Способ получения и отбора молекул, включающих по меньшей мере две различные группировки, и их применение

Способ получения и отбора молекул, включающих по меньшей мере две различные группировки, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В данном документе раскрыт способ получения и отбора молекул, образованных сочетанием двух различных группировок, таких как связывающие группировки, эффекторные группировки или полезные нагрузки, с помощью транспептид азы, такой как сортаза А, где по меньшей мере две различные группировки соединены in vivo. Это достигается путем добавления к сортазе и к одной из ее группировок сигнала удерживания в эндоплазматическом ретикулуме.

Уровень техники

За последние годы разработано и подвергнуто клиническим испытаниям широкое разнообразие специфических терапевтических белков, включая антитела, фрагменты антител и лиганды рецепторов клеточной поверхности. Примерами белков являются антитела, конъюгаты Fc-области или носители для целевой доставки. Некоторые из этих терапевтических белков были конъюгированы с несколькими классами терапевтических токсинов, такими как низкомолекулярные лекарственные вещества, ферменты, радиоизотопы, белковые токсины и другие токсины для специфической доставки пациентам.

Эффективная доставка к месту заболевания является необходимым условием для высокой эффективности и низкой токсичности любой терапевтической молекулы. Например, в данном контексте могут использоваться антитела. Если антитело само по себе не является терапевтическим элементом, то конъюгация эффекторной молекулы с антителом позволяет достичь точной локализации лекарственного средства в нужном месте в организме человека. Это увеличивает эффективную концентрацию лекарственного средства в его целевой области, тем самым оптимизируя терапевтический эффект агента. Кроме того, с целевой доставкой врач может иметь возможность понизить дозу терапевтического агента и, таким образом, минимизировать системное воздействие - что особенно актуально, если полезная нагрузка лекарственного препарата имеет ассоциированные токсичности, или если он будет использоваться для лечения хронических заболеваний (см., например, McCarron, Р.А., et al., Mol. Interventions 5 (2005) 368-380).

В WO 2010087994 приведены способы их связывания и применения. Рекомбинантные подходы к lgG-подобным биспецифическим антителам описаны в Marvin, J.S., et al. (Acta Pharmacol. Sinica 26 (2005) 649-658). В Levary, D.A., et al. (PLoS one, 6 (2011) e18342.1-e18342.6) сообщается о белок-белковом слиянии, катализируемом сортазой А. В WO 2013/003555 сообщается о применении сортаз для проведения химической реакции белкового связывания.

Strijbis, К. et al (Traffic 13 (2012) 780-789) сообщают о белковом связывании в живых клетках с использованием сортазы. Ими было заявлено, что Са²⁺-зависимая сортаза А от S. aureus не является функциональной внутри клетки, но что Са²⁺-независимая сортаза А от S. pyogenes является функциональной в цитозоле и в просвете эндоплазматического ретикулума (ER) как Saccharomyces cerevisiae, так и клеток млекопитающих НЕК293Т.

Краткое описание изобретения

В данном документе раскрыт способ получения in vivo внутриклеточно фермент-катализируемого (т.е. ферментативного) конъюгата первого полипептидного домена со вторым полипептидным доменом с помощью Са²⁺-зависимого фермента сортазы А от золотистого стафилококка (S. aureus), где один из полипептидных доменов и растворимый фермент сортаза А содержат сигнальную последовательность удерживания в эндоплазматическом ретикулуме.

Эта технология особенно подходит для быстрого создания, например, библиотеки комбинаций первой группы полипептидных доменов (например, первой группы связывающих доменов, таких как родственные пары вариабельных доменов антител) и второй группы полипептидных доменов (например, второй группы связывающих доменов, таких как родственные пары вариабельных доменов антител, но направленные против других эпитопов/антигенов, чем у первой группы, или группы молекул полезной нагрузки). Эта библиотека может быть легко получена, например, путем временной трансфекции клеток НЕК, и затем полученные комбинации могут быть подвергнуты скринингу, например, на наличие предполагаемого биологического эффекта или предназначенных свойств.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является способ получения полипептида, содержащего по меньшей мере два полипептидных домена, который включает этап

