Конъюгаты углевода и lna-олигонуклеотида

Конъюгаты углевода и lna-олигонуклеотида

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области конъюгатов терапевтически активных одноцепочечных антисмысловых LNA-олигонуклеотидов (LNA-закрытая нуклеиновая кислота). В изобретении предложены терапевтически активные конъюгаты углевода и LNA-олигонуклеотида, обладающие повышенной эффективностью, увеличенным терапевтическим индексом и пониженной токсичностью.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Конъюгаты олигонуклеотидов интенсивно изучали с целью их использования в миРНК, поскольку они считаются незаменимыми для обеспечения надлежащей эффективности in vivo. Например, WO 2004/044141 относится к модифицированным олигомерным соединениям, изменяющим экспрессию генов за счет РНК-интерференции. Олигомерные соединения включают одну или несколько конъюгатных группировок, способных модифицировать или улучшать фармакокинетические или фармакодинамические свойства связанных с ними олигомерных соединений.

WO 2012/083046 описывает кластер галактозы - компонент для адресной доставки миРНК.

В отличие от этого, одноцепочечные антисмысловые олигонуклеотиды в целях терапии обычно вводят без конъюгирования или включения в состав композиций. Основными тканями-мишенями для антисмысловых олигонуклеотидов являются печень и почки, хотя антисмысловые нуклеотиды могут воздействовать и на другие ткани, включая лимфоузлы, селезенку и костный мозг.

Согласно van Poelgeest et al. (American Journal of Kidney Disease, в печати) введение антисмысловых олигонуклеотидов LNA в клинических исследованиях могло приводить к острому почечному повреждению у человека. Согласно Swayze et al, NAR, Dec. 2006 (онлайн публикация) антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие закрытые нуклеиновые кислоты, более эффективны, однако обладают выраженной гепатотоксичностью у животных.

WO 2004/087931 описывает олигонуклеотиды, содержащие кислотолабильный гидрофильный полимерный конъюгат (ПЭГ).

WO 2005/086775 описывает адресную доставку лекарственных средств к определенным органам с применением терапевтически активного химического компонента, расщепляемого линкера и метки. Расщепляемые линкеры, например, могут представлять собой дисульфидную группу, пептид или расщепляемый рестрикционным ферментом олигонуклеотидный домен.

WO 2011/126937 описывает адресную доставку внутрь клеток олигонуклеотидов, конъюгированных с низкомолекулярными лигандами.

WO 2009/025669 описывает полимерные линкеры (полиэтилен гликоля), содержащие пиридил дисульфид. См. также Zhao et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 758-766.

Chaltin et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 827-836 описывает модифицированные холестерином моно-, ди- и тетрамерные олигонуклеотиды, используемые для включения антисмысловых олигонуклеотидов в катионные липосомы, для получения дендримерных систем доставки. Холестерин конъюгирован с олигонуклеотидом при помощи лизинового линкера.

Другие нерасщепляемые конъюгаты холестерина используют для адресной доставки в печень миРНК и антагомир, см., например, Soutscheck et al., Nature 2004 vol. 432 173-178 и Krützfeldt et al., Nature 2005 vol 438, 685-689. Применение холестерина в качестве компонента, обеспечивающего адресную доставку в печень, принципиально важно для активности частично тиофосфорилированных миРНК и антагомиров in vivo.

Bhat et al. (AASLD, 7-11 ноября 2013, постер) представили данные доклинических исследований о применении конъюгата анти-миРНК с GalNac, RG-101, блокирующего миРНК-122. Информация о том, что представляет собой RG-101, отсутствует.

Данное изобретение основано на том, что конъюгация LNA-олигонуклеотидов с углеводным конъюгатом, таким как конъюгат GalNAc, позволяет значительно улучшить активность, биораспределение и терапевтический индекс одноцепочечных антисмысловых LNA-олигонуклеотидов.

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В данной заявке испрашивается приоритет заявок ЕР 13153296.2 (подана 2013-01-30), ЕР 13157237.2 (подана 2013-02-28), ЕР 13174092.0 (подана 2013-06-27), ЕР 13192938.2 (подана 2013-11-14), ЕР 13192931.7 (подана 2013-11-14), ЕР 13192930.9 (подана 2013-11-14), РСТ/ЕР2013/073859 (подана 2013-11-14) и РСТ/ЕР2013/073859 (подана 2013-11-14), содержание которых включено путем ссылки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В изобретении предложен антисмысловой LNA-олигомер (который в данном документе может обозначаться как сегмент А), содержащий антисмысловой олигомер и конъюгатную группировку, обеспечивающий адресное взаимодействие с асиалогликопротеиновым рецептором, такой как GalNAc, который может быть частью другого сегмента (обозначаемого сегментом С).

В изобретении предложен антисмысловой LNA-олигомер (который в данном документе может обозначаться сегментом А), содержащий антисмысловой олигомер и компонент GalNAc, например, тривалентный компонент GalNAc, который может быть частью другого сегмента (обозначаемого сегментом С).

