Катионные эмульсии масло-в-воде

Катионные эмульсии масло-в-воде

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки США 61/50109, поданной 6 июля 2011 г., предварительной заявки США 61/545936, поданной 11 октября 2011 г. и предварительной заявки США 61/585641, поданной 11 января 2012 г., содержание которых включено в настоящее описание во всей своей полноте в виде ссылки.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[002] Настоящая заявка содержит список последовательностей, который подан в формате ASCII через систему on-line подачи заявок EFS-Web и таким образом включен в настоящее описание во всей своей полноте в виде ссылки. Указанная ASCII копия, созданная 5 июля 2012 г., представлена в файле PAT54691.txt, размер которого составляет 424203 байт.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[003] Терапевтические средства на основе нуклеиновых кислот являются потенциальными средствами для лечения заболеваний, от наследственных заболеваний до приобретенных состояний, таких как рак, инфекционные заболевания (СПИД), сердечные заболевания, артрит и нейродегенеративные расстройства (например, болезни Паркинсона и Альцгеймера). Можно доставлять не только функциональные гены для восстановления генетического дефицита или стимулирования экспрессии продуктов экзогенных генов, но также можно доставлять нуклеиновую кислоту для подавления экспрессии эндогенных генов с целью обеспечения терапевтического эффекта. Подавление экспрессии генов может происходить опосредованно, например, при участии антисмысловых олигонуклеотидов, двухнитевых РНК (например, миРНК, микроРНК) или рибосом.

[004] Ключевым этапом такой терапии является доставка молекул нуклеиновых кислот в клетки in vivo. Однако in vivo доставка молекул нуклеиновых кислот, в частности, молекул РНК, связана с некоторыми техническими сложностями. Во-первых, из-за воздействия клеточных и сывороточных нуклеаз время полувыведения РНК, вводимой in vivo, составляет всего около 70 секунд (см., например, Kurreck, Eur. J. Bioch. 270:1628-44 (2003)). Были предприняты попытки увеличить стабильность инъецированной РНК за счет химических модификаций; однако в некоторых случаях химические модификации приводят к увеличению цитотоксических эффектов или потере или ослаблению функции. В одном из конкретных примеров клетки были восприимчивы к дозам дуплекса интерферирующих РНК, в котором каждый второй фосфат заменяли фосфоротиоатом (Harborth, et al., Antisense Nucleic Acid Drug Rev. 13(2):83-105 (2003)). Соответственно, существует необходимость в разработке систем доставки, которые могут доставлять in vivo количество молекул нуклеиновых кислот (в частности, молекул РНК), достаточное для стимулирования терапевтического ответа, которые при этом не являются токсичными для хозяина.

[005] Вакцины на основе нуклеиновых кислот являются многообещающим подходом к вакцинации. Например, внутримышечная (IM) иммунизация плазмидной ДНК, кодирующей антиген, может индуцировать клеточный и гуморальный иммунные ответы и защитить от инфицирования. ДНК-вакцины имеют преимущества по сравнению с традиционными вакцинами на основе белковых антигенов или ослабленных патогенов. Например, в отличие от белковых вакцин, вакцины на основе ДНК могут быть более эффективными для продуцирования правильно свернутых антигенов в их нативной конформации и для генерации клеточного иммунного ответа. К тому же ДНК-вакцины свободны от некоторых проблем, связанных с безопасностью, которые возникают в случае применения убитых или ослабленных патогенов. Например, препараты на основе убитых вирусов могут содержать остаточное количество живых вирусов, а ослабленные вирусы могут мутировать и восстановить свой патогенный фенотип.

[006] Одно из ограничений для вакцин на основе нуклеиновых кислот заключается в том, что для получения эффективных иммунных ответов у приматов, не относящихся к человеку, и у людей обычно требуются большие дозы нуклеиновой кислоты. Следовательно, для усиления эффективности вакцин на основе нуклеиновых кислот требуются системы доставки и адъюванты. Для введения молекул нуклеиновой кислоты в клетку были разработаны различные способы, такие как кальций-фосфатная трансфекция, полипреновая трансфекция, слияние протопластов, электропорация, микроинъекция и липофекция.

[007] Для доставки генов в клетку катионные липиды составляли в виде липосом. Кроме того, для доставки в клетки молекул ДНК были разработаны эмульсии на основе катионных липидов. См., например, Kim, et al., International Journal of Pharmaceutics, 295, 35-45 (2005).

