Одноцепочечные антитела и другие гетеромультимеры

Одноцепочечные антитела и другие гетеромультимеры

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка является родственной и испрашивает приоритет предварительной заявки США с серийным номером 61/597486, поданной 10 февраля 2012, описание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

Список последовательностей

Настоящая заявка содержит список последовательностей, предлагаемый в формате ASCII при посредстве EFS-Web и включенный в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 28 января 2013, озаглавлена P4733R1WO_PCTSequenceListing.txt и имеет размер 7501 байт.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым рекомбинантным белкам и белковым комплексам, включающим гетеромультимеры (например, одноцепочечные антитела, многоцепочечные антитела и комплексы иммуноадгезин-антитело), которые обладают моно- или мультиспецифичностью, а также к способам их конструирования и получения. Настоящее изобретение также относится к новому применению технологий, используемых для получения моно- или мультиспецифичных гетеромультимеров. Гетеромультимеры, полученные с помощью описанных в настоящем описании способов, можно использовать в качестве терапевтического средства для лечения любого заболевания или патологического состояния, а также для любого другого применения, в котором желательно использовать антитело.

Уровень техники изобретения

Разработка технологий получения антител или других гетеромультимеров с разными характеристиками связывания (например, моноспецифичных или мультиспецифичных), которые можно использовать и масштабировать в коммерческих и терапевтических целях, является труднодостижимой. Многие способы проходили испытания, однако почти все они имеют существенные недостатки, включающие, в числе прочих проблем, плохую растворимость или невозможность экспрессии в клетках млекопитающих, а также низкий выход образующегося гетеродимера при техническом переходе к промышленному получению, или иммуногенность, короткий период полужизни in vivo или нестабильность гетеродимера (например, Hollinger et al., (1993) PNAS 90:6444-6448; US 5,932,448; US 6,833,441; US 5,591,828; US7, 129,330; US 7,507,796; Fischer et al., (2007) Pathobiology 74:3-14; Booy (2006) Arch. Immunol. Ther. Exp. 54:85-101; Cao et al., (2003) 55: 171-197; and Marvin et al., (2006) Current Opinion in Drug Discovery & Development 9(2): 184-193). Таким образом, существует потребность в усовершенствованных технологиях и процессах для получения антител или других гетеромультимеров с различными характеристиками связывания.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предлагает гетеромультимеры (например, новые одноцепочечные антитела (scAb), многоцепочечные антитела (mcAb) и комплексы иммуноадгезин-антитело), а также способы конструирования, промышленного получения и применения гетеромультимеров. В одном из аспектов изобретение описывает гетеромультимерное одноцепочечное антитело, содержащее линкер (tether) гетеродимеризации (HD), который соединяет первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) со вторым доменом VH, где гетеромультимер содержит один или несколько константных доменов тяжелой цепи (CH), выбранных из первого домена CH2, первого домена CH3, второго домена CH2 и второго домена CH3. В одном из вариантов осуществления гетеромультимер содержит по меньшей мере одну пару константных доменов тяжелой цепи. В другом варианте осуществления гетеромультимер может содержать шарнирный домен, расположенный между доменами VH и CH2 на одной или обоих тяжелых цепях. В другом варианте осуществления гетеромультимер содержит первый и/или второй домен CH1. Один или два домена CH1 связаны по C-концу с одним или обоими доменами VH и по N-концу с одним или обоими шарнирными доменами, или с одним или обоими доменами CH2 в отсутствии шарнирных доменов. В конкретных вариантах осуществления гетеромультимер также может содержать один или два вариабельных домена легкой цепи (VL), которые связаны по N-концу с первым и/или вторым доменом VH посредством одного или двух линкеров CLH (линкер, соединяющий родственные цепи LC и HC). В некоторых вариантах осуществления гетеромультимер также содержит один или два константных домена легкой цепи (CL), каждый из которых связан по C-концу с одним или обоими доменами VL и непосредственно по N-концу с одним или обоими линкерами CLH.

