Способ получения липидных наночастиц для доставки лекарственного средства

Способ получения липидных наночастиц для доставки лекарственного средства

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США №61/556,124, поданной 4 ноября 2011, которая включена в настоящую заявку в полном объеме посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения частиц на основе липидов и нуклеиновых кислот простым и репродуцируемым образом. Способ обеспечивает получение частиц, которые являются монодисперсными со средним размером 50-150 нм.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Липиды являются потенциально полезными в качестве носителей для доставки терапевтических молекул, в частности для доставки нуклеиновых кислот. Липиды образуют липосомы, которые могут инкапсулировать, образовывать комплексы или захватывать молекулы нуклеиновых кислот, и таким образом улучшать доставку этого класса терапевтических молекул в клетки-мишени после введения, например, внутривенно для циркуляции. Их полезность в фармацевтических композициях ограничивается доступными методами для получения наночастиц липидов и нуклеиновых кислот воспроизводимым образом. Были разработаны различные методы для получения таких наночастиц.

Batzri et al., 1973, Biophys Biochem Acta 298:1015-19, и Kremer et al., 1977, Biochemistry 16:3932-35, описывают получение липидных везикул посредством растворения липидов в этаноле и впрыскивания этанольного раствора в водный раствор, в котором липиды самопроизвольно формируют липосомы. Hirota et al., 1999, BioTechniques 27:286-89, описывают получение липидных везикул, покрытых молекулами нуклеиновой кислоты, посредством растворения катионных липидов в этаноле и впрыскивания этанольного раствора в водный раствор, содержащий молекулы нуклеиновой кислоты. Этот способ не позволяет получить липосомы, которые инкапсулируют нуклеиновую кислоту.

Maurer et al. в US 7094423 описывают получение липосом, которые инкапсулируют нуклеиновые кислоты, посредством сначала получения предварительно сформированных одностеночных везикул в водном растворе. Предварительно сформированные везикулы получают посредством растворения липидов в этаноле и впрыскивания липидной смеси в водный буфер. Способ получения пустых предварительно сформированных везикул включает установление размера посредством экструзии. Этанол добавляется в пустые предварительно сформированные везикулы после установления размера для дестабилизации их, и нуклеиновые кислоты в 40% этаноле добавляются для дестабилизации липидных везикул. После инкубации смесь диафильтруется для удаления этанола. Изменения процентного содержания этанола, температуры, времени инкубации, липидной композиции, отношения лекарственное средство/липид и начальной концентрации нуклеиновой кислоты все влияют на эффективность инкапсулирования и выход этого способа. Например, Maurer et al. раскрывает, что захват увеличивается при увеличении отношения олигонуклеотид:липид, с достижением максимума при более чем 0.16 мг антисмыслового нуклеотида на мг липида, с достижением увеличения числа липосом большего размера и их полидисперности.

Semple et al. в US 6858225 получали липосомы, инкапсулирующие РНК, применяя ионизируемый катионный липид. Липид растворяется в этаноле и объединяется с нуклеиновыми кислотами в водном буфере при низком pH. Этанол удаляется, и pH доводится до нейтрального значения pH с образованием липосом. Получение липосом является гетерогенным и требует гомогенизации или экструзии с получением монодисперсных липидных везикул. Согласно Maurer et al., Semple et al. раскрывают, что захват увеличивается при увеличении отношения олигонуклеотид:липид, с достижением максимума при более чем 0.16 мг антисмыслового олигонуклеотида на мг липида, с достижением увеличения числа липосом большего размера и их полидисперности.

MacLachlan et al. в US 7901708 описывают получение липидных везикул, инкапсулирующих РНК посредством смешивания липидов, растворенных в этаноле, с РНК в водном растворе в смесительной камере (Т-трубка), в которой липиды и РНК растворяются постепенно, таким образом, по существу мгновенно образуя везикулы.

Wheeler et al. в US 20100041152 описывают получение липосом, инкапсулирующих РНК, посредством растворения катионных липидов в этаноле и смешивания с РНК в 65-85% этаноле с получением растворимого заряд-нейтрализованного комплекса, добавления некатионных липидов к этому комплексу с образованием смеси липид - нуклеиновая кислота, и удаления этанола. Липосому нуждаются в гомогенизации или экструзии с получением монодисперсных липидных везикул.