В изобретении предложен антисмысловой LNA-олигомер гэпмер (который в данном документе может обозначаться сегментом А), содержащий антисмысловой LNA-олигомер гэпмер и конъюгатную группировку, обеспечивающий адресное взаимодействие с асиалогликопротеиновым рецептором, такой как GalNAc, который может быть частью другого сегмента (обозначаемого сегментом С). Мишенью антисмыслового LNA-олигомера гэпмера может быть, например, мРНК или вирусная РНК.

В изобретении предложен антисмысловой LNA-олигомер миксмер (который в данном документе может обозначаться сегментом А), содержащий антисмысловой LNA-олигомер миксмер и конъюгатную группировку, обеспечивающую адресное взаимодействие с асиалогликопротеиновым рецептором, такой как GalNAc, который может быть частью другого сегмента (обозначаемого сегментом С). Мишенью антисмыслового LNA-олигомера миксмера может быть, например, мРНК или сайт сплайсинга мРНК или микроРНК.

В изобретении предложен антисмысловой LNA-олигомер тоталмер (totalmer) (который в данном документе может обозначаться сегментом А), содержащий антисмысловой LNA-олигомер тоталмер и конъюгатную группировку, обеспечивающую адресное взаимодействие с асиалогликопротеиновым рецептором, такой как GalNAc, который может быть частью другого сегмента (обозначаемого сегментом С). Мишенью антисмыслового LNA-олигомера миксмера может быть, например, микроРНК.

Антисмысловой LNA-олигомер может быть длиной от 7 до 30, например, от 8 до 26, или, в некоторых воплощениях, от 8 до 18 нуклеозидов и может содержать по меньшей мере одно LNA-звено (нуклеозид). Таким образом, в изобретении предложен конъюгат антисмыслового LNA-олигомера, содержащий антисмысловой олигомер и конъюгатную группировку, обеспечивающую адресное взаимодействие с асиалогликопротеиновым рецептором, такой как GalNAc, который может быть частью другого сегмента (обозначаемого сегментом С).

В изобретении предложен антисмысловой LNA-олигомер, ковалентно присоединенный к (например, связанный с) углеводному компоненту (не являющемуся нуклеозидом), такому как конъюгированный углеводный компонент. В некоторых воплощениях углеводный компонент не является линейным углеводным полимером. При этом углеводный компонент может быть мультивалентным, например, к олигомеру могут быть ковалентно присоединены 2, 3, 4 или 4 идентичных или неидентичных углеводных компонента, возможно, посредством линкера или линкеров.

В изобретении предложен антисмысловой LNA-олигомер (конъюгат), содержащий антисмысловой олигомер и конъюгатную группировку, содержащую углевод, такой как конъюгированный углеводный компонент.

В изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая олигомерное LNA-соединение по изобретению, а также фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.

В изобретении предложено олигомерное соединение по изобретению для применения с целью ингибирования в клетке нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых воплощениях применение представляет собой применение in vitro. В некоторых воплощениях применение представляет собой применение in vivo.

В изобретении предложено олигомерное соединение по изобретению для применения в медицине, например, для применения в качестве лекарственного средства. В изобретении предложено олигомерное соединение по изобретению для применения в лечении заболевания или нарушения.

В изобретении предложено применение олигомерного соединения по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения, например, метаболического заболевания или нарушения.

В изобретении также предложен LNA-олигомер, содержащий сегмент из 8-24 смежных нуклеозидов, связанных фосфоротиоатными связями, а также содержащий от 1 до 6 ДНК-нуклеозидов, смежных с LNA-олигомером, при этом связи, расположенные между ДНК-нуклеозидами и/или рядом с ДНК-нуклеозидом(ами), являются лабильными в физиологических условиях, например, такими как фосфодиэфирные связи. Такие LNA-олигомеры могут находиться в форме конъюгата, как описано в данном документе. В этом случае конъюгат может, например, представлять собой углевод, такой как конъюгат GalNac, кластер GalNac, например, триGalNac, или другой конъюгат, согласно данному описанию.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: Стадия конъюгации LNA-олигонуклеотида и GalNac.

Фиг. 2: Количество белка FVII.

Фиг. 3: Количество мРНК FVII.

Фиг. 4а-d: Пример 3 - количество FVII в сыворотке.

Фиг. 5а-d: Пример 3 - уровень мРНК FVII в печени.

Фиг. 6: Пример 3 - содержание олигонуклеотидов в печени и почках.

Фиг. 7a и b: Подавление экспрессии мРНК АроВ in vivo с использованием различных конъюгатов моноGalNAc. Мыши получали различные конъюгаты АроВ моно-GalNAc, либо не содержащие биорасщепляемого линкера, либо содержащие дитио-линкер (SS), либо ДНК/РО-линкер (РО) (А), а также проводили сравнение моноGalNAc с ДНК/РО-линкером с кластером GalNAc (В). РНК выделяли из образцов печени (А) и почек (В) и исследовали на предмет снижения экспрессии мРНК АроВ. Приведены данные в сравнении с физиологическим раствором (=1).