В другом аспекте изобретение описывает гетеромультимерное одноцепочечное антитело, содержащее один полипептид, в состав которого входят следующие домены, располагающиеся относительно друг друга в направлении от N-конца к С-концу в следующем порядке: VL₁-CL₁-CLH линкер₁-VH₁-CH1₁-шарнир₁-CH2₁-CH3₁-HD линкер-VL₂-CL₂-CLH линкер₂-VH₂-CH1₂-шарнир₂-CH2₂-CH3₂.

В другом аспекте изобретение описывает гетеромультимер, представляющий собой многоцепочечное антитело, которое содержит три полипептидные цепи, где первая и вторая полипептидные цепи являются идентичными и каждая образует легкую цепь (LC), а третья полипептидная цепь образует первую тяжелую цепь (HC) и вторую HC. Каждая из первой и второй полипептидных цепей содержит домены VL и CL. Третья полипептидная цепь содержит два домена VH, линкер HD, один или два шарнирных домена и один или несколько константных доменов тяжелой цепи, выбранных из группы, включающей первый домен CH1, первый домен CH2, первый домен CH3, второй домен CH1, второй домен CH2 и, второй домен CH3, где компоненты второй полипептидной цепи располагаются относительно друг друга в направлении от N-конца к С-концу в следующем порядке: VH₁-необязательный CH1₁-необязательный шарнир₁-необязательный CH2₁-необязательный CH3₁-HD линкер-VH₂-необязательный CH1₂-необязательный шарнир₂-необязательный CH2₂-необязательный CH3₂.

В другом аспекте изобретение описывает гетеромультимер, представляющий собой многоцепочечное антитело, которое содержит две полипептидные цепи, где первая полипептидная цепь образует первую легкую цепь (LC), а вторая полипептидная цепь образует первую тяжелую цепь (HC), вторую LC и вторую HC. Первая полипептидная цепь содержит первый домен VL и CL. Вторая полипептидная цепь содержит два домена VH, линкер HD, второй домен VL, второй домен CL, линкер CLH, один или два шарнирных домена, а также один или несколько константных доменов тяжелой цепи, выбранных из группы, включающей первый домен CH1, первый домен CH2, первый домен CH3, второй домен CH1, второй домен CH2 и второй домен CH3, где компоненты второй полипептидной цепи располагаются относительно друг друга в направлении от N-конца к С-концу в следующем порядке: VH₁-необязательный CH1₁-необязательный шарнир₁-необязательный CH2₁-необязательный CH3₁-HD линкер-VL₂-CL₂-CLH линкер-VH₂-необязательный CH1₂-необязательный шарнир₂-необязательный CH2₂-необязательный CH3₂.

В другом аспекте изобретение относится к гетеромультимеру, представляющему собой многоцепочечное антитело, которое содержит две полипептидные цепи, где первая полипептидная цепь образует первую LC, первую HC и вторую HC, а вторая полипептидная цепь образует вторую LC. Первая полипептидная цепь содержит два домена VH, HD-линкер, первый домен VL, первый домен CL, CLH линкер, один или два шарнирных домена, и один или несколько константных доменов тяжелой цепи, выбранных из группы, включающей первый домен CH1, первый домена CH2, первый домен СН3, второй домен CH1, второй домен СН2 и второй домен СН3, где компоненты второй полипептидной цепи расположены относительно друг друга в направлении от N-конца к С-концу следующим образом: VL₁-CL₁-CLH линкер-VH₁-необязательно CH1₁-необязательно шарнир₁-необязательно CH2₁-необязательно CH3₁-HD линкер-VH₂-необязательно CH1₂-необязательно шарнир₂-необязательно CH2₂- необязательно CH3₂. Вторая полипептидная цепь содержит вторую VL и домен CL.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к гетеромультимеру, содержащему две полипептидные цепи, где первый полипептид содержит иммуноадгезин, содержащий адгезин и один или несколько константных доменов тяжелой цепи (например, CH2₁ и/или CH3₁), второй полипептид образует половину антитела, которая включает домен VH и один или несколько константных доменов тяжелой цепи (например, CH1, CH2₂ и/или CH3₂), причем первая и вторая полипептидные цепи связаны друг с другом посредством HD линкера, образуя единую полипептидную цепь. Компоненты гетеромультимера расположены относительно друг друга в направлении от N-конца к С-концу следующим образом: адгезин-необязательно CH2₁-необязательно CH3₁-HD линкер-VH-необязательно CH1-необязательно CH2₂-необязательно CH3₂. HD линкер облегчает взаимодействие между одним или несколькими константными доменами иммуноадгезина и половиной антитела. В одном из вариантов осуществления CLH линкер облегчает взаимодействие между компонентами легкой цепи и тяжелой цепи половины антитела с получением гетеромультимера, содержащего компоненты, расположенные друг относительно друга в направлении от N-конца к С-концу следующим образом: адгезин-необязательно CH2₁-необязательно СН3₁-HD линкер-VL-CL-CLH линкер-VH-необязательно CH1-необязательно CH2₂-необязательно CH3₂. В другом варианте осуществления домены VL и CL легкой цепи половины антитела предоставляются вторым полипептидом, который связан с тяжелой цепью половины антитела первой полипептидной цепи, с образованием родственной пары легкая цепь-тяжелая цепь. В другом варианте осуществления иммуноадгезиновый фрагмент гетеромультимера может содержать аминокислотный спейсер, находящийся между компонентами адгезина и константным доменом тяжелой цепи. В одном из вариантов осуществления спейсер содержит остатки глицина (G) и серина (S), например, повторы GGS. В другом варианте осуществления длина спейсера находится в диапазоне 10-80 аминокислот, например, в диапазоне 20-40 остатков.