- культивирования клетки, содержащей

а) нуклеиновую кислоту, кодирующую растворимую сортазу А с С-концевым сигналом удерживания в эндоплазматическом ретикулуме,

b) нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептидный домен, содержащий на его С-конце или в С-концевой области сортазный мотив, за которым следует сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме, и

c) нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептидный домен, содержащий на его N-конце олигоглициновый мотив по меньшей мере из двух остатков глицина,

где клетка секретирует опосредованный/катализируемый сортазой А конъюгат первого полипептидного домена и второго полипептидного домена,

и, таким образом, получения полипептида, содержащего по меньшей мере два полипептидных домена.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является способ получения мультиспецифической связывающей молекулы, содержащей по меньшей мере две связывающих группировки, включающий этап

- культивирования клетки, содержащей

a) нуклеиновую кислоту, кодирующую растворимую сортазу А с С-концевым сигналом удерживания в эндоплазматическом ретикулуме,

b) нуклеиновую кислоту, кодирующую первую связывающую группировку, содержащую на ее С-конце или в С-концевой области сортазный мотив, за которым следует сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме, и

c) нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую связывающую группировку, содержащую на ее N-конце по меньшей мере диглицин,

где клетка секретирует опосредованный/катализируемый сортазой А конъюгат первой связывающей группировки и второй связывающей группировки,

где первая связывающая группировка специфически связывается с первым антигеном или мишенью, а вторая связывающая группировка специфически связывается со вторым антигеном или мишенью,

и таким образом, получения мультиспецифической связывающей молекулы, содержащей по меньшей мере две связывающих группировки.

В одном воплощении всех аспектов сортаза А является сортазой А от золотистого стафилококка (S. aureus). В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая (растворимую) сортазу А с С-концевым сигналом удерживания в эндоплазматическом ретикулуме, кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID №51 или SEQ ID №52.

В данном документе сообщается о способе получения высокоспецифических терапевтических молекул с заданными свойствами для лечения заболевания, такого как рак или вирусная инфекция, у пациента, нуждающегося в лечении, где терапевтическая молекула адаптирована к характеристикам заболевания пациента и/или к генотипу/фенотипу пациента.

Такая адаптация достигается путем изготовления молекулы с заданными свойствами с учетом генотипа/фенотипа вызывающих заболевание/пораженных клеток пациента.

На первом этапе определяется генотип/фенотип клеток (например, наличие и число/количество специфических для заболевания молекул клеточной поверхности), которые станут мишенями терапевтической молекулы. Это может быть достигнуто, например, с помощью методик клеточной визуализации, таких как иммуногистохимическое окрашивание (IHC, иммуногистохимия) клеток пациента, полученных, например, из крови и/или биопсийного материала, с использованием флуоресцентно меченных моноспецифических (терапевтических или диагностических) антител. Альтернативно генотип/фенотип клеток может быть проанализирован после окрашивания мечеными терапевтическими или диагностическими антителами с использованием способов на основе FACS. Методики визуализации in vivo, включая оптическую визуализацию, молекулярную визуализацию, флуоресцентную визуализацию, биолюминесцентную визуализацию, ЯМР, ПЭТ, ОФЭКТ, КТ и прижизненную микроскопию, также могут быть использованы для определения генотипа/фенотипа связанных с заболеванием клеток пациента. В зависимости от определенного генотипа/фенотипа клеток пациента, связанных с заболеванием, может быть выбрана/выбирается комбинация нацеливающих/связывающих группировок с заданными свойствами, и они объединяются в терапевтическую молекулу. Такая терапевтическая молекула может быть, например, биспецифическим антителом.

Такие терапевтические молекулы с заданными свойствами i) будут высокоспецифичными, ii) будут иметь хорошую терапевтическую эффективность и iii) будут вызывать, меньше и/или менее тяжелые побочные эффекты по сравнению с обычными выбираемыми терапевтическими средствами. Это может быть достигнуто путем придания терапевтической молекуле улучшенных нацеливающих свойств и/или улучшенных свойств доставки с заданными свойствами, например, для доставки терапевтической полезной нагрузки в место ее предполагаемого действия.