[008] Ott et al. (Journal of Controlled Release, volume 79, pages 1-5, 2002) описывает подход, в котором используется катионная субмикронная эмульсия в качестве системы/адъюванта для ДНК. Подход применения субмикронной эмульсии основан на использовании MF59, эффективном адъюванте сквален-в-воде, который является компонентом, одобренного для продажи продукта Fluad®. Для облегчения межклеточной доставки плазмидной ДНК используется 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP).

[009] Yi et al. (Pharmaceutical Research, 17, 314-320 (2000)) описывает катионные эмульсии масло-в-воде, в которых в качестве катионного липида используются соевое масло и DOTAP. Некоторые эмульсии также содержат холестерин, DOPE и полимерные липиды. Было показано, что эмульсии усиливают эффективность in vitro трансфекции ДНК в присутствии сыворотки в количестве вплоть 90%. Средний размер частиц эмульсии находился в пределах от 181 нм до 344 нм, и размер частиц увеличивался после разбавления эмульсий буфером PBS.

[010] Kim et al. (Pharmaceutical Research, vol. 18, pages 54-60, 2001) и Chung et al. (Journal of Controlled Release, volume 71, pages 339-350, 2001) описывают различные эмульсии масло-в-воде, которые использовались для усиления эффективности in vitro и in vivo трансфекции молекул ДНК. Среди протестированных катионных липидов DOTAP чаще всего образовывал стабильную эмульсию, эффективную для доставки ДНК. Среди протестированных масел сквален, легкое минеральное масло, и масло бобов жожоба образовывали стабильные эмульсии с небольшими частицами. Было показано, что эффективность in vitro трансфекции коррелировала со стабильностью эмульсий (например, эмульсия, образованная скваленом в концентрации 100 мг/мл и DOTAP в концентрации 24 мг/мл, демонстрировала высокую эффективность в in vitro трансфекции). Эту эмульсию готовили сначала смешиванием катионного липида с водой для образования липосомной суспензии (при обработке ультразвуком). Затем липосомы добавляли в масло (такое как сквален), и смесь обрабатывали ультразвуком до образования эмульсии масло-в-воде.

[011] Молекулы РНК, кодирующие антиген или его производные, также могут быть использованы в качестве вакцин. РНК-вакцины обладают некоторыми преимуществами по сравнению с ДНК-вакцинами. Однако по сравнению с ДНК-вакцинами, РНК-вакцинам было уделено относительно незначительное внимание. РНК легко подвергаются расщеплению нуклеазами при их введении в качестве терапевтического средства или вакцины. Кроме того, РНК не транспортируются активно в клетки. См., например, Vajdy, M., et al., Mucosal adjuvants and delivery systems for protein, DNA- and RNA-based vaccines, Immunol Cell Biol, 2004, 82(6): p. 617-27.

[012] Следовательно, имеется потребность в предоставлении систем для доставки молекул нуклеиновых кислот или других отрицательно заряженных молекул. Такие системы доставки являются полезными для вакцин на основе нуклеиновых кислот, в частности, РНК-вакцин.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[013] Изобретение относится к катионным эмульсиям масло-в-воде, которые содержат высокие концентрации катионных липидов и имеют определенное соотношение масло:липид. Масло и катионный липид являются отдельными компонентами эмульсий, при этом масло предпочтительно не является ионным. Катионный липид может взаимодействовать с отрицательно заряженной молекулой, связывая таким образом молекулу с частицами эмульсии. Описанные здесь катионные эмульсии можно использовать для доставки отрицательно заряженных молекул, таких как молекулы нуклеиновых кислот (например, РНК молекула, кодирующая антиген), в клетки и для получения вакцин на основе нуклеиновых кислот.

[014] В одном из аспектов изобретение предоставляет эмульсию масло-в-воде, содержащую частицы, которые диспергированы в непрерывной водной фазе, где эмульсия отличается тем, что: (a) средний диаметр указанных частиц находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм; (b) эмульсия содержит масло и катионный липид, при этом (i) соотношение масло:катионный липид (моль:моль) составляет по меньшей мере примерно 8:1 (моль:моль), (ii) концентрация катионного липида в указанной эмульсии оставляет по меньшей мере примерно 2,5 мМ, и (iii) при условии, что катионный липид не является DC-холестерином. Предпочтительно, эмульсия масло-в-воде является стабильной. В некоторых вариантах осуществления соотношение масло:липид (моль:моль) находится в пределах от примерно 10:1 (моль:моль) до примерно 43:1 (моль:моль). Эмульсия масло-в-воде может содержать от примерно 0,2% до примерно 8% (масс./об.) масла. В некоторых вариантах осуществления масло представляет собой сквален или сквалан.