Гетеромультимер по настоящему изобретению может содержать HD линкер размером 15-100 аминокислот в длину. В конкретном варианте осуществления длина HD линкера составляет 30-39 аминокислот, например, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39 аминокислот. В одном из вариантов осуществления линкер содержит остатки глицина (G) и серина (S). В другом варианте осуществления линкер содержит повторы GGS. В предпочтительном варианте осуществления линкер содержит 8-9 повторов GGS (SEQ ID NO:19).

Гетеромультимер по настоящему изобретению также может содержать один или несколько линкеров CLH. В одном из вариантов осуществления длина одного или каждого из нескольких линкеров CLH находится в диапазоне 10-80 аминокислот. В конкретном варианте осуществления длина одного или каждого из нескольких линкеров CLH находится в диапазоне 20-40 аминокислот. В одном из вариантов осуществления линкер содержит остатки глицина (G) и серина (S). В другом варианте осуществления линкер содержит повторы GGS.

В другом варианте осуществления один или несколько из линкеров HD и CLH по настоящему изобретению могут отщепляться под действием одной или нескольких из следующих эндопептидаз: фурин, урокиназа, тромбин, тканевый активатор плазминогена (tРА), гененаза, Lys-C, Arg-С, Asp-N, Glu-C, фактор Ха, протеаза вируса травления табака (ТРВ), энтерокиназа, протеаза риновируса человека С3 (HRV С3) или кининогеназа. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один из линкеров отщепляется под действием фурина. В другом варианте осуществления по меньшей мере один из линкеров по настоящему изобретению расщепляется по двум участкам на N- и С-концах линкера или вблизи N- и С-концов линкера. В случае HD линкера, предпочтительно, один из двух участков расщепления представляет собой участок расщепления фурином, а другой участок расщепления представляет собой участок расщепления Lys-C. В случае CLH линкера, предпочтительно, и N- и С-концевые участки расщепления одного или нескольких линкеров CLH расщепляются под действием фурина. В некоторых вариантах осуществления участок расщепления фурином содержит аминокислотную последовательность RKRKRR (SEQ ID NO:9). В некоторых других вариантах осуществления участок расщепления фурином содержит аминокислотную последовательность RHRQPR (SEQ ID NO:10). В одном из вариантов осуществления расщепление под действием эндопептидазы происходит in situ. В конкретном варианте осуществления используют эндопептидазу, полученную путем рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине. В другом варианте осуществления расщепление под действием эндопептидазы проводят путем добавления эндопептидазы после очистки.