Улучшенная доставка терапевтической молекулы к месту ее действия, такому как, например, раковая клетка, может быть достигнута за счет более высокой/повышенной селективности и/или специфичности к целевой терапевтической молекуле по сравнению с обычными выбираемыми терапевтическими молекулами. Эта терапевтическая молекула содержит по меньшей мере две группировки, которые специфически связываются или могут быть связаны с различными белками (например, с двумя различными маркерами клеточной поверхности).

Повышенная селективность и/или специфичность терапевтической молекулы с заданными свойствами может быть достигнута или за счет одновременного связывания обеих нацеливающих группировок с их соответствующими мишенями/эпитопами, или за счет одновременного связывания обоих полипептидных доменов с их партнерами связывания, или за счет их сочетания.

Особенно подходящим является сочетание двух связывающих группировок, имеющих аффинность от низкой до средней к их соответствующим мишеням/эпитопам. Кроме того, нецелевое связывание значительно уменьшается или даже может быть полностью устранено.

Было обнаружено, что с помощью способа, описанного в данном документе, можно индивидуально сделать, например, биспецифические связывающие молекулы, такие как, например, биспецифические антитела, специфически направленные на два поверхностных маркера, находящихся на поверхности клетки, такой как раковая клетка. Так как специфичности связывания являются индивидуальными и обеспечиваются исходными компонентами, то можно индивидуально сделать мультиспецифическую нацеливающую и связывающую молекулу просто путем определения поверхностных маркеров, присутствующих на клетке, например, на раковой клетке, и конъюгации соответствующих фрагментов антител, которые специфически связываются с этими поверхностными маркерами или их соответствующими лигандами, путем ферментативной процедуры. Так как ферментативная конъюгация выполняется с помощью фермента сортазы А, в одном воплощении с помощью сортазы А от S. aureus, то полученная биспецифическая связывающая молекула (биспецифическое антитело) характеризуется наличием аминокислотной последовательности LPXTG (SEQ ID №01, где X может быть любым аминокислотным остатком).

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является способ выбора мультиспецифической связывающей молекулы, которая специфически связывается с двумя различными эпитопами или антигенами, включающий этап

- выбора из множества мультиспецифических связывающих молекул, содержащих различные комбинации первой связывающей группировки и второй связывающей группировки, мультиспецифической связывающей молекулы, которая специфически связывается с двумя различными эпитопами или антигенами.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является способ выбора биспецифического антитела, включающий следующие этапы:

(i) определение маркеров клеточной поверхности, присутствующих в образце, содержащем клетку, и выбор по меньшей мере первого поверхностного маркера и второго поверхностного маркера,

(ii) трансфекция клетки (а) нуклеиновой кислотой, кодирующей Fab антитела, или scFab-фрагмент, или scFv антитела, содержащий среди 20 (двадцати) С-концевых аминокислотных остатков аминокислотную последовательность LPXTG (SEQ ID №01, где X может быть любым аминокислотным остатком), а затем сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме KDEL (SEQ ID №02), где Fab, или scFab-фрагмент, или scFv антитела специфически связываются с первым поверхностным маркером или его лигандом, (b) нуклеиновой кислотой, кодирующей фрагмент антитела с одной ветвью, содержащий тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид Fc-области тяжелой цепи антитела, где тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются родственными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образуют антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается со вторым поверхностным маркером или его лигандом, где тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид Fc-области тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через один или более чем один дисульфидный мостик, формируя шарнирную область антитела, и где полипептид Fc-области тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m=2, или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, и (с) нуклеиновой кислотой, кодирующей растворимую сортазу А с С-концевым сигналом удерживания в эндоплазматическом ретикулуме,

и, таким образом, получения биспецифического антитела.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является способ определения комбинации антигенсвязывающих сайтов, включающий следующие этапы:

(i) определение специфичности связывания и/или селективности и/или аффинности и/или эффекторной функции и/или периода полужизни in vivo множества биспецифических антител, полученных путем объединения (а) каждого участника из первого множества Fab антитела, или scFab-фрагментов, или scFv-фрагментов антитела, где каждый участник содержит содержащей среди 20 С-концевых аминокислотных остатков аминокислотную последовательность LPXTG (SEQ ID №01, где X может быть любым аминокислотным остатком), а затем сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме KDEL (SEQ ID №02), где Fab, или scFab-фрагмент, или scFv антитела специфически связывается с первым эпитопом или антигеном, с (b) каждым участником из множества фрагментов антитела с одной ветвью, содержащих тяжелую цепь полноразмерного антитела, легкую цепь полноразмерного антитела и полипептид Fc-области тяжелой цепи антитела, где тяжелая цепь полноразмерного антитела и легкая цепь полноразмерного антитела являются родственными цепями антитела, комплементарными друг другу, и пара их вариабельных доменов (VH и VL) образуют антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается со вторым эпитопом или антигеном, где тяжелая цепь полноразмерного антитела и полипептид Fc-области тяжелой цепи антитела ковалентно связаны друг с другом через один или более чем один дисульфидный мостик, формируя шарнирную область антитела, и где полипептид Fc-области тяжелой цепи антитела имеет олигоглициновую G_m (m=2, или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на его N-конце, ковалентно за счет катализируемой сортазой А ферментативной реакции,

и

(ii) выбор биспецифического антитела с подходящей специфичностью связывания и/или селективностью и/или аффинностью и/или эффекторной функцией и/или периодом полужизни in vivo и, таким образом, определение комбинации антигенсвязывающих сайтов.

В одном воплощении всех аспектов сортаза А является сортазой А золотистого стафилококка (S. aureus). В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая (растворимую) сортазу А с С-концевым сигналом удерживания в эндоплазматическом ретикулуме, кодирует аминокислотную последовательностей SEQ ID №51 или SEQ ID №52.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является биспецифическое антитело, полученное способом, описанным в данном документе.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является биспецифическое антитело, содержащее аминокислотную последовательность LPXTG (SEQ ID №01, где X может быть любым аминокислотным остатком) в одной из своих тяжелых цепей.

Далее приведены воплощения всех аспектов, описанных в данном документе.

В одном воплощении каждый из участников множества мультиспецифических связывающих молекул получен способом, описанным в данном документе.

В одном воплощении мультиспецифическая связывающая молекула выбрана на основании ее специфичности связывания и/или селективности, и/или аффинности, и/или эффекторной функции, и/или времени полужизни In vivo.

В одном воплощении связывающая группировка является родственной парой вариабельного домена тяжелой цепи антитела и вариабельного домена легкой цепи антитела.

В одном воплощении мультиспецифическая связывающая молекула представляет собой биспецифическое антитело, содержащее две или четыре связывающих группировки.

В одном воплощении первый полипептидный домен и второй полипептидный домен выбраны независимо друг от друга среди полноразмерного антитела, scFv, scFab, тяжелой цепи антитела, легкой цепи антитела, фрагмента Fc-области тяжелой цепи антитела, пары вариабельного домена легкой цепи антитела и вариабельного домена тяжелой цепи антитела, антигенсвязывающих фрагментов антитела, VH, VL, СН1, СН2, СН3, СН4, CL, шарнирной области антитела, цитокинов, рецепторов, рецепторных лигандов, обнаруживаемых меток, маркеров и партнеров связывающей пары.

В одном воплощении сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме выбран среди SEQ ID №02 (KDEL), SEQ ID №03 (HDEL) или SEQ ID №04 (SFIXXXXMP).

В одном воплощении сортазный мотив представляет собой LPXTG (SEQ ID №01, где X может быть любым аминокислотным остатком).

В одном воплощении первый связывающий домен или первая связывающая группировка имеют среди 20 С-концевых аминокислотных остатков аминокислотную последовательность LPXTG (SEQ ID №01, где X может быть любым аминокислотным остатком).

В одном воплощении клетка представляет собой клетку млекопитающего или дрожжевую клетку. В одном воплощении клетка млекопитающего выбрана среди клетки НЕК, клетки яичника китайского хомяка (СНО) или клетки ВНК.