Остается потребность в способе получения инкапсулированных нуклеиновых кислот без необходимости стадий интенсивной механической обработки для получения предварительно сформированных липосом и без необходимости стадии обработки для уменьшения частиц липид-нуклеиновая кислота до монодисперсной популяции.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одним объектом настоящего изобретения является способ получения липидной наночастицы, инкапсулирующей полианион, содержащий стадии добавления первого раствора, содержащего липиды, растворенные в смешивающемся с водой органическом растворителе, при постоянной скорости во второй раствор, содержащий полианион в водном буфере при перемешивании второго раствора с получением смеси, содержащей органический растворитель при 25-45% (об:об); и удаления органического растворителя из смеси посредством диафильтрации с применением водного буферизованного раствора при нейтральном pH. Добавление первого раствора ко второму раствору предпочтительно продолжается в течение 1-100 минут. Полианион может представлять собой нуклеиновую кислоту, например, молекулу РНК. Полианион предпочтительно присутствует при концентрации 0.08-0.8 мг/мл. Отношение липид: лекарственное средство (мас.:мас.) липидной наночастицы предпочтительно составляет от 0.06 до 0.16. Отношение зарядов липид: лекарственное средство липидной наночастицы предпочтительно составляет от 1:25:1 до 1:1.

Другим вариантом выполнения способа является применение полисахарида в водных растворах. Полисахарид предпочтительно выбирается из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннита, сорбита, ксилита, лактозы, мальтозы и инулина. Другой вариант выполнения способа дополнительно содержит стадию лиофилизации липидной наночастицы, инкапсулирующей полианион.

В другом варианте выполнения способа органическим раствором предпочтительно является этанол. Предпочтительно, при завершении получения смеси липида и полианиона, смесь содержит этанол при 35% (об.:об.).

В другом варианте выполнения способа липиды содержат катионный липид, вспомогательный липид, стерол и ПЭГ липид. Предпочтительно, катионный липид составляет от 40 до 60 мольных процентов липидов. Предпочтительно, катионный липид выбирается из группы, состоящей из HEDC, HEDODC и HE-Et-DODC, более предпочтительно состоящего из ионизируемого или неионизируемого положительного заряда. Предпочтительно, липиды дополнительно содержат нацеливающий липид.

В другом варианте выполнения способа этанол и водные растворы смешиваются при 25-55°C, и буферизуются при pH 3.5-6.5, предпочтительно с применением цитрата.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая липидную наночастицу, инкапсулирующую полианион, полученную посредством способа, содержащего стадии добавления первого раствора, содержащего липиды, растворенные в смешивающемся с водой органическом растворителе, при постоянной скорости во второй раствор, содержащий полианион в водном буфере при перемешивании второго раствора с поучением смеси, содержащей органический растворитель при 25-45% (об.:об.); и удаления органического растворителя из смеси посредством диафильтрации с применением водного буферизованного раствора при нейтральном pH.

Вариант выполнения настоящего изобретения включает фармацевтическую композицию, содержащую нуклеиновую кислоту, молекулу РНК или двухнитиевую молекулу siPHK. Предпочтительно, отношение липид: лекарственное средство липидной наночастицы составляет от 0.06 до 0.16 (мас.:мас.), и отношение зарядов липид: лекарственное средство липидной наночастицы составляет от 1:25:1 до 1:1.

В другом варианте выполнения фармацевтической композиции липиды содержат катионный липид, вспомогательный липид, стерол и ПЭГ липид. Предпочтительно, катионный липид составляет от 40 до 60 мольных процентов липидов. Катионный липид предпочтительно выбирается из группы, состоящей из HEDC, HEDODC и HE-Et-DODC. Катионный липид может состоять из ионизируемого или неионизируемого положительного заряда. Липиды могут дополнительно содержать нацеливающий липид.

Другой вариант выполнения фармацевтической композиции дополнительно содержит полисахарид, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннита, сорбита, ксилита, лактозы, мальтозы и инулина. Предпочтительно способ получения фармацевтической композиции дополнительно содержит лиофилизацию полианиона, инкапсулированного липосомой. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать цитрат. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать вспомогательные вещества, состоящие из полоксамеров, поверхностно-активных веществ, детергентов или полигидрокси или полигидроксиэтилен полимеров.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция состоит из липидных наночастиц, инкапсулирующих молекулы РНК, имеющих средний диаметр частицы 50-150 нм, более предпочтительно менее 100 нм, наиболее предпочтительно минимально поли дисперсных.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 схематически показывает способ, описанный в настоящей заявке для получения наночастиц на основе липидов и нуклеиновых кислот. Подробное описание каждой стадии способа описывается далее.