[015] В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет эмульсию масло-в-воде, содержащую частицы, которые диспергированы в непрерывной водной фазе, при этом эмульсия отличается тем, что: (a) средний диаметр указанных частиц находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм; (b) эмульсия содержит масло и катионный липид, при этом (i) соотношение масло:липид (моль:моль) составляет по меньшей мере примерно 4:1 (моль:моль), (ii) концентрация катионного липида в указанной эмульсии составляет по меньшей мере примерно 2,5 мМ, (iii) содержание масла составляет от примерно 0,2% до примерно 8% (масс./об.); и (iv) при условии, что катионный липид не является DC-холестерином. Предпочтительно, эмульсия масло-в-воде является стабильной. В некоторых вариантах осуществления соотношение масло:липид (моль:моль) находится в пределах от примерно 4:1 (моль:моль) до примерно 43:1 (моль:моль). В некоторых вариантах осуществления масло представляет собой сквален или сквалан. В некоторых вариантах осуществления содержание масла составляет от 0,6% до 4% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления содержание масла составляет от примерно 1% до примерно 3,2% (масс./об.).

[016] Эмульсия масло-в-воде согласно этому аспекту может дополнительно содержать поверхностно-активное вещество (ПАВ), такое как неионогенное ПАВ. Предпочтительно, ПАВ не представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ)-липид. ПАВ может находиться в пределах от примерно 0,01% до примерно 2,5% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления ПАВ представляет собой SPAN85 (сорбитана триолеат), Tween® 80 (полисорбат 80) или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления эмульсия масло-в-воде содержит равные количества SPAN85 (сорбитана триолеат) и Tween® 80 (полисорбат 80), например, по 0,5% (масс./об.) каждого.

[017] Предпочтительно, головная группа катионного липида содержит четвертичный амин. Например, в некоторых вариантах осуществления катионный липид выбирают из группы, состоящей из: 1,2-диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропан (DOTAP), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (DOEPC), N,N-диолеоил-N,N-диметиламмония хлорид (DODAC), и N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид (DOTMA).

[018] В некоторых вариантах осуществления эмульсия отличается тем, что: (a) средний диаметр частиц эмульсии находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм; (b) эмульсия содержит масло и DOTAP, при этом (i) соотношение масло:DOTAP (моль:моль) составляет по меньшей мере примерно 8:1 (моль:моль), и (ii) концентрация DOTAP в указанной эмульсии составляет по меньшей мере примерно 2,58 мМ (1,8 мг/мл) или находится в пределах от примерно 2,58 мМ (1,8 мг/мл) до примерно 7,16 мМ (5 мг/мл). Масло может представлять собой сквален или сквалан.

[019] В некоторых вариантах осуществления эмульсия отличается тем, что: (a) средний диаметр частиц эмульсии находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм; (b) эмульсия содержит масло и DOTAP, при этом (i) соотношение масло:DOTAP (моль:моль) составляет по меньшей мере примерно 4:1 (моль:моль), (ii) концентрация DOTAP в указанной эмульсии составляет по меньшей примерно 2,58 мМ (1,8 мг/мл), и (iii) содержание масла составляет от примерно 0,2% до примерно 8% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления масло представляет собой сквален или сквалан. В некоторых вариантах осуществления концентрация DOTAP находится в пределах от примерно 2,58 мМ (1,8 мг/мл) до примерно 7,16 мМ (5 мг/мл). В некоторых вариантах осуществления содержание масла составляет от 0,6% до 4% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления содержание масла составляет от примерно 1% до примерно 3,2% (масс./об.).

[020] Изобретение также предоставляет способ получения эмульсии масло-в-воде, содержащей частицы, которые диспергированы в непрерывной водяной фазе, где эмульсия отличается тем, что: (a) средний диаметр указанных частиц находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм; (b) эмульсия содержит масло и катионный липид, при этом (i) соотношение масло:катионный липид (моль:моль) составляет по меньшей мере примерно 8:1 (моль:моль), (ii) концентрация катионного липида в указанной эмульсии составляет по меньшей мере примерно 2,5 мМ, и (iii) при условии, что катионный липид не является DC-холестерином, при этом способ содержит (a) непосредственное растворение катионного липида в масле для образования масляной фазы; (b) предоставление водной фазы эмульсии; и (c) диспергирование масляной фазы в водной фазе путем гомогенизации. Чтобы облегчить процесс растворения катионного липида в масле, масло может быть нагрето до температуры от примерно 30°C до примерно 65°C. Также могут быть использованы более высокие температуры, при условии, что это не приведет к значительному разложению масла или катионного липида.