Гетеромультимер по настоящему изобретению может содержать один или несколько (например, два) линкеров CLH, каждый из которых содержит один или несколько участков расщепления под действием одной или нескольких из следующих специфических экзопептидаз: карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В, карбоксипептидаза В плазмы (также известная как карбоксипептидаза U или активируемый тромбином ингибитор фибринолиза (TAFI)), карбоксипептидаза D, карбоксипептидаза E (также известная как конвертаза энкефалина или карбоксипептидаза Н), карбоксипептидаза М, карбоксипептидаза N или карбоксипептидаза Z. В предпочтительном варианте осуществления гетеромультимер по настоящему изобретению расщепляется под действием экзопептидазы карбоксипептидазы В. В одном из вариантов осуществления расщепление под действием экзопептидазы происходит in situ. В конкретном варианте осуществления используют экзопептидазу, полученную путем рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине. В другом варианте осуществления расщепление под действием экзопептидазы происходит при добавлении экзопептидазы после очистки. В настоящем описании карбоксипептидаза B может относиться к классу карбоксипептидаз или она может представлять собой конкретную карбоксипептидазу. Как класс, карбоксипептидаза B включает все специфические карбоксипептидазы, кроме карбоксипептидазы А. В качестве специфической карбоксипептидазы карбоксипептидаза B также известна как карбоксипептидаза U или TAFI. Специалист в данной области может легко различить карбоксипептидазу В как класс и карбоксипептидазу В как специфическую экзопептидазу, в зависимости от контекста, в котором используется термин.

В следующем варианте осуществления гетеромультимер по настоящему изобретению может содержать один или несколько шарнирных доменов, включающих, без ограничения, шарнирные домены, которые содержат остатки от Glu216 до Pro230 IgG1 человека. В некоторых вариантах осуществления один или оба шарнирных доменов содержат мутацию, удаляющую участок расщепления эндопептидазой Lys-C. В одном из примеров мутация, удаляющая участок расщепления эндопептидазой Lys-C, представляет собой замену K222A (система нумерации EU).

Гетеромультимер по настоящему изобретению может быть моноспецифическим. В одном из вариантов осуществления моноспецифический гетеромультимер по настоящему изобретению содержит две половины антител, которые связываются с одним и тем же эпитопом-мишенью, но с разной аффинностью. В другом варианте осуществления моноспецифичный гетеромультимер по настоящему изобретению содержит половину антитела, связанную с иммуноадгезином, где все компоненты специфичны к одному и тому же партнеру по связыванию или эпитопу.

Гетеромультимер по настоящему изобретению может быть биспецифическим или мультиспецифическим. В одном из вариантов осуществления гетеромультимер способен связывать по меньшей мере два антигена. В другом варианте осуществления гетеромультимер способен связывать по меньшей мере два эпитопа на одном и том же антигене. В следующем варианте осуществления биспецифический или мультиспецифический гетеромультимер по настоящему изобретению содержит половину антитела, связанную с иммуноадгезином, каждый из которых является специфичным к разным партнерам по связыванию или эпитопам.

В другом варианте осуществления гетеромультимер по настоящему изобретению содержит константный участок, конъюгированный с цитотоксическим средством.

В другом варианте осуществления гетеромультимер может содержать два константных домена тяжелой цепи (например, два домена СН3), содержащих выступ или полость, где выступ или полость одного константного домена тяжелой цепи (например, домена CH3₁) могут быть расположены в полости или выступе, соответственно, второго константного домена тяжелой цепи (например, домена CH3₂). Предпочтительно, два константных домена совмещаются по граничной поверхности, содержащей выступ и полость. В следующем варианте осуществления гетеромультимер может содержать граничную поверхность по меньшей мере одного константного домена легкой цепи и одного константного домена тяжелой цепи (например, граничная поверхность CL/CH1), где константный домен легкой цепи (например, домен CL) и константный домен тяжелой цепи (например, домен CH1) взаимодействуют между собой по меньшей мере отчасти, посредством взаимодействия выступ-полость.