Фиг. 2 показывает средний размер частиц в нанометрах (нм) как функцию конечной концентрации РНК от 0.05 до 0.5 мг/мл. Подробное описание эксперимента приводится в Примере 1.

Фиг. 3 показывает средний размер частиц в нм как функцию pH буфера при смешивании липидов с РНК. Подробное описание эксперимента приводится в Примере 2.

Фиг. 4 показывает средний размер частиц, полученных с применением способа согласно Примеру 2 (NDT-0009) или способу Semple, как подробно описано в Примере 3. Столбики слева показывают измерение размера после смешивания. Столбики слева показывают измерение конечного продукта (для продукта по способу Semple, после экструзии и диафильтрации).

Фиг. 5 показывает эффективность инкапсуляции (ЕЕ) в процентах для частицы, полученной с применением способа согласно Примеру 2 (Способ по Примеру 2) или Примеру Semple, как описано в Примере 3. Столбики слева показывают измерение размера после смешивания. Столбики слева показывают измерение конечного продукта (для продукта по способу Semple, после экструзии и диафильтрации).

Фиг. 6 показывает восстановление siPHK в процентах для частицы, полученной с применением способа согласно Примеру 2 или Примеру Semple, как описано в Примере 3.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ВЫПОЛНЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описание настоящего изобретения относится к способу получения липид-инкапсулированных терапевтических молекул, включающих отрицательно-заряженные терапевтические полимеры, например, нуклеиновые кислоты, белки и пептиды. Приведенное описание настоящего изобретения включает способ получения липид-инкапсулированных молекул нуклеиновых кислот. Способ, в частности, делает возможным крупномасштабное производство частиц, состоящих из инкапсулированных липосомами молекул лекарственного средства. Способ обеспечивает неожиданный и удивительный результат, состоящий в том, что полученные частицы имеют распределение по размеру от 50 до 150 нм при индексе полидисперсности (PDI) менее 0.2. Этот способ обеспечивает средства инкапсуляции посредством объединения липидов, солюбилизированных в смешивающемся с водой органическом растворителе, таком как этанол, с отрицательно-заряженными терапевтическими полимерами, солюбилизированными в водном растворителе, и удаления органического растворителя. Абсолютные и относительные концентрации липидов и отрицательно-заряженных терапевтических полимеров достаточны для получения маленьких частиц. Частицы, полученные способов согласно описанию настоящего изобретения, не нуждаются в механической обработке, такой как экструзия, для получения популяции частиц с PDI менее 0.2.

Способ согласно настоящему изобретению имеет преимущества по сравнению с ранее описанными способами благодаря легкости, с которой он может быть воспроизведен в больших объемах и надежности при осуществлении при широком диапазоне температур, растворителей, pH и продолжительности обработки.

Способ согласно настоящему изобретению имеет преимущества по сравнению с ранее описанными способами благодаря воспроизводимости получения частиц с PDI менее 0.2, предпочтительно менее 0.1, и без излишних стадий, необходимых для получения предварительно сформированных везикул.

Способ согласно настоящему изобретению имеет преимущества по сравнению с ранее описанными способами благодаря воспроизводимости получения равномерной популяции наночастиц без излишних стадий, необходимых для частиц, получаемых механически, при смешивании липидов и отрицательно заряженных терапевтических полимеров. Эти излишние стадии включают, например, обработку ультразвуком, гомогенизацию или экструзию, для уменьшения их размера и доведения равномерности до терапевтически приемлемого диапазона.

Способ согласно настоящему изобретению имеет преимущество достижения эффективности инкапсуляции нуклеиновой кислоты, равной эффективности ранее описанных способов или улучшенной по сравнению с ними, без излишних стадий обработки наночастиц.

Другие преимущества способа согласно настоящему изобретению очевидны из приведенного далее подробного описания настоящего изобретения, касающегося липидных компонентов и условий.