Фиг. 8: Пример 5 - экспрессия мРНК АроВ.

Фиг. 9: Пример 5 - общий холестерин сыворотки.

Фиг. 10: Пример 5 - содержание олигонуклеотидов в печени и почках.

Фиг. 11: Пример 6 - количество FVII в сыворотке.

Фиг. 12: Пример 6 - количество мРНК FVII в печени.

Фиг. 13: Примеры соединений и конъюгатных группировок, использованных в Примерах.

Фиг. 14: Примеры конъюгатов три-GalNac, которые можно использовать. Конъюгаты 1-4 являются примерами 4 подходящих конъюгированных компонентов GalNac, а конъюгаты 1а-4а представляют те же конъюгаты с дополнительным линкерным компонентом (Y), который используют для связывания конъюгата с олигомером (сегмент А) или с биорасщепляемым линкером (таким как сегмент В). Волнистой линией обозначена ковалентная связь с олигомером.

Фиг. 15: Экспрессия Kim-1 при исследовании безопасности на крысах (см. Пример 10).

Фиг. 16: Уровни АроВ и холестерина липопротеидов низкой плотности (LDL-C) у мышей, получавших соединения с последовательностью SEQ ID NO 32 или 17 в дозе 1 или 2,5 мг/кг однократно.

Фиг. 17: Подавление экспрессии миР-122 в печени мышей с использованием миниатюрных LNA, спаривающихся с последовательностью т.н. "seed region" (сайт узнавания мишени) (seed-targeting tiny LNA). (а) Нозерн-блот-анализ РНК печени мышей, получавших внутривенно 3 дозы по 20 мг/кг миниатюрных анти-миР-122, пентадекамера анти-миР-122 или рандомизированных контрольных LNA или физиологический раствор.

Фиг. 18: Исследование общего холестерина перед введением, на 4 и 7 сутки. Холестерин повышен вследствие снижения миР-122.

Фиг. 19: Экспрессию Aldo А и Bckdk исследовали с помощью стандартной TaqMan Q-PCR. Уровень мРНК этих генов повышен вследствие снижения миРНК-122.

Фиг. 20: АЛТ определяли в сыворотке, полученной в конце эксперимента (на 7 сутки) для оценки переносимости соединений.

Фиг. 21: Для оценки антивирусного эффекта LNA-соединений с последовательностями SEQ ID 55 и SEQ ID 56 исследовали репликацию вируса в печени мышей Balb/C через 7 дней после гидродинамической инъекции в хвостовую вену pAAV2/HBV. Соединения вводили в/в однократно за 24 ч до гидродинамической инъекции, в той же дозе, что и препарат сравнения энтекавир, который вводили ежедневно перорально, начиная через 24 ч после гидродинамической инъекции. Количественное определение ДНК HBV выполняли с помощью qPCR и результаты выражали в виде геномных эквивалентов на 100 нг ДНК печени.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к соединениям LNA-олигомеров, таким как антисмысловые LNA-олигонуклеотиды, ковалентно связанным с ненуклеотидными конъюгированными группами углеводов.

Олигомер

В изобретении предложен конъюгат антисмыслового олигомера закрытых нуклеиновых кислот (LNA-олигомера), содержащий антисмысловой LNA-олигомер и конъюгатную группировку, содержащую углевод, такой как конъюгированный углеводный компонент, ковалентно связанный с антисмысловым LNA-олигомером.

Данное изобретение относится к соединениям LNA-олигомеров (также обозначаемым как LNA-олигомеры или LNA-олигонуклеотиды) для применения с целью модулирования, например, ингибирования в клетке нуклеиновой кислоты-мишени. LNA-олигомер содержит по меньшей мере один LNA-нуклеозид (от англ. Locked Nucleic Acid, закрытая (замкнутая, запертая) нуклеиновая кислота), например, нуклеозид, содержащий ковалентный мостик (также обозначаемый радикалом) между атомами во 2' и 4' положениях (связь 2'-4'). LNA-нуклеозиды также обозначают «бициклическими нуклеозидами». LNA-олигомер обычно представляет собой одноцепочечный антисмысловой олигонуклеотид.

В некоторых воплощениях LNA-олигомер содержит или представляет собой гэпмер. В некоторых воплощениях LNA-олигомер содержит или представляет собой миксмер. В некоторых воплощениях LNA олигомер содержит или представляет собой тоталмер.

В некоторых воплощениях все аналоги нуклеозидов, присутствующие в олигомере, представляют собой LNA, а олигомер необязательно может также содержать РНК или ДНК, например, ДНК-нуклеозиды (например, в составе гэпмера или миксмера).