В другом варианте осуществления гетеромультимер по настоящему изобретению содержит мутацию домена CH2, либо во фрагменте CH2₁, либо во фрагменте CH2₂, которая приводит к изменению эффекторных функций антитела. В предпочтительном варианте осуществления мутация домена CH2 представляет собой мутацию N297. В некоторых вариантах осуществления мутация N297 представляет собой мутацию N297A. В некоторых других вариантах осуществления домен СН2 необязательно содержит мутацию D256A.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способы получения гетеромультимера. В другом аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим гетеромультимеры по настоящему изобретению. В дополнительных аспектах изобретение предлагает векторы, содержащие полинуклеотиды по настоящему изобретению, а также клетки-хозяева, содержащие указанные векторы. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. В предпочтительном варианте осуществления клетка млекопитающего представляет собой клетку CHO. В другом варианте осуществления клетка-хозяин является прокариотической клеткой. В следующем варианте осуществления прокариотическая клетка представляет собой клетку E. coli. В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения гетеромультимера, который включает культивирование клетки-хозяина, которая содержит вектор, содержащий полинуклеотиды, кодирующие гетеромультимер, в культуральной среде. Предпочтительно, гетеромультимер извлекают из клетки-хозяина или из среды, в которой культивируют клетку-хозяина.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к одноцепочечным антителам, содержащим один полипептид, содержащий нижеследующие домены, расположенные относительно друг друга в направлении от N-конца к C-концу в следующем порядке: VL₁-CL₁-CLH линкер₁-VH₁-CH1₁-шарнир₁-CH2₁-CH3₁-HD линкер-VL₂-CL₂-CLH линкер₂-VH₂-CH1₂-шарнир₂-CH2₂-CH3₂, где каждый из CLH линкера₁, CLH линкера₂ и HD линкера содержит аминокислотную последовательность, расщепляемую фуриновой эндопептидазой. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта расщепляемая фурином последовательность содержит аминокислотную последовательность RKRKRR (SEQ ID NO:9), тогда как в других вариантах осуществления расщепляемая фурином последовательность содержит аминокислотную последовательность RHRQPR (SEQ ID NO:10). В родственных аспектах изобретение предлагает полинуклеотидные молекулы, кодирующие одноцепочечное антитело по настоящему изобретению, векторы, содержащие полинуклеотиды, и клетки-хозяева, содержащие векторы. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, включающую, без ограничения, клетку СНО. В некоторых других вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку, включающую, без ограничения, клетку E.coli. В другом родственном аспекте настоящее изобретение предлагает способы получения одноцепочечного антитела, включающие культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, в культуральной среде. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию извлечения указанного одноцепочечного антитела из указанной клетки-хозяина или указанной культуральной среды.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания, чертежей и формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена схематическая диаграмма, демонстрирующая структуру типичного гетеромультимерного одноцепочечного антитела, содержащего три расщепляемых линкера. Участки расщепления эндопептидазой обозначены треугольниками. Также изображена необязательная мутация K222A.

На фиг. 2 представлена схематическая диаграмма, демонстрирующая расположение в типичном гетеромультимерном одноцепочечном антителе участков LC, HC, линкеров и участков расщепления. Примерами участков расщепления являются RKRKRRG(GGS)₆GRSRKRR (SEQ ID NO:14) и (GGS)_(8-10)RSRKRR(SEQ ID NO:15-17). Примером участка расщепления фурином является RXRXRR (SEQ ID NO:8).

На фиг. 3А приведен пример гетеромультимерного одноцепочечного антитела после расщепления фурином. Остатки в скобках (RKRKRR (SEQ ID NO:9) и RKRKR (SEQ ID NO:18)) обозначают остатки, которые могут быть удалены под действием эндогенных экзопептидаз перед очисткой на колонке с белком А с получением неровных C-концов. Также изображена необязательная мутация K222A.

На фиг. 3В приведен пример гетеромультимерного одноцепочечного антитела после обработки фурином, Lys-C и экзопептидазой (например, карбоксипептидазой В). Также изображена необязательная мутация K222A.

На фиг. 4 приведен пример конъюгированного гетеромультимерного одноцепочечного антитела до расщепления с целью удаления линкеров. Также изображен необязательно конъюгированный фрагмент, например, такой как токсин, антибиотик и т.д., и необязательная мутация K222A.