Липидная смесь, применяемая в способе согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере положительно-заряженный липид (катионный липид) в комплексе с отрицательно-заряженными терапевтическими полимерами, и полиэтиленгликоль-содержащий липидный конъюгат (ПЭГ-липид) для предотвращения агрегации. Катионным липидом может быть перманентный катионный заряд для широкого диапазона условий pH, ионизируемый катионный липид, который заряжается при низком pH (менее чем pH 6) и без суммарного заряда при нейтральном pH (pH 6.5-8), или комбинация перманентного и ионизируемого катионных липидов. Липидная смесь также может содержать нацеливающий липид, полимер, стероид, фосфолипид, или член другой липидной группы, включающей жиры, воск, жирорастворимые витамины, моноглицериды или диглицериды, жирные ацилы, глицеролипиды, глицерофосфолипиды, сфинголипиды, сахаролипиды и поликетиды. Этот способ может также применяться для формирования липосом с только нейтральными или отрицательно заряженными компонентами.

Предпочтительно компоненты липидной смеси могут быть выбраны из следующих групп.

Катионный липид

Настоящее изобретение охватывает катионные липиды формулы I

в которой

Z=алкильный линкер, C₂-C₄ алкил

Y=алкильный линкер, C₁-C₆алкил

R₁ и R₂ каждый независимо представляет собой C₁₀-C₃₀алкил, C₁₀-C₃₀алкенил, или C₁₀-C₃₀алкинил, C₁₀-C₃₀алкил, C₁₀-C₂₀алкил, C₁₂-C₁₈алкил, C₁₃-C₁₇алкил, C₁₃алкил, C₁₀-C₃₀алкенил, C₁₀-C₂₀алкенил. C₁₂-C₁₈алкенил, C₁₃-C₁₇алкенил, C₁₇алкенил; R₃ и R₄ каждый независимо представляет собой водород, C₁-С₆алкил, или -CH₂CH₂ОН, C₁-C₆алкил, C₁-C₆алкил; n равно 1-6; и X представляет собой противоион, включая любой азотный противоион, причем этот термин легко понятен в данной области техники. Предпочтительные азотные противоионы включают галогены, причем хлорид и бромид являются особенно предпочтительными. Другим предпочтительным противоионом является мезилат (-SO₃CH₃).

Примерные соединения формулы I включают:

и

и

Другие катионные заряженные липиды при физиологическом pH включают, но без ограничения к этому, N,N-диолеил-N,N-диметиламмония хлорид ("DODAC"); N-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония хлорид ("DOTMA"); N,N-дистеарил-N,N-диметиламмония бромид ("DDAB"); N-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония хлорид ("DOTAP"); N-(1,2-димиристилоксипроп-3-ил)-N,N-диметил-N-гидроксиэтиламмония бромид ("DMRIE"), 3β-(N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил)холестерин ("DC-Chol"), диоктадециламидоглицил карбоксиспермидин ("DOGS"); и Н-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N-(2-(сперминкарбоксамидо)этил)-N,N-диметиламмония трифторацетат ("DOSPA").

Ионизируемые катионные липиды

Настоящее изобретение охватывает ионизируемые катионные липиды формулы II

в которой

Z=алкильный линкер, С₂-С₄алкил, -CH₂SCH₂CH₂-

Y=алкильный линкер, C₁-C₆алкил

R₁ и R₂ каждый независимо представляет собой C₁₀-C₃₀алкил, C₁₀-C₃₀алкенил, или C₁₀-C₃₀алкинил, C₁₀-C₃₀алкил, C₁₀-C₂₀алкил, С₁₂-С₁₈алкил, С₁₃-C₁₇алкил, C₁₃алкил, C₁₀-C₃₀алкенил, C₁₀-C₂₀алкенил. С₁₂-С₁₈алкенил, C₁₃-C₁₇алкенил, C₁₇алкенил; R₃ и R₄ каждый независимо представляет собой водород, C₁-C₆алкил, или -CH₂CH₂ОН, C₁-C₆алкил, C₁-C₃алкил.

Некоторые положительно-заряженный липиды имеют рКа при или около физиологическом pH и являются катионными в мягких кислотных условиях и слабо катионными при физиологическом pH. Такие ионизируемые катионные липиды включают, но без ограничения к этому, ((2-((2-(диметиламино)этил)тио)ацетил)азандиил)бис(этан-2,1-диил) дитетрадеканоат ("S104"), (Z)-((3-(диметиламино)пропаноил)азандиил)бис(этан-2,1-диил)диолеат ("i-Et-DODC"), N-(2,3-диолеилокси)пропил)]N,N-диметиламмония хлорид ("DODMA") и 1,2-диолеил-3-диметиламмония-проан ("DODAP").