В одном воплощении Fc-область содержит мутацию природного аминокислотного остатка в позиции 329 и по меньшей мере еще одну мутацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка, выбранного из группы, включающей аминокислотные остатки в позиции 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 и 331, с заменой другим остатком, где остатки в Fc-области пронумерованы в соответствии с индексом ЕС по Кабату. Изменение этих конкретных аминокислотных остатков приводит к изменению эффекторной функции Fc-области по сравнению с немодифицированной Fc-областью (дикого типа).

В одном воплощении связывающая группировка выбрана из (или первая связывающая группировка и вторая связывающая группировка независимо друг от друга выбраны из) группы связывающей группировки на основании дарпинового домена, связывающей группировки на основании антикалинового домена, связывающей группировки на основании фрагмента Т-клеточного рецептора, такого как домен scTCR, связывающей группировки на основании верблюжьего VH-домена, связывающей группировки на основании десятого домена фибронектина III типа, связывающей группировки на основании тенасцинового домена, связывающей группировки на основании кадгеринового домена, связывающей группировки на основании ICAM-домена, связывающей группировки на основании домена титина, связывающей группировки на основании GCSF-R-домена, связывающей группировки на основании домена цитокинового рецептора, связывающей группировки на основании домена ингибитора гликозидазы, связывающей группировки на основании домена супероксиддисмутазы или фрагментов антител, таких как Fab- или scFab- или scFv-фрагмент.

В одном воплощении первый полипептидный домен содержит i) аминокислотную последовательность LPXTG (SEQ ID №01, где X может быть любым аминокислотным остатком) в аминокислотной последовательности его С-концевой области (т.е. среди двадцати С-концевых аминокислотных остатков) и и) сигнал удерживания в эндоплазматическом ретикулуме KDEL (SEQ ID №02) на его С-конце, а второй полипоптидный домен содержит олигоглицин G_m (m=2, или 3, или 4, или 5) на его N-конце.

В одном воплощении второй полипептидный домен или вторая связывающая группировка содержит олигоглициновую G_m (m=2, или 3, или 4, или 5) аминокислотную последовательность на своем N-конце.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является фармацевтический состав, содержащий мультиспецифическую связывающую молекулу, описанную в данном документе.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является применение мультиспецифической связывающей молекулы, описанной в данном документе, в производстве лекарственного средства.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения рака.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является способ лечения индивидуума, страдающего от рака, который включает введение индивидууму эффективного количества мультиспецифической связывающей молекулы, описанной в данном документе.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является способ разрушения раковых клеток у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества мультиспецифической связывающей молекулы, описанной в данном документе.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является фармацевтический состав, содержащий биспецифическое антитело, описанное в данном документе.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является применение биспецифического антитела, описанного в данном документе, в производстве лекарственного средства.

В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения рака.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является способ лечения индивидуума, страдающего от рака, который включает введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела, описанного в данном документе.

Одним из аспектов, описанных в данном документе, является способ разрушения раковых клеток у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела, описанного в данном документе. В одном воплощении всех аспектов, описанных в данном документе, Fc-область является человеческой Fc-областью или ее вариантом.

В одном воплощении Fc-область человеческого антитела относится или к человеческому lgG1-подклассу, или к человеческому lgG2-подклассу, или к человеческому lgG3-подклассу, или к человеческому lgG4-подклассу.

В одном воплощении Fc-область антитела представляет собой Fc-область человеческого антитела подкласса lgG1 или человеческого антитела подкласса lgG4.

В одном воплощении Fc-область человеческого антитела содержит мутацию природного аминокислотного остатка по меньшей мере в одной из следующих аминокислотных позиций: 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322, 329 и/или 331, с заменой другим остатком, где остатки в Fc-области антитела пронумерованы в соответствии с ЕС-индексом по Кабату.

В одном воплощении Fc-область человеческого антитела содержит мутацию природного аминокислотного остатка в позиции 329 и по меньшей мере еще одну мутацию по меньшей мере одного аминокислотного остатка, выбранного из группы, включающей аминокислотные остатки в позициях 228, 233, 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, 322 и 331, с заменой другим остатком, где остатки в Fc-области пронумерованы в соответствии с ЕС-индексом по Кабату. Замена этих конкретных аминокислотных остатков приводит к изменению эффекторной функции Fc-области по сравнению с немодифицированной Fc-областью (дикого типа).