На фиг. 5А представлена схематическая диаграмма, демонстрирующая структуру типичного гетеромультимерного мультицепочечного антитела, содержащего один расщепляемый линкер. Два несвязанных линкером LC могут экспрессироваться независимо от полипептида, содержащего линкер. Несвязанные линкером LC могут экспрессироваться в одной клетке, или в разных клетках, как и связанные тяжелые цепи. Несвязанные линкером LC могут экспрессироваться из одной плазмиды, или из разных плазмид. Также изображен необязательно конъюгированный фрагмент, такой как токсин, антибиотик и т.д., и необязательная мутация K222A.

На фиг. 5В представлена схематическая диаграмма, демонстрирующая структуру типичного гетеромультимерного мультицепочечного антитела, содержащего два расщепляемых линкера. Линкер HD связывает первый HC и второй HC косвенно через связанный линкером LC. Несвязанный линкером LC может экспрессироваться независимо от полипептида, содержащего линкер. Несвязанные линкером LC могут экспрессироваться в одной клетке, или в разных клетках, как и связанные тяжелые цепи. Несвязанные линкером LC могут экспрессироваться из одной плазмиды, или из разных плазмид. Также изображена необязательная мутация K222A.

На фиг. 5C представлена схематическая диаграмма, демонстрирующая структуру типичного гетеромультимерного мультицепочечного антитела, содержащего два расщепляемых линкера. Линкер HD непосредственно связывает первый HC и второй HC. Несвязанный линкером LC может экспрессироваться независимо от полипептида, содержащего линкер. Несвязанные линкером LC могут экспрессироваться в одной клетке, или в разных клетках, как и связанные тяжелые цепи. Несвязанные линкером LC могут экспрессироваться из одной плазмиды, или из разных плазмид. Также изображена необязательная мутация K222A.

На фиг. 6А-6D приведены графики, демонстрирующие результаты анализа октета. (A) Показаны все графики, изображенные на чертежах B-D. (B) Типичное гетеромультимерное одноцепочечное антитело связывается с антигеном 1 и с антигеном 2 одновременно. (C и D) Антитело 1 и антитело 2 не вступают в перекрестное взаимодействие с антигенами друг друга, но связываются со своим соответствующим антигеном. На оси Х откладывают время в секундах. На оси Y откладывают относительное поглощение. Подробное описание можно найти в примере 3.

Подробное описание изобретения

Нежелательная гомодимеризация тяжелых цепей обычно происходит при образовании моноспецифических или мультиспецифических (например, биспецифических) антител или других гетеромультимеров, обладающих разными связующими свойствами и содержащих несколько полипептидных цепей. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что данную общую проблему можно преодолеть путем образования одноцепочечных моноспецифических или мультиспецифических гетеромультимеров, сборка которых управляется одним линкером или несколькими линкерами. Без связи с какой-либо теорией, авторы полагают, что HD линкер обеспечивает связывание разных компонентов Fc тяжелой цепи с высокой степенью точности и эффективности, что позволяет получить функциональный гетеромультимер, содержащий две половины молекулы (например, две половины антитела), которые связываются с одной и той же мишенью, или с разными мишенями с одинаковой или разной аффинностью. Гетеромультимер, содержащий связанные компоненты тяжелой цепи, может дополнительно содержать разные компоненты легкой цепи с образованием функционального одноцепочечного моноспецифического или мультиспецифического гетеромультимера (например, антитела) с полным комплектом тяжелых и легких цепей. Дополнительные линкеры по настоящему изобретению можно использовать для связи легких и тяжелых цепей гетеромультимера, обеспечивая правильное соединение отдельной легкой цепи с родственной тяжелой цепью.

Применение описанных в настоящем описании способов получения гетеромультимеров позволяет получать практически гомогенные популяции моноспецифических или мультиспецифических гетеромультимеров, полученных с использованием одной или нескольких полипептидных последовательностей. Гетеромультимеры, полученные с помощью описанных в настоящем описании способов, можно использовать для распознавания нескольких мишеней в патогенном пути или для совместной локализации конкретной мишени (например, опухолевой клетки) и средства, направленного против мишени (например, Т-клетки). Кроме того, описанные в настоящем описании гетеромультимеры имеют преимущество, заключающееся в том, что они позволяют избежать необходимости применения комбинированной терапии, направленной на два антигена, и риска, связанного с введением индивиду двух или более лекарственных средств.