В различных воплощениях соединение по изобретению не содержит (звенья) РНК. В некоторых воплощениях олигомер имеет последовательность смежных нуклеотидов, которые представляют собой линейную молекулу или синтезируются в виде линейной молекулы. Олигомер, таким образом, может быть одноцепочечной молекулой. В некоторых воплощениях олигомер не содержит коротких сегментов, например, по меньшей мере из 3, 4 или 5 смежных нуклеотидов, которые комплементарны гомологичным сегментам в составе самого олигомера (т.е. дуплексов). В некоторых воплощениях олигомер может (по существу) не быть двуцепочечным. Олигомер по существу не является двуцепочечным, так же как и миРНК. В некоторых воплощениях олигомерное соединение не находится в форме дуплекса с (по существу) комплементарным олигонуклеотидом - т.е. не является миРНК.

Длина

Термин «олигомер» в контексте данного изобретения обозначает молекулу, образованную путем ковалентного связывания двух или более нуклеотидов (т.е. олигонуклеотид). В данном документе одиночный нуклеотид (звено) может также обозначаться мономером или звеном. В некоторых воплощениях термины «нуклеозид», «нуклеотид», «звено» и «мономер» используют взаимозаменяемо. Считается, что при упоминании последовательности нуклеотидов или мономеров имеют в виду последовательность оснований, таких как А, Т, G, С или U.

Олигомер может содержать или состоять из последовательности смежных нуклеотидов длиной приблизительно от 7 до 30, например, от 7 до 26 или от 8 до 25, например, длиной 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 нуклеотидов, например, длиной от 10 до 20 нуклеотидов. В некоторых воплощениях длина олигомера LNA составляет 10-16 нуклеотидов, например, 12, 13 или 14 нуклеозидов. В некоторых воплощениях, олигомер LNA имеет 7, 8, 9 нуклеозидов в длину, как, например, миниатюрные LNA ("Tiny" LNA).

В некоторых воплощениях олигомеры также содержат или состоят из последовательности смежных нуклеотидов общей длиной от 10 до 22, например, от 12 до 18, например, от 13 до 17 или от 12 до 16, например, 13, 14, 15, 16 смежных нуклеотидов.

В некоторых воплощениях олигомеры также содержат или состоят из последовательности смежных нуклеотидов общей длиной 10, 11, 12, 13 или 14 смежных нуклеотидов.

В некоторых воплощениях олигомер по изобретению состоит не более чем из 22 нуклеотидов, например, не более чем из 20 нуклеотидов, например, не более чем из 18 нуклеотидов, например, из 15, 16 или 17 нуклеотидов. В некоторых воплощениях олигомер по изобретению содержит менее 20 нуклеотидов. Считается, что когда длина олигомера или последовательности смежных нуклеотидов выражена в виде диапазона, она включает нижний и верхний пределы диапазона, например, диапазон от 10 до 30 (или между 10 и 30) включает как 10, так и 30.

В некоторых воплощениях применение конъюгатов углеводов по изобретению оказалось особенно подходящим для коротких LNA-олигомеров, включая короткие гэпмеры, миксмеры или тоталмеры (миниатюрные LNA), таких как LNA-олигомеры из менее чем 20, например, менее 18, менее 16 нуклеотидов или менее 15 или 14 нуклеотидов или менее.

Межнуклеозидные связи

В некоторых воплощениях межнуклеозидные связи LNA-олигомеров содержат по меньшей мере одну межнуклеозидную связь, отличную от фосфодиэфирной, например, по меньшей мере одна, например, по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 75%, например, по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 100% межнуклеозидных связей в сегменте А отличаются от фосфодиэфирных. В некоторых воплощениях отличные от фосфодиэфирных межнуклеозидные связи представляют собой серосодержащие межнуклеозидные связи, такие как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная, такие как фосфоротиоатная.

В некоторых воплощениях LNA-олигомер может содержать по меньшей мере одну фосфоротиоатную межнуклеозидную связь, например, по меньшей мере две, три или четыре фосфоротиоатных связи, а в некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей могут быть фосфоротиоатными, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 90% или все межнуклеозидные связи (кроме тех, что могут присутствовать в отщепляемом линкере) могут быть фосфоротиоатными. В некоторых воплощениях межнуклеозидные связи между двумя концевыми нуклеозидами на 5' конце, на 3' конце или на 5' и на 3' концах (кроме связей в сегменте В, если таковой существует) представляют собой серосодержащие межнуклеозидные связи, такие как фосфоротиоатные. В некоторых воплощениях олигомер содержит по меньшей мере один сегмент последовательно расположенных ДНК-нуклеозидов, например, сегмент из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 последовательно расположенных ДНК-нуклеозидов, в котором межнуклеозидные связи между ДНК-нуклеозидами представляют собой серосодержащие межнуклеозидные связи, такие как фосфоротиоатные. В некоторых воплощениях в центральном сегменте гэпмера (Y), который обычно содержит сегмент последовательно расположенных ДНК-нуклеозидов, между нуклеозидами имеются серосодержащие межнуклеозидные связи, такие как фосфоротиоатные, например, между последовательно расположенными ДНК-нуклеозидами и/или между ДНК-нуклеозидами и аналогами нуклеозидов, такими как нуклеозиды с модифицированными углеводами, обозначаемыми в данном документе LNA.