[021] Изобретение предоставляет способ получения эмульсии масло-в-воде, содержащей частицы, которые диспергированы в непрерывной водяной фазе, где эмульсия отличается тем, что: (a) средний диаметр указанных частиц находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм; (b) эмульсия содержит масло и катионный липид, при этом (i) соотношение масло:катионный липид (моль:моль) составляет по меньшей мере примерно 4:1 (моль:моль), (ii) концентрация катионного липида в указанной эмульсии составляет по меньшей мере примерно 2,5 мМ, (iii) содержание масла составляет от примерно 0,2% до примерно 8% (масс./об.); (iv) при условии, что катионный липид не является DC-холестерином, при этом способ содержит (a) непосредственное растворение катионного липида в масле для образования масляной фазы; (b) предоставление водной фазы эмульсии; и (c) диспергирование масляной фазы в водной фазе путем гомогенизации. Чтобы облегчить процесс растворения катионного липида в масле, масло может быть нагрето до температуры от примерно 30°C до примерно 65°C. Также могут быть использованы более высокие температуры, при условии, что это не приведет к разложению масла или катионного липида.

[022] В другом аспекте изобретение предоставляет композицию, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты (предпочтительно, молекулу РНК), находящейся в комплексе с частицей катионной эмульсии масло-в-воде, где частица содержит масло, которое находится в жидкой фазе при 25°C, и катионный липид; и (i) соотношение масло:липид (моль:моль) составляет по меньшей мере примерно 8:1 (моль:моль); (ii) концентрация катионного липида в указанной эмульсии составляет по меньшей мере примерно 1,25 мМ; и (iii) при условии, что катионный липид не является DC-холестерином. Предпочтительно, средний диаметр частиц эмульсии находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм или от примерно 80 нм до 150 нм, или от примерно 80 нм до примерно 130 нм, и соотношение N/P композиции составляет по меньшей мере примерно 4:1, или находится в пределах от примерно 4:1 до примерно 20:1 или от примерно 4:1 до примерно 15:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение масло:липид (моль:моль) находится в пределах от примерно 10:1 (моль:моль) до примерно 43:1 (моль:моль). Эмульсия масло-в-воде может содержать от примерно 0,1% до примерно 5% (масс./об.) масла. В некоторых вариантах осуществления масло представляет собой сквален или сквалан.

[023] В другом аспекте изобретение предоставляет композицию, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты (предпочтительно, молекулу РНК), находящуюся в комплексе с частицей катионной эмульсии масло-в-воде, где частица содержит масло, которое находится в жидкой фазе при 25°C, и катионный липид; и (i) соотношение масло:липид (моль:моль) составляет по меньшей мере примерно 4:1 (моль:моль); (ii) концентрация катионного липида в указанной эмульсии составляет по меньшей мере примерно 1,25 мМ; (iii) содержание масла составляет от примерно 0,1% до примерно 4% (масс./об.); и (iv) при условии, что катионный липид не является DC-холестерином. Предпочтительно, средний диаметр частиц эмульсии находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм или от примерно 80 нм до 150 нм, или от примерно 80 нм до примерно 130 нм, и соотношение N/P композиции составляет по меньшей мере примерно 4:1, или находится в пределах от примерно 4:1 до примерно 20:1 или от примерно 4:1 до примерно 15:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение масло:липид (моль:моль) находится в пределах от примерно 4:1 (моль:моль) до примерно 43:1 (моль:моль). В некоторых вариантах осуществления масло представляет собой сквален или сквалан. В некоторых вариантах осуществления содержание масла составляет от 0,6% до 4% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления содержание масла составляет от примерно 1% до примерно 3,2% (масс./об.).

[024] Эмульсия масло-в-воде согласно этому аспекту может дополнительно содержать ПАВ, такое как неионогенное ПАВ. Предпочтительно, ПАВ не представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ)-липид. ПАВ может находиться в пределах от примерно 0,005% до примерно 1,25% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления ПАВ представляет собой SPAN85 (сорбитана триолеат), Tween® 80 (полисорбат 80) или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления эмульсия масло-в-воде содержит равные количества SPAN85 (сорбитана триолеат) и Tween® 80 (полисорбат 80), например, 0,25% или 0,5% (масс./об.) каждого.