Обнаружено, что ионизируемые липиды могут облегчать связывание и/или высвобождение активного фармацевтического ингредиента (API), как показано ниже.

Природные липиды

Примеры природных липидов включают, но без ограничения к этому, фосфолипиды, аминолипиды и сфинголипиды. Природные липиды включают амфифатические липиды. Презентативные примеры фосфолипидов включают, но без ограничения к этому, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидиновую кислоту, пальмитоилолеоил фосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин ордилинолеоилфосфати-дилхолин. Другие соединения, не содержащие фосфор, такие как сфинголипид, семейства гликосфинголипидов, диацилглицерины и 3-ацилокси кислоты, также входят в группу, обозначенную как амфифатические липиды. Кроме того, амфифатический липид, описанный выше, может быть смешан с другими липидами, включая триглицериды и стиролы.

ПЭГ-липиды

Стабилизирующий бислой компонент представляет собой полиэтиленгликоль («ПЭГ»), конъюгированный с липидной головной группой, например, фосфатидилэтаноламин. Другой стабилизирующий бислой компонент представляет собой ПЭГ, конъюгированный с церамидом. ПЭГ может быть конъюгирован с фосфатидилэтаноламином или, альтернативно, с церамидом, применяя стандартные реакции связывания, известные специалистам в данной области техники и применяемые ими. Кроме того, предварительно сформированные ПЭГ-фосфатидилэтаноламин ("ПЭГ-РЕ") конъюгаты являются коммерчески доступными.

ПЭГ с различными молекулярными массами могут применяться для формирования стабилизирующих бислой компонентов согласно настоящему изобретению. ПЭГ с различными молекулярными коммерчески доступны для получения из ряда различных источников или, альтернативно, они могут быть синтезированы с применением стандартных методик полимеризации, хорошо известных специалистам в данной области техники. В представленном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу в интервале от 200 до 10000 Да, предпочтительно от 500 до 4000 Да, и наиболее предпочтительно от 1000 до 2000 Да. В общем, было обнаружено, что повышение молекулярной массы ПЭГ уменьшает концентрацию стабилизирующего бислой компонента, необходимой для достижения стабилизации.

Фосфатидилэтаноламин, имеющий многообразие с групп с ацильной цепью с различной длиной цепи и степенью насыщенности, может быть конъюгирован с ПЭГ с формированием стабилизирующего бислой компонента. Такие фосфатидилэтаноламины являются коммерчески доступными, или могут быть выделены или синтезированы с применением обычных методик, известных специалистам в данной области техники. Фосфатидилэтаноламины, содержащие насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты с длиной углеводородной цепи в интервале от С10 до С20, являются предпочтительными. Фосфатидилэтаноламины с моно- или диненасыщенными жирными кислотами и смеси насыщенных и ненасыщенных жирных кислот также могут применяться. Подходящие фосфатидилэтаноламины включают, но без ограничения к этому, следующие: димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE) и дистеароилфосфатидил-этаноламин (DSPE).

Вышеуказанные композиции также могут включать ПЭГ-конъюгированные липиды, которые по существу известны в данной области техники, включая ПЭГ-фосфолипиды и ПЭГ-церамиды, включая одну или более молекул, выбранных из следующих: ПЭГ2000-DSPE, ПЭГ2000-DРРЕ, ПЭГ2000-DМРЕ, ПЭГ2000-DОРЕ, ПЭГ1000-DSPE, ПЭГ1000-DPPE, ПЭГ1000-DMPE, ПЭГ1000-DOPE, ПЭГ550-DSРЕ, ПЭГ550-DРРЕ, ПЭГ-550DMРЕ, ПЭГ-1000DOPE, ПЭГ-холестерин, ПЭГ2000-церамид, ПЭГ 1000-церамид, ПЭГ750-церамид, и ПЭГ550-церамид.

Кроме того, композиции также могут включать монодисперсные (md) ПЭГ-липиды, с общей формулой md ПЭГ-линкер-липид, с примерами, включающими, но без ограничениями к этому, 83-гидрокси-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,7275,78,81-гептакозаоксатриоктаконтил (2,3-бис(тетра-децилокси)пропил)карбамат ("НО-ПЭГ1251-сВТР") и 134-гидрокси-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75, 78, 81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132-тетратетраконтаоксатетратриконтагектил (2,3-бис(тет-радецилокси)пропил)карбамат ("НО-ПЭГ2000-сВТР") в качестве примеров.

