спорулирующая форма" бактерии обозначает форму бактерии, помещенной в неблагоприятные условия. Таким образом, спорулирующая форма является устойчивой формой, которая позволяет бактерии противостоять неблагоприятным условиям среды, таким как, например, отсутствие питательных веществ, т.е., лимитирующая питательная среда, недостаток воды, широкое колебание значений pH или температуры, или прохождение через пищеварительный тракт.

Неблагоприятные условия для клеток бактерий создают, например, не обновляя культуральную среду бактерий, прекращая поставку питательных веществ в культуральную среду, используя лимитирующую питательную среду, изменяя температуру, изменяя значение pH или их комбинацию.

Способ получения клеток Bacillus subtilis также может содержать дополнительную стадию высушивания клеток для получения клеток Bacillus subtilis в сухой форме.

Выражение "клетки Bacillus subtilis в сухой форме" означает, что биомасса, полученная в конце данного способа получения клеток Bacillus subtilis, содержит более 90% сухого вещества, предпочтительно более 95% сухого вещества.

Высушивание представляет собой, например, сушку лиофилизацией, сушку способом вихревого напыления или сушку распылением.

Установление пробиотического штамма, подходящего для лечения и/или предотвращения диареи

Путем сравнения уровня экспрессии интересующего белка, измеренного в образце, обработанном тестируемым штаммом, и уровня экспрессии интересующего белка, измеренного в контрольном образце, можно установить, вызывает ли тестируемый штамм уменьшение или увеличение экспрессии интересующего белка или оказывает ли он воздействие на указанную экспрессию.

Как было сказано выше, штамм, установленный с помощью метода отбора согласно изобретению и вызывающий уменьшение экспрессии по меньшей мере одного транспортера, участвующего в секреции воды в толстой кишке, и/или увеличение экспрессии по меньшей мере одного транспортера, участвующего в абсорбции воды в толстой кишке, является пробиотическим штаммом, который может использоваться при лечении и/или предотвращении диареи.

Изобретатели продемонстрировали, что такой пробиотический штамм способен вызывать абсорбцию воды, присутствующей в избытке в толстой кишке, и поэтому находит применение при лечении и/или предотвращении диареи.

"Уменьшение экспрессии транспортера, участвующего в секреции воды в толстой кишке", означает значимое уменьшение экспрессии указанного транспортера относительно его экспрессии при отсутствии тестируемого штамма.

"Значимый" характер этого уменьшения определяется с помощью статистического анализа.

В том случае, когда воздействие на экспрессию транспортера определяется с помощью иммуногистохимического анализа, "уменьшение экспрессии транспортера" соответствует значимому уменьшению интенсивности флуоресценции / мкм², что соответствует экспрессии указанного транспортера относительно экспрессии при отсутствии тестируемого штамма.

"Увеличение экспрессии транспортера, участвующего в абсорбции воды в толстой кишке", обозначает значимое увеличение экспрессии указанного транспортера относительно его экспрессии при отсутствии тестируемого штамма.

"Значимый" характер этого увеличения определяется с помощью статистического анализа.

В том случае, когда воздействие на экспрессию транспортера определяется с помощью иммуногистохимического анализа, "увеличение экспрессии транспортера" соответствует значимому увеличению интенсивности флуоресценции / мкм², что соответствует экспрессии указанного транспортера относительно экспрессии при отсутствии тестируемого штамма.

Специалисту в данной области техники понятно, что установление пробиотического штамма, пригодного для лечения и/или предотвращения диареи, может быть осуществлено с помощью только одного способа отбора согласно изобретению. Способ согласно изобретению может быть осуществлен при использовании биологического образца одного типа, например, данного животного-модели, или при использовании нескольких типов биологических образцов, например, клеточной линии, а затем по меньшей мере одного животного-модели.

Альтернативн