[025] Предпочтительно, головная группа катионного липида содержит четвертичный амин. Например, в некоторых вариантах осуществления катионный липид выбирают из группы, состоящей из: 1,2-диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропан (DOTAP), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (DOEPC), N,N-диолеоил-N,N-диметиламмония хлорид (DODAC) и N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид (DOTMA).

[026] В других вариантах осуществления изобретение предоставляет композицию, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты (предпочтительно, молекулу РНК), находящуюся в комплексе с частицей катионной эмульсии масло-в-воде, где частица содержит масло, которое находится в жидкой фазе при 25°C, и (i) соотношение масло:DOTAP (моль:моль) составляет по меньшей мере примерно 8:1 (моль:моль), (ii) концентрация DOTAP в указанной композиции составляет по меньшей мере примерно 1,29 мМ, или находится в пределах от примерно 1,29 мМ (0,9 мг/мл) до примерно 3,58 мМ (2,5 мг/мл). Масло может представлять собой сквален или сквалан. Соотношение N/P необязательно составляет по меньшей мере 4:1.

[027] В предпочтительных вариантах осуществления композиция содержит буфер (например, цитратный буфер, сукцинатный буфер, ацетатный буфер) и имеет pH в пределах от примерно 6,0 до примерно 8,0, предпочтительно от примерно 6,2 до примерно 6,8. Композиция может дополнительно содержать неорганическую соль, при этом концентрация неорганической соли предпочтительно не превышает 30 мМ. Композиция необязательно может дополнительно содержать неионный регулирующий тоничность агент и предпочтительно является изотоничной.

[028] Изобретение также предоставляет способ получения композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты (предпочтительно, молекулу РНК), находящуюся в комплексе с частицей катионной эмульсии масло-в-воде, включающий: (i) предоставление эмульсии масло-в-воде согласно тому, как описано здесь; (ii) предоставление водного раствора, содержащего молекулу РНК; и (iii) объединение эмульсии масло-в-воде, полученной на этапе (i), и водного раствора, полученного на этапе (ii), получая таким образом композицию. В некоторых вариантах осуществления катионную эмульсию масло-в-воде и раствор РНК объединяют в соотношении 1:1 (об./об.). Водный раствор, содержащий молекулу РНК, предпочтительно содержит буфер (например, цитратный буфер, сукцинатный буфер, ацетатный буфер) и может содержать неорганическую соль (например, NaCl), которая предпочтительно присутствует в количестве 20 мМ или меньше. В одном из вариантов осуществления водный раствор, содержащий молекулу РНК, содержит 2 мМ цитратного буфера и 20 мМ NaCl. Водный раствор, содержащий молекулу РНК, необязательно дополнительно содержит неионный регулирующий тоничность агент и является изотоничным. В одном из вариантов осуществления водный раствор дополнительно содержит примерно 560 мМ сахарозы. Водный раствор, содержащий молекулу РНК, необязательно дополнительно содержит полимер или неионогенное ПАВ, такое как Pluronic® F127, в количестве от примерно 0,05% до примерно 20% (масс./об.).

[029] В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет эмульсию масло-в-воде, содержащую частицы, которые диспергированы в непрерывной водной фазе, при этом эмульсия содержит масло и катионный липид, средний диаметр указанных частиц находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм, содержание масла составляет от 0,6% до 4% (масс./об.). и концентрация катионного липида в указанной эмульсии составляет по меньшей мере примерно 1,25 мМ. Предпочтительно, эмульсия масло-в-воде является стабильной. В некоторых вариантах осуществления концентрация катионного липида в указанной эмульсии составляет по меньшей мере примерно 2,5 мМ. В некоторых вариантах осуществления масло представляет собой сквален или сквалан.

[030] Эмульсия масло-в-воде согласно этому аспекту может дополнительно содержать ПАВ, такое как неионогенное ПАВ. Предпочтительно, ПАВ не представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ)-липид. ПАВ может находиться в пределах от примерно 0,01% до примерно 2,5% (масс./об.). В некоторых вариантах осуществления ПАВ представляет собой SPAN85 (сорбитана триолеат), Tween® 80 (полисорбат 80) или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления эмульсия масло-в-воде содержит равные количества SPAN85 (сорбитана триолеат) и Tween® 80 (полисорбат 80), например, 0,25% или 0,5% (масс./об.) каждого.

[031] Предпочтительно головная группа катионного липида содержит четвертичный амин. Например, в некоторых вариантах осуществления катионный липид выбирают из группы, состоящей из: 1,2-диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропан (DOTAP), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (DOEPC), N,N-диолеоил-N,N-диметиламмония хлорид (DODAC) и N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид (DOTMA).