I. Определения

Термин "антитело" в настоящем документе используется в самом широком смысле и относится к любой молекуле иммуноглобулина (Ig), содержащей две тяжелые цепи и две легкие цепи, а также к любым фрагментам, мутантам или вариантам такой молекулы, при условии, что они обладают желательной биологической активностью (например, эпитопсвязывающей активностью). Примеры антител включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, биспецифические антитела, мультиспецифические антитела и фрагменты антител.

Систему нумерации Kabat, как правило, используют в применении к остаткам вариабельного домена (примерно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "Систему нумерации EU" или "индекс EU" обычно используют в применении к остаткам константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU описан в Kabat et al., выше). "Индекс EU по Kabat" относится к EU нумерации остатков антитела человека IgG1. Если не указано иначе, номера остатков вариабельных доменов антител приводятся в соответствии с системой нумерации Kabat. Если не указано иначе, номера остатков константных доменов тяжелых цепей антител приводятся в соответствии с системой нумерации EU.

Основное встречающееся в природе 4-цепочечное антитело представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких цепей (LC) и двух идентичных тяжелых цепей (HC) (антитело IgM состоит из 5 основных гетеротетрамерных элементов и дополнительного полипептида, называемого J-цепь, и, следовательно, содержит 10 антигенсвязывающих участков, тогда как секретируемые антитела IgA могут полимеризоваться с образованием поливалентных комплексов, содержащих 2-5 основных 4-цепочечных элементов наряду с J цепью). В случае IgG размер 4-цепочечного элемента составляет, как правило, примерно 150000 Дальтон. Каждая LC связана с HC одной ковалентной дисульфидной связью, а две HC связаны друг с другом посредством одной или нескольких дисульфидных связей в зависимости от изотипа HC. Все НС и LC также содержат расположенные через одинаковые промежутки внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая НС содержит на N-конце вариабельный домен (VH), за которым следуют три константных домена (CH1, CH2, CH3) в случае α и γ цепей и четыре Cj домена в случае изотипов μ и ε. Каждая LC содержит на N-конце вариабельный домен (VL), за которым следует константный домен (CL), расположенный на другом конце. VL можно совместить с VH, а CL можно совместить с первым константным доменом тяжелой цепи (CH1). CH1 может быть соединен со вторым константным доменом тяжелой цепи (CH2) посредством шарнирного участка. Считается, что определенные аминокислотные остатки образуют граничную поверхность между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. В результате конъюгации VH и VL образуется единый антигенсвязывающий участок. Описание структуры и свойств разных классов антител можно найти, например, в Basic and Clinical Immunology, 8 th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6.

"Шарнирным участком" обычно называют участок от Glu216 до Pro230 IgG1 человека (Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985)). Шарнирные участки других изотипов IgG можно выравнивать с последовательностью IgG1, помещая первый и последний остатки цистеина, образующие S-S связи между тяжелыми цепями, в одинаковых положениях.

"Нижний шарнирный участок" Fc-участка обычно определяют как последовательность остатков, расположенную непосредственно на C-конце шарнирного участка, т.е. остатки с 233 по 239 участка Fc. До настоящего изобретения считали, что связывание FcgammaR, как правило, обуславливается аминокислотными остатками в нижнем шарнирном участке Fc-участка IgG.

"Домен CH2" Fc-участка IgG человека, как правило, простирается примерно от остатка 231 до остатка 340 IgG. Домен CH2 уникален тем, что он не способен точно спариваться с другим доменом. Более того, между двумя доменами CH2 интактной нативной молекулы IgG расположены две N-связанные разветвленные углеводные цепи. Существует предположение, что углевод служит заменой спаривания доменов и помогает стабилизировать домен CH2. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985).

"Домен СН3" включает последовательность остатков, расположенных на С-конце домена CH2 Fc-участка (т.е. он простирается примерно от аминокислотного остатка 341 до аминокислотного остатка 447 IgG).