В одном воплощении Fc-область человеческого антитела имеет сниженную аффинность к FcγRIIIA и/или FcγRIIA и/или FcγRI по сравнению с конъюгатом, содержащим соответствующую Fc-область IgG дикого типа.

В одном воплощении аминокислотный остаток в позиции 329 Fc-области человеческого антитела замещен на глицин, или аргинина, или аминокислотный остаток, достаточно большой, чтобы разрушить «пролиновый сэндвич» в Fc-области.

В одном воплощении мутация природного аминокислотного остатка в Fc-области человеческого антитела является по меньшей мере одной из S228P, Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, P329G и/или P331S.

В одном воплощении мутация представляет собой L234A и L235A, если Fc-область антитела относится к человеческому lgG1-подклассу, или S228P и L235E, если Fc-область антитела относится к человеческому lgG4-подклассу.

В одном воплощении Fc-область антитела содержит мутацию P329G.

В одном воплощении Fc-область антитела содержит мутацию T366W в полипептиде Fc-области первой тяжелой цепи и мутации T366S, L368A и Y407V в полипептиде Fc-области второй тяжелой цепи, где нумерация осуществляется в соответствии с индексом ЕС по Кабату.

В одном воплощении Fc-область антитела содержит мутацию S354C в полипептиде Fc-области первой тяжелой цепи и мутацию Y349C в полипептиде Fc-области второй тяжелой цепи.

Описание графических материалов

Фиг. 1 Плазмидная карта экспрессионной плазмиды с растворимой сортазой А, содержащей эндоплазматический сигнал удерживания на своем С-конце.

Фиг. 2 Окрашенный по Кумасси SDS-гель, восстанавливающие условия; культуральные супернатанты от клеток НЕК293, трансфицированных scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL (дорожка 1), scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL (дорожка 2), (GGGGS)₂-scFab (дорожка 3), растворимой сортазой A-KDEL (дорожка 4), комбинацией 1+3+4 (соотношение плазмид 2,5: 5: 1) (дорожка 5), комбинацией 2+3+4 (соотношение плазмид 2: 8: 1) (дорожка 6); scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL и scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL остаются, в основном, внутриклеточно (GGGGS)₂-scFab экспрессируется и секретируется в среду (примерно 50 кДа), для комбинации можно увидеть полосу ферментативного конъюгата примерно 100 кДа.

Фиг. 3 Окрашенный по Кумасси SDS-гель, восстанавливающие условия; клеточные лизаты (слева) клеток НЕК293, трансфицированных scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL (дорожка 1), scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL (дорожка 2), (GGGGS)₂-scFab (дорожка 3), растворимой сортазой A-KDEL (дорожка 4), комбинацией 1+3+4 (соотношение плазмид 2,5: 5: 1) (дорожка 5), комбинацией 2+3+4 (соотношение плазмид 2: 8: 1) (дорожка 6); scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL и scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL остаются, в основном, внутриклеточно.

Фиг. 4 Анализ вестерн-блот SDS-геля с использованием идентичных образцов и выполненный в таких же условиях, как и гели из фиг. 2 и 3; молекулы scFab-LPXTG и продукт конъюгации обнаруживали с помощью антител против His-метки (PentaHis-AK (Qiagen)); для комбинации можно увидеть полосу ферментативного конъюгата примерно 100 кДа.

Подробное описание изобретения

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В данном описании и формуле изобретения нумерация остатков в Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина осуществляется в соответствии с индексом ЕС по Кабату (Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242, включен в данный документ посредством ссылки).

Термин "изменение" обозначает мутацию, добавление или удаление одного или более чем одного аминокислотного остатка в родительской аминокислотной последовательности.