[032] Изобретение предоставляет композицию, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты (предпочтительно, молекулу РНК), находящуюся в комплексе с частицей эмульсии масло-в-воде, в которой частицы диспергированы в непрерывной водной фазе, где эмульсия содержит масло и катионный липид, средний диаметр указанных частиц находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм, масло находится в пределах от 0,6% до 4% (масс./об.), и концентрация катионного липида в указанной эмульсии составляет по меньшей мере примерно 1,25 мМ. Предпочтительно, эмульсия масло-в-воде является стабильной. В некоторых вариантах осуществления концентрация катионного липида в указанной эмульсии составляет по меньшей мере примерно 2,5 мМ. В некоторых вариантах осуществления масло представляет собой сквален или сквалан. Соотношение N/P композиции предпочтительно составляет по меньшей мере примерно 4:1.

[033] В предпочтительных вариантах осуществления композиция содержит буфер (например, цитратный буфер, сукцинатный буфер, ацетатный буфер) и имеет pH в пределах от примерно 6,0 до примерно 8,0, предпочтительно от примерно 6,2 до примерно 6,8. Композиция может дополнительно содержать неорганическую соль, при этом концентрация неорганической соли предпочтительно не превышает 30 мМ. Композиция необязательно может дополнительно содержать неионный регулирующий тоничность агент и предпочтительно является изотоничной.

[034] Изобретение также относится к способу генерации иммунного ответа у субъекта, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту описанной здесь композиции. Количество катионного липида, введенного субъекту (в качестве компонента композиции), при единичном применении предпочтительно не превышает 30 мг. В конкретных вариантах осуществления катионный липид представляет собой DOTAP, и общее количество DOTAP, введенное субъекту при единичном применении, не превышает примерно 24 мг или не превышает 4 мг.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[035] Фиг. 1 представляет собой схематичную диаграмму пентацистронных РНК репликонов, A526, A527, A554, A555 и A556, которые кодируют пять белков CMV. Субгеномные промоторы обозначены стрелками, также отмечены другие регуляторные элементы.

[036] Фиг. 2 представляет собой гистограмму флуоресценции, демонстрирующую, что клетки BHKV, трансфицированные РНК репликоном A527, экспрессируют пентамерный комплекс gH/gL/UL128/UL130/UL131. Окрашивание клеток осуществляли, используя антитело, которое связывается с конформационным эпитопом, присутствующим в пентамерном комплексе.

[037] Фиг. 3 представляет собой схематичную диаграмму или график. На схематичной диаграмме показаны бицистронные РНК репликоны, A160 и A531-A537, которые кодируют gH и gL CMV. На графике показана нейтрализующая активность иммунной сыворотки, полученной от мышей, иммунизированных VRP, которые содержали репликоны.

[038] Фиг. 4 представляет собой график, демонстрирующий антительный ответ на белок VZV в иммунной сыворотке, полученный от мышей, иммунизированных моноцистронными РНК репликонами, которые кодировали белки VZV, или бицистронными РНК репликонами, которые кодировали gE и gI или gH и gL VZV. Мышей иммунизировали 7 мкг РНК, находящейся в составе с CMF32.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Общее описание

[039] В целом, изобретение относится к катионным эмульсиям масло-в-воде, которые содержат высокие концентрации катионных липидов и имеют определенное соотношение масло:катионный липид. Масло и катионный липид являются отдельными компонентами эмульсий, при этом масло предпочтительно не является ионным. Катионный липид может взаимодействовать с отрицательно заряженной молекулой, такой как нуклеиновая кислота, связывая таким образом отрицательно заряженную молекулу с частицами эмульсии. Описанные здесь катионные эмульсии можно использовать для доставки in vivo отрицательно заряженных молекул, таких как молекулы нуклеиновых кислот (например, РНК молекула, кодирующая белок или пептид, небольшая интерферирующая РНК, самореплицирующаяся РНК и т.п.), и для получения вакцин на основе нуклеиновых кислот.

[040] В частности, настоящее изобретение основано на открытии того, что могут быть успешно созданы стабильные катионные эмульсии масло-в-воде, которые содержат высокие концентрации катионных липидов и имеют определенное соотношение масло:катионный липид. Эмульсии, которые содержат высокие концентрации катионных липидов, позволяют получать препаративные формы молекул с более высоким отрицательным зарядом (такие как молекулы РНК) с частицами эмульсии, увеличивая таким образом эффективность доставки. В частности, для многих терапевтических средств, таких как вакцины, предпочтительными для введения являются небольшие объемы (например, 0,5 мл на дозу). Эмульсии, которые содержат высокие концентрации катионных липидов и имеют определенное соотношение масло:катионный липид, как описано здесь, позволяют доставлять более высокие дозы РНК в заданных объемах.