Стероиды

Стероиды включают холестаны (например, холестерин), холаны и желчные кислоты (например, хенодеоксихолат и холат), эргостерол, ланостерол, кортикостероиды (например, глюкокортикоид), прегнан (например, прогестерон), и фитостиролы. Они могут быть включены также в форме конъюгата с гидрофильной составляющей, например, полиэтиленгликол. Предпочтительный стероид представляет собой холестерин.

Нацеливающий липид

Пример нацеливающего липида представляет собой соединение формулы (А),

в которой

- липид (L) выбирается из группы, состоящей из DSPE, DOPE, и DC;

- линкер (X) выбирается из группы, состоящей из ничего, ПЭГ550, ПЭГ2000, ПЭГ-глутамат (-Glu), Glu, С6, глицин, и GluNH, N1,N19-бис(3-(2-(2-(3-аминопропокси)этокси)этокси)пропил)-4,7,10,13,16-пентаоксанонадекан-1,19-диамид; и

- ретиноид (R) выбирается из группы, состоящей из третиноин, адапален, ретинол, 4-гидрокси(фенил)ретинамид (4-HPR), ретиноевая кислота (витамин А), 9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановой кислоты, 3,7-диметил-9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановой кислоты, 3,7-диметил-9-(2,2,6-триметилциклогексил)нонановой кислоты, и любой частично или полностью насыщенный ретиноид или его производную.

Другой пример нацеливающего липида представляет собой соединение формулы (В),

в которой

- линкер (X) представляет собой N1,N19-бис(3-(2-(2-(3-аминопропокси)этокси)этокси)пропил)-4,7,10,13,16-пентаоксанонадекан-1,19-диамид ("бисамидо-ПЭГ") или N1,N19-бис(16,20-диамино-15-оксо-4,7,10-триокса-14-азаикозил)-4,7,10,13,16-пентаоксанонадекан-1,19-диамид ("лиз-бисамидо-ПЭГ-лиз"); и

- ретиноид (R) выбирается из группы, состоящей из третиноин, адапален, ретинол, 4-гидрокси(фенил)ретинамид (4-HPR), и ретиноевую кислоту (витамин А), 9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановую кислоту, 3,7-диметил-9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановую кислоту, 3,7-диметил-9-(2,2,6-триметилциклогексил)нонановую кислоту, и любой частично или полностью насыщенный ретиноид или его производную.

Другие нацеливающие молекулы могут быть включены в липидную смесь, например, фолиевая кислота, витамин Е, пептидные лиганды и/или моноклональные антитела.

Композиции и составы на основе частиц лекарственное средство-липид

Описание включает композиции, содержащие липидные частицы с активным агентом или без него, в которых активный агент, когда присутствует, связан с липидной частицей. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения, активным агентом является терапевтическое средство. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения, активным агентом является отрицательно заряженный терапевтический полимер, инкапсулированный внутри внутренней водной среды липидной частицы. В других вариантах выполнения настоящего изобретения, активный агент присутствует внутри одного или более липидных бислоев липидной частицы. В других вариантах выполнения настоящего изобретения активный агент связан с внешней частью или внутренней частью липидной поверхности липидной частицы.

В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения липидные частицы согласно настоящему изобретению связаны с нуклеиновой кислотой с образованием частиц нуклеиновая кислота-липид. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения нуклеиновая кислота полностью инкапсулирована в липидной частице. Как применяется в описании настоящего изобретения термин "нуклеиновая кислота», как означает, включает любой олигонуклеотид или полинуклеотид. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению составляют 15-50 нуклеотидов в длину.

Термины "полинуклеотид" (PNA) и "олигонуклеотид" согласно настоящему изобретению относятся к полимеру или олигомеру мономеров нуклеотида или нуклеозида, состоящих из оснований, сахаров и связей между сахарами (скелет) природного происхождения. Термины "полинуклеотид" и "олигонуклеотид" также включают полимеры или олигомеры, содержащие мономеры неприродного происхождения или их части, которые функционируют подобным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто предпочтительны по сравнению с природными формами благодаря свойствам, таким как, например, повышенное клеточное поглощение и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.