Другие примеры межнуклеозидных связей, которые могут использоваться в олигомерах, включают метилфосфонатную (СН3Р=O) и метилтионофосфатную (CH3P=S) и боранофосфатную.

Нуклеозиды закрытых нуклеиновых кислот (LNA)

Бициклические аналоги нуклеозидов (LNA-нуклеозиды) включают аналоги нуклеозидов, которые обычно содержат мостик (или бирадикал), соединяющий второй и четвертый атом углерода в кольце рибозы (мостик С4*-С2* или бирадикал). Наличие бирадикала между 2 и 4 углеродом запирает рибозу в 3' эндо-конформации, и поэтому бициклические аналоги нуклеозидов, содержащие С4*-С2* бирадикал, часто обозначают закрытыми нуклеиновыми кислотами (от англ. Locked nucleic acid, LNA) или бициклическими нуклеиновыми кислотами (от англ. bicyclic nucleic acids, BNA). Термины LNA и BNA в данном документе используют взаимозаменяемо.

В некоторых воплощениях некоторые или все нуклеозиды в составе LNA-олигомера могут быть модифицированными нуклеозидами, которые в данном документе также обозначают аналогами, например, аналогами с модифицированными углеводами, например, бициклическими аналогами нуклеозидов (например, LNA) и/или 2' замещенными аналогами нуклеозидов. В некоторых воплощениях все аналоги нуклеозидов, присутствующие в составе олигомера, содержат одинаково модифицированные углеводы, например, все являются бициклическими аналогами нуклеозидов, и могут быть (возможно, независимо) выбраны из группы, состоящей из бета-D-X-LNA или альфа-L-X-LNA (где X обозначает окси, амино или тио), или другими LNA, описанными в данном документе, включая (R/S) сЕТ, сМОЕ или 5'-Me-LNA, но не ограничиваясь ими.

В некоторых воплощениях, олигомер может содержать по меньшей мере один бициклический нуклеозид (LNA) и по меньшей мере еще один аналог нуклеозида, например, один или несколько 2'замещенных нуклеозидов. В некоторых воплощениях некоторые или все нуклеозиды в олигомере могут быть модифицированными нуклеозидами, которые в данном документе также обозначают аналогами нуклеозидов.

В некоторых воплощениях первый сегмент содержит по меньшей мере один, например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24 или 25 аналогов нуклеозидов. В некоторых воплощениях аналоги нуклеозидов (возможно, независимо) выбирают из группы, состоящей из бициклических аналогов нуклеозидов (таких как LNA) и/или 2'замещенных аналогов нуклеозидов, например, (возможно, независимо) выбранных из группы, состоящей из звеньев 2'-O-алкил-РНК, звеньев 2'-ОМе-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, 2'-АР, 2'-FANA, 2'-(3-гидрокси)пропил и звеньев 2'-фтор-ДНК и/или других (возможно) аналогов нуклеозидов с модифицированным углеводом, таких как морфолино, пептидно-нуклеиновые кислоты (PNA, от англ. peptide nucleic acid), CeNA, раскрытые нуклеиновые кислоты (UNA, от англ. unlocked nucleic acid), гексит-нуклеиновые кислоты (HNA, от англ. hexitol nucleic acid), бицикло-HNA (см., например, WO 2009/100320). В некоторых воплощениях аналоги нуклеозидов повышают аффинность первого сегмента к его нуклеиновой кислоте-мишени (или комплементарной последовательности ДНК или РНК). Различные аналоги нуклеозидов описаны в публикациях Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 и Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, содержание которых включено путем ссылки.

В некоторых воплощениях меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, например, все аналоги нуклеозидов, содержащиеся в составе LNA-олигомера (или все нуклеозиды, содержащиеся в составе тоталмера), являются бициклическими аналогами нуклеозидов, такими как LNA, например, бета-D-X-LNA или альфа-L-X-LNA (где X обозначает окси, амино или тио) или другими LNA, описанными в данном документе, включая (R/S) сЕТ, сМОЕ или 5'-Me-LNA, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях LNA олигомер содержит ДНК и аналоги нуклеозидов с модифицированными углеводами, такие как бициклические аналоги нуклеозидов и/или 2' замещенные аналоги нуклеозидов. В некоторых воплощениях олигомер содержит звенья нуклеозидов ДНК и LNA.

WO 05/013901, WO 07/027775, WO 07027894 описывают олигомеры, в которых каждый нуклеозид является 2' замещенным, например, 2'-O-МОЕ. В некоторых воплощениях первый сегмент олигомера может содержать 2' замещенные нуклеозиды. WO 07/027775 также описывает миксмеры МОЕ, LNA, ДНК для адресного взаимодействия с микроРНК.