[041] В предпочтительных вариантах осуществления молекула РНК находится в комплексе с частицей эмульсии масло-в-воде. Образующая комплекс РНК молекула стабилизирована и защищена от разрушающего воздействия РНКаз, и поглощается клетками более эффективно по сравнению со свободной ("голой") РНК.

[042] Кроме того, когда РНК доставляется для стимуляции экспрессии кодируемого белка, например, как в случае РНК вакцины, эмульсии, которые содержат высокие концентрации катионных липидов, могут увеличивать количество молекул РНК, которые находятся в комплексе с частицами эмульсии. Поскольку в клетки-хозяева доставляется большее количество молекул РНК, продуцируется более высокое количество кодируемого белкового антигена, что в свою очередь усиливает эффективность и иммуногенность РНК-вакцины. Наконец, иммуногенность кодируемого белка может быть усилена за счет адъювантных эффектов эмульсии. Следовательно, помимо более эффективной доставки отрицательно заряженных молекул (например, молекулы РНК, которая кодирует антиген), катионные эмульсии также могут усиливать иммунный ответ за счет адъювантной активности. Например, согласно приведенному здесь описанию и раскрытым примерам, препаративные формы, в которых молекулы РНК (кодирующие белок F респираторно-синцитиального вируса (RSV)) находились в комплексе с эмульсиями, содержащими высокие концентрации DOTAP, генерировали более сильные иммунные ответы в мышиной модели RSV и модели RSV хлопкового хомяка по сравнению с молекулами РНК, находящимися в комплексе с эмульсиями, содержащими низкие концентрации DOTAP.

[043] Соответственно, в одном из аспектов изобретение предоставляет эмульсию масло-в-воде, содержащую частицы, которые диспергированы в непрерывной водной фазе, при этом эмульсия отличается тем, что: (a) средний диаметр указанных частиц находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм; (b) эмульсия содержит масло и катионный липид, при этом (i) соотношение масло:катионный липид (моль:моль) составляет по меньшей мере примерно 8:1 (моль:моль), (ii) концентрация катионного липида в указанной эмульсии составляет по меньшей мере примерно 2,5 мМ, и (iii) при условии, что катионный липид не является DC-холестерином.

[044] В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет эмульсию масло-в-воде, содержащую частицы, которые диспергированы в непрерывной водной фазе, причем эмульсия отличается тем, что: (a) средний диаметр указанных частиц находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм; (b) эмульсия содержит масло и катионный липид, при этом (i) соотношение масло:катионный липид (моль:моль) составляет по меньшей мере примерно 4:1 (моль:моль), (ii) концентрация катионного липида в указанной эмульсии составляет по меньшей мере примерно 2,5 мМ, (iii) содержание масла составляет от примерно 0,2% до примерно 8% (масс./об.); и (iv) при условии, что катионный липид не является DC-холестерином.

[045] Катионная эмульсия может дополнительно содержать ПАВ (например, Tween® 80, SPAN85 или их комбинацию).

[046] В других аспектах изобретение также предоставляет несколько конкретных препаративных форм катионных эмульсий масло-в-воде, которые содержат высокие концентрации катионных липидов и могут быть использованы для доставки отрицательно заряженных молекул.

[047] В другом аспекте изобретение предоставляет способ получения эмульсии масло-в-воде, включающий: (1) непосредственное растворение катионного липида в масле для образования масляной фазы; (2) предоставление водной фазы эмульсии; и (3) диспергирование масляной фазы в водной фазе (например, путем гомогенизации). При необходимости, для облегчения процесса растворения липида в масле, масло может быть нагрето до температуры в пределах от примерно 30°C до примерно 65°C. Предпочтительно, соотношение масло:катионный липид (моль:моль) в масляной фазе составляет по меньшей мере примерно 8:1 (моль:моль), и, альтернативно или дополнительно, средний диаметр указанных частиц находится в пределах от примерно 80 нм до 180 нм, и/или концентрация катионного липида в масляной фазе составляет по меньшей мере примерно 5 мМ.