Олигонуклеотидами могут быть как олигодеоксирибонуклеотиды или олигорибонуклеотиды. Олигодеоксирибонуклеотид состоит из деоксирибозы, соединенной ковалентно с фосфатом при 5' и 3' углеводородах этого сахара с формированием отрицательно заряженного чередующегося неразветвленного полимера. Олигорибонуклеотид состоит из подобной повторяющейся структуры, где каждый нуклеотид имеет рибозную сахарную группу. Модифицированные рибозные молекулы могут быть включены в олигорибонуклеотид.

Нуклеиновая кислота, которая присутствует в частице липид-нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению, включает любую форму нуклеиновой кислоты, которая известна. Нуклеиновые кислоты, применяемые в настоящей заявке, могут представлять собой однонитиевую ДНК или РНК, или двухнитиевую ДНК или РНК, или ДНК-РНК гибриды или РНК-РНК и/или ДНК-РНК гибриды или РНК дуплексы. Примеры двухнитиевой ДНК включают структурные гены, гены, включающие контролирующие и терминирующие области, и самореплицирующиеся системы, такие как вирусные или плазмидные ДНК. Примеры двухнитиевой РНК включают siPHK и другие реагенты РНК интерференции. Однонитиевые нуклеиновые кислоты включают, например, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, микроРНК, и триплекс-формирующие олигонуклеотиды.

Нуклеиновые кислоты могут иметь различную длину, как правило, в зависимости от конкретной формы нуклеиновой кислоты. Например, в конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения плазмиды или гены могут составлять от около 1,000 до 100,000 нуклеотидных остатков в длину. В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения олигонуклеотиды могут иметь от около 10 до 100 нуклеотидов в длину. В различных родственных вариантах выполнения настоящего изобретения олигонуклеотиды, либо однонитиевые, либо двухнитиевые, либо трехнитиевые, могут иметь в длину от около 10 до около 50 нуклеотидов, от около 21 до около 50 нуклеотидов, от около 15 до около 30 нуклеотидов, от около 20 до около 30 нуклеотидов в длину. Полинуклеотиды из 50 нуклеотидов или менее в общем обозначаются "фрагменты".

В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения олигонуклеотид (или его нить) может быть специфически гибридизован или комплементарен с целевым полинуклеотидом. Термин «специфически гибридизованный" и «комплементарный" применяются для обозначения достаточной степени комплементарности, так что происходит стабильное и специфическое связывание между целевой ДНК или РНК и олигонуклеотидом. Понимается, что олигонуклеотид не должен быть на 100% комплементарен его целевой последовательности нуклеиновой кислоте, чтобы быть специфически гибридизуемым. Олигонуклеотид является специфически гибридизуемым, когда связывание олигонуклеотида с его целью нарушает нормальную функцию целевой молекулы, вызывая уменьшение или потерю ее функциональности или экспрессии, и имеется достаточная степень специфического спаривания оснований, чтобы избежать неспецифического связывания олигонуклеотида с нецелевыми последовательностями в условиях, при которых желательно специфическое связывание, т.е. при физиологических условиях в случае in vivo анализов или терапевтического лечения, или, в случае in vitro анализов, в условиях, при которых проводятся анализы. Таким образом, в других вариантах выполнения настоящего изобретения этот олигонуклеотид включает 1, 2 или 3 основных замещений по сравнению с областью гена или последовательности мРНК, которая является нацеливающей или с которой он специфически гибридизуется.