Мишень

Конъюгаты LNA-олигомеров по изобретению обычно применяют для адресного взаимодействия с нуклеиновой кислотой-мишенью, обозначаемой в данном документе мишенью. В некоторых воплощениях олигомер по изобретению применяют, например, для модулирования нуклеиновой кислоты (т.е. мишени), выбранной из группы, состоящей из мРНК, микроРНК, длинной некодирующей рНК (IncPHK, от англ. long non-coding РНК), малой ядерной РНК (snРНК, от англ. small nuclear РНК), малой ядрышковой РНК (snoРНК, от англ. small nucleolar РНК) и вирусной РНК.

В некоторых воплощениях мишенью олигомера является РНК, экспрессируемая в печени, например, экспрессируемая в печени мРНК или микроРНК. В некоторых воплощениях мишенью антисмыслового LNA-олигомера является мРНК, выбранная из группы, состоящей из фактора VII, PCSK9, АроВ, GCGR, CRP, DGAT2, GCCR, PTEN, РТР1В, SGLT2 и SOD1 (см., например, WO 2007/146511, содержание которого включено путем ссылки. В частности, в данный документ включена Таблица из WO'511, приведенная на с. 42-43). В некоторых воплощениях мишень может быть выбрана из группы, состоящей из: АроВ человека NM 000384.1, АроВ мыши ХМ 137955.5, натрий-глюкозного котранспортера 2 типа, или SGLT2 (от англ. sodium-glucose cotransporter 2) человека NM 003041.1, пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9, или PCSK9 (от англ. proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) человека NM 174936.2, супероксиддисмутазы, или SODI (от англ. superoxide dismutase) человека Х02317, С-реактивного белка, или CRP (от англ. C-reactive protein) человека NM 000567.1, глюкагонового рецептора, или GCCR (от англ. glucagon receptor) мыши ВС031885.1, GCGR человека NM 000160.1, диацилглицерин ацилтрансферазы 2 типа, или DGAT2 (от англ. Diacylglycerol O-Acyltransferase 2) человека NM 032564.2, протеиновой тирозинфосфатазы типа 1В, или PTPIB (от англ. protein tyrosine phosphatase IB) человека NM 002827.2, фосфатазы и гомолога тензина, или PTEN (от англ. Phosphatase and tensin homolog) мыши U92437.1, PTEN человека NM 000314.4 (приведенные ссылки представляют учетные номера в базе данных GENBANK), коагуляционного фактора VII, С6 компонента комплемента и транстиретина, или TTR (от англ. transthyretin). Нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор VII, включает: Последовательность с учетным номером GENBANK NM 000131.3, последовательность с учетным номером GENBANK NM 019616.2, нуклеотиды с 1255000 по 5 1273000 в последовательности с учетным номером GENBANK NT 027140.6, последовательность с учетным номером GENBANK NM 010172.3 и нуклеотиды с 10024000 по 10037000 в последовательности с учетным номером GENBANK NT 039455.6, но не ограничивается ими. Нуклеотидные последовательности компонента комплемента С6 включают ВС035723.1, J05024.1 GI: 187824 и J05064.1 GI: 179703. См. также ЕР 2320925 А2, где изложены LNA-олигонуклеотиды, мишенью которых является С6 компонент комплемента. Нуклеотидные последовательности TTR (транстиретина) включают ВС020791.1 GI:18089144 и ВС005310.1 GI:13529049.

Примеры LNA-олигомеров, мишенью которых является PCSK9, приведены в WO 2008/043753 и WO 2001/009697, содержание которых включено путем ссылки.

Примеры LNA-олигомеров, мишенью которых является АроВ, приведены в WO 2010014280 и WO 2008/113830, содержание которых включено путем ссылки.

В некоторых воплощениях мишень может представлять собой мРНК Bcl2 - см. WO 2005/061710, где описаны LNA-олигомеры, мишенью которых является Bcl2 (например, М13994.1 GI: 179366).

Мишень может представлять собой РНК, которая экспрессируется в печени. Мишень может представлять собой мишень, экспрессируемую в печени, связанную с заболеванием или нарушением. С печенью связаны различные метаболические нарушения, и в некоторых воплощениях их можно лечить с применением соединений по изобретению. Мишени ассоциированных с печенью метаболических заболеваний или нарушений включают, например, Аро-В (высокий уровень холестерина ЛПНП, острый коронарный синдром), ApoCIII (повышенный уровень триглицеридов сыворотки), АроА (сердечно-сосудистые заболевания), FGFR4 (ожирение), GCCR (диабет 2 типа), GCGR (диабет 2 типа), РТР1В (диабет 2 типа), DGAT2 (неалкогольный стеатогепатит), PCSK9 (гиперлипидемия и родственные ей нарушения), MtGPAT, миР-122 (высокий уровень холестерина) и миР-33 (метаболический синдром, атеросклероз).