Термин "метка" обозначает последовательность аминокислотных остатков, соединенных друг с другом посредством пептидных связей, которая имеет специфические связывающие свойства. В одном воплощении метка представляет собой метку для аффинности или очистки. В одном воплощении метка выбрана среди Arg-метки, His-метки, Flag-метки, SxFlag-метки, Strep-метки, Nano-метки, SBP-метки, с-тус-метки, S-метки, калмодулин-связывающего пептида, целлюлозо-связывающего домена, хитин-связывающего домена, GST-метки или МВР-метки. В одном воплощении метка выбрана среди SEQ ID №05 (RRRRR), или SEQ ID №06 (RRRRRR), или SEQ ID №07 (НННННН), или SEQ ID №08 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK), или SEQ ID №09 (DYKDDDDK), или SEQ ID №10 (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK), или SEQ ID №11 (AWRHPQFGG), или SEQ ID №12 (WSHPQFEK), или SEQ ID №13 (MDVEAWLGAR), или SEQ ID №14 (М DVEAW LG ARVPLVET), или SEQ ID №15 (MDEKTTGWRGGHWEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP), или SEQ ID №16 (EQKLISEEDL), или SEQ ID №17 (KETAAAKFERQHMDS), или SEQ ID №18 (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), или SEQ ID №19 (целлюлозо-связывающий домен), или SEQ ID №20 (целлюлозо-связывающий домен), или SEQ ID №21 (TNPGVSAWQVNTAYMETKHQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEP SNVPALWQLQ), или SEQ ID №22 (GST-метка), или SEQ ID №23 (МВР-метка).

Термин "антигенсвязывающий фрагмент антитела" означает молекулу, отличную от полноразмерного антитела, которая содержит часть полноразмерного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают, но не ограничиваясь ими, Fv, scFv, Fab, scFab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, димерные антитела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Фрагменты антител включают, но не ограничиваясь ими, фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')e, Fv и scFv, а также другие фрагменты, описанные ниже. Обзор некоторых фрагментов антител см. в Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Обзор scFv-фрагментов см., например, в Plueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp.269-315; см. также WO 93/16185; US 5571894 и US 5587458. обсуждение фрагментов Fab and F(ab')2, содержащих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации и имеющих повышенное время полужизни in vivo, см. в US 5,869,046.

Фрагменты антител могут быть получены различными методиками, в том числе, но не ограничиваясь ими, протеолитическим расщеплением или расщеплением интактного антитела, а также производством рекомбинантными клетками-хозяевами (например, E.coli, или фагом, или эукариотическими клетками), как описано в данном документе.

Термин "биспецифическое антитело" обозначает антигенсвязывающую молекулу, которая может специфически связываться с первым антигеном или эпитопом и со вторым антигеном или эпитопом, где первый антиген или эпитоп отличается от второго антигена или эпитопа.

Форматы биспецифических антител описаны, например, в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2010/145793.

Термин "класс" антитела относится к типу константного домена или константной области, которой обладает его тяжелая цепь. Есть пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть разделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, lgG₂, lgG₃, lgG₄, lgA₁ и lgA₂. Сегменты генов, кодирующие константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Кроме того, существует два класса легких цепей антител, присутствующих в антителах человеческого происхождения: каппа и лямбда, которые могут образовывать интактные антитела в комбинации с их родственными партнерами - тяжелыми цепями. Гены, кодирующие легкие цепи каппа или лямбда, называются κ и μ, соответственно.

Термин "эффекторная функция" обозначает те биологические активности, относящиеся к Fc-области антитела, которые изменяются в зависимости от класса и/или подкласса антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: C1q-связывание и комплементзависимую цитотоксичность (CDC); Fc-рецепторное связывание; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); антителозависимый клеточной фагоцитоз (ADCP); понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора); и активацию В-клеток. Такая функция может быть осуществлена, например, путем связывания Fc-области с Fc-рецептором на иммунной клетке с фагоцитарной или литической активностью, или связывание Fc-области с компонентами системы комплемента.

"Эффективное количество" агента, например, фармацевтического состава, относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата.

Термин "Fc-область" обозначает С-концевую область иммуноглобулина. Fc-область представляет собой димерную молекулу, содержащую два связанных дисульфидными мостиками фрагмента тяжелых цепей антитела (полипептидные цепи Fc-областей тяжелых цепей). Fc-область может быть получена путем расщепления папаином или IdeS или трипсином интактного (полноразмерного) антитела, или могут быть получены рекомбинантным путем.