[048] В другом аспекте изобретение предоставляет способ получения композиции, которая содержит отрицательно заряженную молекулу (такую как молекула РНК), находящуюся в комплексе с частицей катионной эмульсии масло-в-воде, включающий: (i) предоставление эмульсии масло-в-воде, как описано здесь; (ii) предоставление водного раствора, содержащего молекулу РНК; и (iii) объединение водного раствора, полученного на этапе (ii), и эмульсии масло-в-воде, полученной на этапе (i), получая таким образом композицию. При необходимости, водный раствор, содержащий молекулу РНК, может содержать соль (например, NaCl), буфер (например, цитратный буфер), неионный регулирующий тоничность агент (например, сахарозу, трегалозу, сорбит или декстрозу), полимер (например, Плюроник F127) или их комбинацию.

[049] Катионные эмульсии по изобретению могут быть использованы для доставки отрицательно заряженной молекулы, такой как нуклеиновая кислота (например, РНК). Композиции могут быть введены нуждающемуся в этом субъекту для генерации или индуцирования иммунного ответа. Композиции также могут вводиться совместно с другой иммуногенной молекулой, иммуногенной композицией или вакциной для усиления эффективности индуцированного ответа.

2. Определения

[050] Используемый здесь термин "примерно" означает до ±5% от указанного значения.

[051] "Антиген" относится к молекуле, содержащей один или более эпитопов (либо линейных, конформационных, либо обоих типов).

[052] "Буфер" относится к водному раствору, который устойчив к изменениям pH раствора.

[053] Используемый здесь термин "нуклеотидный аналог" или "модифицированный нуклеотид" относится к нуклеотиду, который содержит одну или более химических модификаций (например, замещений) в или на азотистом основании нуклеозида (например, цитозине (C), тимине (T) или урациле (U), аденине (A) или гуанине (G)).

[054] Используемый здесь термин "частица" эмульсии относится к капле масла, суспендированной в водной (непрерывной) фазе эмульсии масло-в-воде. Частица дополнительно содержит катионный липид и необязательно дополнительные компоненты, такие как ПАВ.

[055] Термин "полимер" относится к молекуле, состоящей из отдельных соединенных вместе химических фрагментов, которые могут быть одинаковыми или разными. Используемый здесь термин "полимер" относится к отдельным химическим фрагментам, которые соединены последовательно, образуя линейную молекулу, а также отдельным химическим фрагментам, соединенным вместе в виде разветвленной (например, "с многочисленными ответвлениями" или "звездчатой") структуры. Иллюстративные полимеры включают, например, полоксамеры. Полоксамеры представляют собой неионные трехблочные полимеры, имеющие центральную гидрофобную цепь полиоксипропилена (поли(пропиленоксида)), фланкированную двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена (поли(этиленоксида)).

[056] Используемый здесь термин "сахарид" охватывает моносахариды, олигосахариды или полисахариды в виде прямой цепи или в кольцевых формах, или их комбинации, образующие сахаридную цепь. Олигосахариды представляют собой сахариды, содержащие два или более моносахаридных остатков. Примеры сахаридов включают глюкозу, мальтозу, мальтотриозу, мальтотетраозу, сукрозу и трегалозу.

[057] Эмульсия является "стабильной", если частицы эмульсии остаются разделенными без какой-либо существенной агломерации или коагуляции в течение по меньшей мере месяца, предпочтительно по меньшей мере двух месяцев, при 4°C. Средний диаметр частиц (среднеарифметический диаметр) стабильной эмульсии не изменяется более чем на 10% при хранении эмульсии при 4°C в течение одного месяца, или предпочтительно двух месяцев.

[058] Термин "поверхностно-активное вещество (ПАВ)" представляет собой термин, известный в уровне техники, относящийся к любой молекуле, имеющей как гидрофильные группы (например, полярные группы), для которых с энергетической точки зрения предпочтительна сольватация водой, так и гидрофобные группы, которые не сольватируются водой. Термин "неионогенное ПАВ" является термином, известным в данной области техники, и обычно относится к молекулам ПАВ, гидрофильные группы которого (например, полярные группы) не являются электрически заряженными.

[059] "Дзета-потенциал" эмульсии определяется электрофоретической подвижностью частиц эмульсии. Скорость частицы в единичном электрическом поле называется ее электрофоретической подвижностью. Дзета-потенциал относится к электрофоретической подвижности согласно уравнению Генри:

где U_E - электрофоретическая подвижность, z - дзета-потенциал, ε - диэлектрическая константа, η - вязкость, и f(ka) - функция Генри. Дзета-потенциал обычно измеряют устройством измерения электрофоретической подвижности, таким как анализатор размера частиц