Мишень может представлять собой вирусную нуклеиновую кислоту, например, вирусную РНК. Примеры включают вирусы гепатита, например, вирус гепатита В и гепатита С (HCV). Вирусные гепатиты включают гепатиты А, В, С, D и Е. Антисмысловые LNA-олигомеры, мишенью которых является HCV, описаны, например, в публикации Laxton et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2011 Vol 55 3105-3114.

Таким образом, олигомер может найти применение в лечении связанных (или ассоциированных) с печенью метаболических заболеваний, которые в данном документе обозначают метаболическими заболеваниями печени. Связанные с печенью метаболические заболевания включают, например, метаболический синдром, ожирение, гиперлипидемию, атеросклероз, нарушение соотношения ЛПВП и ЛПНП, дислипидемии, например, семейную комбинированную гиперлипидемию (СКГЛ), приобретенную гиперлипидемию, резистентную к терапии статинами гиперхолестеринемию, сердечно-сосудистые заболевания, атеросклеротическую болезнь сердца и ишемическую болезнь сердца (ИБС), атеросклероз, болезни сердца, диабет (1 и/или 2 типа), неалкогольный стеатогепатит, острый коронарный синдром (ОКС). В некоторых воплощениях связанное или ассоциированное с печенью заболевание или нарушение ассоциировано с экспрессией, например, повышенной экспрессией нуклеиновой кислоты-мишени в печени.

В некоторых воплощениях, например, когда мишенью является микроРНК-122, заболевание может представлять собой вирусное заболевание, такое как гепатит, включая гепатит В и гепатит С, или метаболическое заболевание, связанное с повышением холестерина, такое как атеросклероз и гиперлипидемия и родственные им нарушения. Олигомеры, мишенями которых является миР-122, также могут применяться для улучшения функции печени (см., например, РСТ/ЕР2012/071934), для лечения некротического воспаления, для улучшения концентрации биомаркеров функции печени в сыворотке, для предупреждения потери (или замедления нарушения) функции печени у человека, инфицированного или не инфицированного HCV и имеющего риск нарушения функции печени, для улучшения функции печени у человека, инфицированного или не инфицированного HCV, нуждающегося в улучшении функции печени. Заболевание печени может представлять собой заболевание или нарушение, выбранное из группы, состоящей из неалкогольной жировой болезни печени (НЖАБП) и неалкогольного стеатогепатита; или из группы, состоящей из заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из цитомегаловирусной инфекции, шистосомоза и лептоспироза.

В некоторых воплощениях мишенью олигомера по изобретению является экспрессируемая в печени микроРНК, например, миР-122. Олигомеры, мишенью которых является миРНК-122, описаны в WO 2007/112754, WO 2007/112753, WO 2009/043353, и могут представлять собой миксмеры, такие как SPC3649, также известный под названием миравирсен (miravirsen, имеет последовательность 5'-CcAttGTcaCaCtCC-3' (SEQ ID NO 57), где заглавные буквы обозначают бета-D-окси LNA, строчные буквы обозначают ДНК, в которых все связи являются фосфоротиоатными, а цитозины LNA представляют собой 5-метилцитозин), или миниатюрные LNA, такие как описанные в WO 2009/043353 (например, 5'-АСАСТСС-3', 5'-САСАСТСС-3', 5''-ТСАСАСТСС-3', SEQ ID NOs 58, 59&33) где заглавные буквы обозначают LNA (возможно, бета-D_окси), в которых все связи являются фосфоротиоатными, а цитозины LNA могут представлять собой 5-метилцитозин). В некоторых воплощениях длина олигомеров, мишенью которых является миР-122, составляет 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 нуклеотидов. В некоторых воплощениях последовательность олигомеров, мишенью которых является миР-122, полностью комплементарна миР-122 на всем протяжении олигомера и, предпочтительно, включает последовательность 5'-САСАСТСС-3'. Согласно базе данных miRBase, зрелая микроРНК-122 имеет последовательность 5' uggagugugacaaugguguuugu 3' (SEQ ID NO 34). В некоторых воплощениях олигомер, мишенью которого является микроРНК, например, миР-122, является комплементарным соответствующему сегменту микроРНК на всем протяжении олигомера и в некоторых воплощениях 3' нуклеозид олигомера комплементарен (т.е. спаривается) с первым, вторым, третьим или четвертым 5' нуклеотидом микроРНК, такой как миР-122, например, со вторым 5' нуклеотидом микроРНК, такой как миР-122.