Fc-область, получаемая из полноразмерного антитела или иммуноглобулина, содержит по меньшей мере остаток 226 (Cys) на С-конце полноразмерной тяжелой цепи и, таким образом, включает часть шарнирной области и два или три константных домена, т.е. домен СН2, домен СН3 и дополнительный/экстрадомен СН4 в случае антител класса IgE и IgM. Как известно из US 5648260 и US 5624821, модификация определенных аминокислотных остатков в Fc-области приводит к фенотипическим эффектам.

Формирование димерной Fc-области, содержащей два одинаковых или неодинаковых фрагмента тяжелых цепей антитела, опосредуется нековалентной димеризацией содержащихся доменов СНЗ (вовлеченные аминокислотные остатки см., например, в Dall'Acqua, Biochem. 37 (1998) 9266-9273). Fc-область ковалентно стабилизирована за счет образования дисульфидных связей в шарнирной области (см., например, Huber, et al., Nature 264 (1976) 415-420; Thies, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79). Введение изменений аминокислотных остатков в домен СН3 для того, чтобы нарушить димеризацию доменов СН3-СН3, не оказывает отрицательного воздействия на связывание неонатального Fc-рецептора (FcRn) благодаря тому, что остатки, участвующие в димеризации СН3-СН3-доменов, расположены на внутренней границе СН3-доменов, тогда как остатки, участвующие во взаимодействии Fc-o6nacTb-FcRn, расположены на внешней стороне доменов СН2-СН3.

Остатки, связанные с эффекторными функциями Fc-области, расположены в шарнирной области, СН2- и/или СН3-доменах, определенных для молекулы полноразмерного антитела. Функции, связанные/опосредованные с Fc-областью, представляют собой:

(i) антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC),

(ii) связывание и активацию комплемента (C1q), комплементзависимую цитотоксичность (CDC),

(iii) антителозависимый клеточной фагоцитоз (ADCP),

(iv) фагоцитоз/клиренс комплексов антиген-антитело (иммунных комплексов),

(v) высвобождение цитокинов в некоторых случаях и

(vi) период полужизни/скорость клиренса антитела и комплекосв антиген-антитело.

Эффекторные функции, связанные с Fc-областью, вызываются/инициируются при взаимодействии Fc-области со специфическими молекулами или рецепторами с эффекторной функцией. Преимущественно антитела подкласса lgG1 могут осуществить активацию рецептора, в то время как антитела подклассов lgG2 и lgG4 не имеют эффекторной функции или имеют ограниченную эффекторную функцию.

Рецепторы, вызывающие эффекторную функцию, относятся к Fc-рецепторам типов (и подтипов) FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Эффекторные функции, связанные с подклассом lgG1, могут быть уменьшены посредством введения конкретных аминокислотных замен в нижнюю шарнирную область, таких как L234A и/или L235A, которые участвуют в FcγR- и C1q-связывании. Кроме того, некоторые аминокислотные остатки, особенно расположенные в доменах СН2 и/или СН3, связаны с контролем периода полужизни молекулы антитела или Fc-гибридного полипептида в кровотоке. Период полужизни в кровотоке определяется связыванием Fc-области с неонатальным Fc-рецептором (FcRn).

Термин "человеческая Fc-область" обозначает С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина человеческого происхождения, который содержит по меньшей мере часть шарнирной области, домен СН2 и домен СН3. В одном воплощении Fc-область тяжелой цепи человеческого антитела IgG простирается примерно от Glu216, или примерно от Cys226, или примерно от Pro230, до карбоксильного конца тяжелой цепи. Тем не менее, С-концевой лизин (Lys447) Fc-области антитела может присутствовать или не присутствовать.

Полипептидная цепь Fc-области дикого типа человеческого lgG1 имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь Fc-области дикого типа человеческого lgG4 имеет следующую аминокислотную последовательность:

Термин "полноразмерное антитело" обозначает антитело, имеющее структуру и аминокислотную последовательность, по существу идентичную нативной структуре антитела, а также полипептиды, которые включают Fc-область, описанную в данном документе.

Термин "тяжелая цепь полноразмерного антитела" обозначает полипептид, содержащий в направлении от N- к С-концу вариабельный домен антитела, первый константный домен,