Легкую цепь (LC), полученную из позвоночного любого вида, можно отнести к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа и лямбда, в зависимости от аминокислотных последовательностей их константных доменов. На основании аминокислотных последовательностей константных доменов тяжелых цепей (СН) иммуноглобулины можно отнести к разным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, тяжелые цепи которых обозначают α, δ, γ, ε и μ, соответственно. Классы γ и α дополнительно подразделяют на подклассы на основе сравнительно незначительных различий в последовательности CH и функции, например, выделяют следующие подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.

Термин "вариабельный" относится к тому факту, что последовательности некоторых сегментов вариабельных доменов разных антител значительно различаются. Домен V опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределена на протяжении участков вариабельных доменов длиной 110 аминокислот. Наоборот, V-домены содержат относительно постоянные сегменты размером 15-30 аминокислот, называемые каркасные участки (FR), которые разделены короткими предельно изменчивыми участками, называемыми "гипервариабельные участки", каждый из которых содержит 9-12 аминокислот в длину. Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, как правило, имеющих бета-складчатую конфигурацию, соединенных тремя гипервариабельными участками, которые образуют петли, соединяющие бета-складчатые структуры, а в некоторых случаях являются частью данной бета-складчатой структуры. Гипервариабельные области каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости посредством FR, и, наряду с гипервариабельными участками другой цепи, вносят вклад в образование антигенсвязывающего центра антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Константные домены непосредственно не участвуют в связывании антитела с антигеном, но выполняют разные эффекторные функции, например, отвечают за участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

Термин "гипервариабельный участок" или "HVR" в настоящем описании относится ко всем участкам вариабельного домена антитела, которые характеризуются гипервариабельностью последовательностей и/или образуют структурно определенные петли ("гипервариабельные петли"). Как правило, нативные четырехцепочечные антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, Н2, Н3), и три в VL (L1, L2, L3). HVR, как правило, содержат аминокислотные остатки гипервариабельных петель и/или "участков, определяющих комплементарность" (CDR), причем последние обладают наивысшей вариабельностью последовательностей и/или участвуют в распознавании антигена. HVR в соответствии с настоящим описанием содержит любое число остатков, расположенных в положениях 24-36 (L1), 46-56 (L2), 89-97 (L3), 26-35B (H1), 47-65 (H2) и 93-102 (H3). Таким образом, HVR содержит остатки описанных ранее в положениях в (А), (В) и (С): (А) 24-34 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (В) 24-34 из L1, 50-56 из L2, 89-97 из L3, 31-35B из H1, 50-65 из Н2, и 95-102 из Н3 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (С) 30-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35 (H1), 47-58 (H2), 93-100a-j (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)). Если не указано иначе, остатки HVR и другие остатки вариабельного домена (например, остатки FR) в настоящем описании нумеруют в соответствии с Kabat et al., выше.

Используется ряд контуров HVR, которые входят в объем настоящего описания. Чаще всего используют участки, определяющие комплементарность (CDR), в соответствии с Kabat, установленные по вариабельности последовательности (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Servce, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). В соответствии с Chothia данные участки определяют по местоположению структурных петель (Chothia и Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). HVR AbM представляют собой компромисс между HVR Kabat и структурными петлями Chothia, и используются программным обеспечением для моделирования антител Oxford Molecularʹs AbM. "Контактные" HVR определяют на основе анализа доступных сложных кристаллических структур. Остатки каждого из указанных HVR приведены ниже.

Петля	Kabat	AbM	Chothia	Контактные
L1	L24-L34	L24-L34	L26-L32	L30-L36
L2	L50-L56	L50-L56	L50-L52	L46-L55
L3	L89-L97	L89-L97	L91-L96	L89-L96
H1	H31-H35B	H26-H35B	H26-H32	H30-H35B
	(Нумерация Kabat)
H1	H31-H35	H26-H35	H26-H32	H30-H35
	(Нумерация Chothia)
H2	H50-H65	H50-H58	H53-H55	H47 -H58
H3	H95-H102	H95-H102	H9