В некоторых воплощениях мишенью олигомера по изобретению является экспрессируемая в печени микроРНК, например, миР-33 (миР-33a и/или миР-33b), что может использоваться в лечении метаболических заболеваний, таких как атеросклероз (см., например, WO 2010/120508). Олигомер, мишенью которого является миР-33a/b, может содержать последовательность нуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из: 5'-TACAATGCA-3', 5'-ACAATGCAC-3', 5'-ACAATGCA-3' и 5'-CAATGCA-3' (SEQ ID Nos 35-38), конкретными примерами олигомеров, мишенью которых является миР-33a/b, могут быть 5'-TACAATGCA-3', 5'-ACAATGCA-3' и 5'-CAATGCA-3', где заглавные буквы обозначают (возможно, бета-D_окси) LNA, где все связи являются фосфоротиоатными, а цитозины LNA возможно представляют собой 5-метилцитозин. Согласно базе данных miRBase, зрелая микроРНК-33a имеет последовательность 5'-GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA-3' (SEQ ID NO 39), а миРНК-33b - 5' GUGCAUUGCUGUUGCAUUGC-3' (SEQ ID NO 40).

В некоторых воплощениях мишенью олигомера по изобретению является экспрессируемая в печени микроРНК, например, миР-21, что можно использовать в лечении таких заболеваний, как фиброз печени или гепатоцеллюлярная карцинома. Олигомеры, мишенью которых является миР-21, могут содержать последовательность нуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из: 5'-TGATAAGCT-3', 5'-GATAAGCT-3', 5'-ATAAGCT-3' (SEQ ID Nos 41-43), конкретными примерами олигомеров, мишенью которых является миР-21 могут быть: 5'-TGATAAGCT-3', 5'-GATAAGCT-3', 5'-ATAAGCT-3' или 5' TcAGtCTGaTaAgCT 3' (SEQ ID NO 44) где заглавные буквы обозначают (возможно, бета-D_окси) LNA, строчные буквы обозначают ДНК, в которых все связи являются фосфоротиоатными, а цитозины LNA возможно представляют собой 5-метилцитозин. LNA-олигомер с фосфоротиоатными связями (например, бета-D-окси-LNA) с последовательностью 5-GATAAGCT-3' (LNA С представляет собой 5-метилцитозин) широко использовали для ингибирования миР-21 in vivo (SEQ ID NO 51). Согласно базе данных miRBase, зрелая микроРНК-21 имеет последовательность 5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3' (SEQ ID NO 45).

В некоторых воплощениях мишенью олигомера по изобретению является экспрессируемая в печени микроРНК, например, миР-221, что можно использовать в лечении, например, гепатоцеллюлярной карциномы. Олигомер, мишенью которого является миР-221, может содержать последовательность нуклеиновых оснований, выбранную из группы, состоящей из: 5'-CAATGTAGC-3', 5'-AATGTAGC-3' и 5'-ATGTAGC-3' (SEQ ID NO 46-48) конкретные примеры олигомеров, мишенью которых является миР-221, включают 5'-CAATGTAGC-3', 5'-AATGTAGC-3' и 5'-ATGTAGC-3', где заглавные буквы обозначают (возможно, бета-D_окси) LNA, все связи являются фосфоротиоатными, а цитозины LNA возможно представляют собой 5-метилцитозин). Согласно базе данных miRBase, зрелая микроРНК-221 имеет последовательность 5' AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC 3' (SEQ ID NO 49).

Другие микроРНК мишени и соединения, специфически взаимодействующие с ними, которые можно использовать в качестве олигонуклеотидов по изобретению или последовательности смежных нуклеотидов или их части, изложены в WO 2007/112754, например, представлены в Таблице 2 и Примере 29 из WO 2007/112754, содержание которого включено путем ссылки. Другие микроРНК мишени и соединения, специфически взаимодействующие с ними, которые можно использовать в качестве олигонуклеотидов по изобретению или последовательности смежных нуклеотидов или их части, изложены в WO 2009/043353, например, представлены в Таблице 1 из WO 2009/043353, содержание которого включено путем ссылки.

В некоторых воплощениях, олигомер по изобретению способен понижать (например, уменьшать или устранять) экспрессию мишени (например, нуклеиновой кислоты-мишени). В этой связи олигомер по изобретению может влиять на ингибирование мишени. В некоторых воплощениях олигомеры по изобретению связывают нуклеиновую кислоту-мишень и ингибируют экспрессию по меньшей мере на 10% или 20% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии (таким, как уровень экспрессии в отсутствие олигомера(ов) или конъюгата(ов)). В некоторых воплощениях такие изменения наблюдаются при применении соединения по изобретению в концентрации от 0,04 до 25 нМ, например, от 0,8 до 20 нМ. В том же или другом воплощении ингибирование экспрессии составляет менее 100%, например, менее 98% ингибирования, менее 95% ингибирования, менее 90% ингибирования, менее 80% ингибирования, менее 70% ингибирования. Изменение уровня экспрессии можно оценивать по уровню белка, например, с помощью таких методов, как электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрий (ДСН-ПААГ) с последующим вестрен-блоттингом с использованием подходящих антител, направленных против белка-мишени. В альтернативном случае, изменение уровня экспрессии оценивают по уровню мРНК, например, с использованием нозерн-блоттинга или количественной полимеразной цепной р