В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения частицы нуклеиновая кислота-липид могут быть связаны с молекулами интерферирующих РНК (PHKi). Способы интерференции РНК с применением PHKi молекул могут применяться для нарушения экспрессии гена или полинуклеотида, представляющих интерес. siPHK представляют собой РНК дуплексы длиной, как правило, 15-30 нуклеотидов, которые могут связываться с цитоплазматическим мульти-белковым комплексом, известным как PHKi-индуцированный комплекс сайлесинга (RISC). RISC, загруженный siPHK, опосредует разрушение гомологичных мРНК транскриптов; поэтому siPHK может обозначатся как подавляющий экспрессию белка с высокой специфичностью. В отличие от других антисмысловых методик, siPHK функция в ходе природного механизма развивается с контролем генной экспрессии по некодирующей РНК. Это в общем рассматривается как причина, почему ее активность является более высокой in vitro и in vivo, чем у антисмыслового олигонуклеотида, либо рибозимов. PHKi реагенты могут включать ДНК смысловые: РНК антисмысловые гибриды, РНК смысловые: ДНК антисмысловые гибриды, и ДНК:ДНК гибриды способны опосредовать PHKi. Таким образом, PHKi молекулы, содержащие любой из этих различных типов двухнитиевых молекул, могут применяться. Кроме того, понимается, что PHKi молекулы могут применяться и вводиться в клетки во множестве различных форм. Соответственно, как применяется в описании настоящего изобретения, PHKi молекулы охватывают любую и все молекулы, способные индуцировать PHKi ответ в клетках, включая, но без ограничения к этому, двухнитиевые полинуклеотиды, содержащие две различные нити, т.е. смысловую нить и антисмысловую нить, например, малую интерферирующую РНК (siPHK); полинуклеотиды, содержащие петлю шпильку комплементарных последовательностей, которая образует двухнитиевую область, например, shPHKi молекулы, и экспрессионные вектора, которые экспрессируют один или более полинуклеотидов, способных образовывать двухнитиевый полинуклеотид сам по себе или в комбинации с другим полинуклеотидом.

РНК интерференция (PHKi) может применяться для специфического ингибирования целевых полинуклеотидов. Опосредованное двухнитиевой РНК подавление экспрессии гена и нуклеиновой кислоты может сопровождаться, согласно настоящему изобретению, введением dsPHK, siPHK или shPHK в клетки или организмы. siPHK может представлять собой двухнитиевую РНК, или гибридную молекулу, содержащую как РНК, так и ДНК, например, одну РНК нить и одну ДНК нить, или sisiPHK.

Нацеливающие PHKi молекулы специфические полинуклеотиды могут быть легко получены в соответствии с методиками, известными в данной области техники. Соответственно, специалисту в данной области техники будет понятно, что широкое многообразие различных молекул siPHK может применяться для нацеливания специфического гена или транскрипта. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения siPHK молекулы согласно настоящему изобретению представляют собой двухнитиевые и нуклеотиды длиной 16-30 или 18-25, включая каждое целое число между ними.

В общем, siPHK молекулы полностью комплементарны одной нити целевой молекуле ДНК. В других вариантах выполнения настоящего изобретения siPHK могут иметь модифицированный состав, такой как, например, 2'-деокси или 2-О-метил модификации. Однако, в предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения, не вся нить siPHK включает 2' деокси или 2'-O-модифицированные основания.

В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения изобретение относится к способам и композициям для получения частиц липид-инкапсулированной нуклеиновой кислоты, в которых нуклеиновые кислоты инкапсулированы внутри липидного слоя. Такие частицы нуклеиновая кислота-липид, включающие siPHK олигонуклеотиды, отличаются применением многообразия биофизических параметров, включая: (1) отношение нуклеиновой кислоты и липида; (2) эффективность инкапсуляции; и (3) размер частицы. Высокая эффективность инкапсуляции, хорошая нуклеазная устойчивость и сывороточная стабильность и контролируемый размер частиц, в общем менее 200 нм в диаметр, желательны. Кроме того, природа полимера нуклеиновой кислоты важна, так как модификация нуклеиновой кислоты для обеспечения нуклеазной устойчивости повышает стоимость терапевтического средства, тогда как во многих случаях обеспечивается лишь ограниченная устойчивость. Если иного не указано, эти критерии вычисляются согласно настоящему изобретению следующим образом:

Отношение липид: лекарственное средство представляет собой количество лекарственного средства в определенном объеме препарата, поделенное на количество липида в таком же объеме. Это может быть выражено как моль на моль основы или как масса на массу ocновы, или как масса на моль основы. Наконец, в случае готов для введения композиций, отношение липид: лекарственное средство вычисляется после диализа, хроматографии и/или ферментного (например, нуклеазного) расщепления, применяемых для удаления избыточного лекарственного средства.

Инкапсуляция

Для определения эффективности инкапсуляции (ЕЕ) siPHK, выражаемой в качестве процента инкапсулированной siPHK в частицах липид-нуклеиновая кислота, применяется анализ RiboGreen описанным далее образом. Эта методика может применяться для определения концентрации в растворе дуплекса и одноцепочечной РНК или ДНК.

Оборудование включает BioTek Instruments, Inc FLx800, пипетки с регулируемым объемом и вихревой смеситель. Реагенты включают воду, свободную от РНКазы (класс MilliQ или эквивален