Противокариесные композиции и пробиотики/пребиотики

Противокариесные композиции и пробиотики/пребиотики

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области здоровья человека; более конкретно к области состояния здоровья ротовой полости и зубов.

Уровень техники

Ротовая полость человека населена сотней видов бактерий, большинство из которых относится к видам-комменсалам, которые необходимы для поддержания равновесия в экосистеме полости рта. Однако некоторые из них играют ключевую роль в развитии заболеваний полости рта, в первую очередь, кариеса и заболеваний периодонта (1). Заболевания ротовой полости начинаются с роста бактериального зубного налета, биопленки, сформированной в результате накопления бактерий вместе с гликопротеинами из слюны человека и полисахаридами, секретируемыми микроорганизмами (2). Поддесневой налет, расположенный в поддесневом кармане с нейтральной или щелочной средой, обычно населен грамотрицательными анаэробами и служит местом развития гингивита и периодонтита. Наддесневой зубной налет формируется на поверхности зуба и включает кислотообразующие и ацидофильные бактерии, которые, в процессе ферментации потребляемых с пищей Сахаров, образуют кислоту и снижают рН. Если рН становится слишком кислым (обычно при величине менее чем 5,5), зубная эмаль деминерализуется и разрушается, и, следовательно, эти бактерии ответственны за кариес зубов, который считается наиболее распространенным инфекционным заболеванием в мире, поражающим свыше 80% человеческой популяции (3). Плохое состояние ротовой полости может быть связано с другими патологиями, такими как, например, среди прочего, язва желудка, рак желудка и сердечнососудистые заболевания.

Одна из главных причин, почему, на сегодняшний день, патогенные микроорганизмы ротовой полости до сих пор не искоренены, заключается в том, что изучение сообществ микроорганизмов, обитающих в ротовой полости, затруднено, поскольку, с одной стороны, сложность экосистемы (было обнаружено несколько сотен видов, с многочисленными уровнями взаимодействия) затрудняет обнаружение потенциальных патогенных видов (4); кроме того, нельзя идентифицировать единственный этиологический фактор, как в классических заболеваниях, согласно постулатам Коха. Этот факт был наглядно продемонстрирован при заболевании периодонта, при котором по меньшей мере 3 бактериальных вида, относящихся к очень разным таксономическим группам (так называемый «красный комплекс» периодонтальных патогенов), были связаны с развитием и прогрессированием заболеваний периодонта (5). С другой стороны, большая часть бактерий ротовой полости не поддается культивированию (6) и, следовательно, традиционные микробиологические способы дают неполную картину природных сообществ, населяющих зубной налет. Однако современное развитие метагеномных методов и методики секвенирования нового поколения позволяет проводить исследование сообщества бактерий в целом, анализируя общую ДНК сложных образцов микроорганизмов (метагеном), при котором нет необходимости культивировать сами бактерии.

В связи с этим, пионерские исследования в метагеномике были сосредоточены, в первую очередь, на экосистеме кишечника путем применения бессистемного (shot-gun) подхода, при котором ДНК клонируют в плазмиды небольшого размера, а затем проводят традиционное секвенирование по Сэнгеру (7, 8). Более поздние подходы включают секвенирование концов большеразмерных фосмид (9) и применение секвенирования с помощью технологии «Illumina», которая обеспечивает широкий охват коротких последовательностей (10). Исследования микробиоты ротовой полости, а также других мест обитания микроорганизмов в организме человека, таких как кожа, влагалище или дыхательные пути, были сосредоточены на секвенировании ампликонов рибосомальной РНК (11, 12). Эти исследования обеспечили существенное совершенствование наших знаний о сообществах этих бактерий по сравнению с предыдущими исследованиями, основанными на культивировании, но оценить разнообразие микроорганизмов мешают систематические ошибки при проведении ПЦР-амплификация (т.е. ПЦР только обнаруживает бактерии, которые наиболее похожи на те, что уже известны, на основе которых создавались используемые праймеры для амплификации, что дает неполную картину имеющегося разнообразия), систематическая ошибка при клонировании (большое число генов не клонируется, поскольку они токсичны для бактерии-хозяина и, следовательно, этот способ не позволяет исследовать весь генетический резервуар образца) и малая длина последовательности (последовательности в технологии «Illumina» имеют только 35-70 нуклеотидов, что во многих случаях делает невозможным надежное установление таксономической принадлежности или функциональной значимости), наряду с тем, что, как уже говорилось выше, большую часть бактерий ротовой полости невозможно культивировать.

Для решения вышеуказанных проблем, настоящее изобретение раскрывает получение метагенома бактериального зубного налета путем прямого секвенирования метагеномной ДНК, с помощью 454-пиросеквенирования, устраняя тем самым потенциальные системные ошибки, возникающие при клонировании и при применении методик ПЦР и, кроме того, обеспечивая доступ ко всему набору генов сообщества бактерий ротовой полости при разном состоянии здоровья, а также возможность анализировать, какие виды бактерий среди тех, которые были обнаружены в полученном метагеноме, могут быть связаны с хорошим состоянием ротовой полости, поскольку у тех индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса, была обнаружена бактериальная флора, отличающаяся от флоры индивидуумов, которые страдали или в настоящее время страдают от кариеса. С помощью полученного метагенома ротовой полости настоящего изобретения, существует возможность прямого выделения, культивирования и идентификации штаммов с противокариесной активностью из конгломерата бактерий в образце из ротовой полости; точнее говоря, из наддесневого налета индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса, т.е. те штаммы, которые способны ингибировать рост вызывающих кариес бактерий.

Другая стратегия, раскрытая в настоящем изобретении, заключается в получении метагеномной библиотеки фосмид (длинные ДНК-вставки, приблизительно, 35-45 Kb) из зубного налета индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса. Получение указанной библиотеки фосмид дает возможность выделить и идентифицировать биологически активные противокариесные пептиды, синтезируемые бактериями, находящимися в ротовой полости индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса. В связи с этим, учитывая, что, в существующем уровне техники, было показано, что Streptococcus mutans представляют собой основного возбудителя кариеса (13), не удивительно, что большинство стратегий по борьбе с этой болезнью были направлены против указанного микроорганизма. Эти стратегии включали, среди прочего, разработку вакцин с помощью известных поверхностных антигенов, стратегии пассивной иммунизации, которые могли бы нейтрализовать бактерии, коагрегацию S. mutans с пробиотическими штаммами и применение ингибирующих белков, специфических к S. mutans (14).

Другие различные стратегии, представляющие собой стратегии, раскрытые в разных патентных документах, предлагают применение разнообразных бактериальных штаммов, предпочтительно S. mutans, которые продуцирует кислоту в пониженных концентрациях (15), или применение одинаковых ресурсов, например, питательных веществ, для патогенных штаммов и непатогенных штаммов, постоянно обеспечивающее поставку непатогенных бактерий в высоких концентрациях, что приводит к замещению патогенных бактерий, при условии, что они используют тот же ресурс (16), или даже снижая прикрепление кариесогенных бактериальных штаммов к зубу (17). Напротив, биологически активные штаммы и пептиды, раскрытые в настоящем изобретении, обладают антибиотической активностью, предпочтительно противокариесной активностью, против своих собственных вызывающих кариес микроорганизмов. С другой стороны, патент WO 20040072093 (18) раскрывает ряд противомикробных средств, которые, в первую очередь, действуют против грамотрицательных микроорганизмов, но основные возбудители кариеса, S. mutans и S. sobrinus, представляют собой грамположительные микроорганизмы. Кроме того, изоляты S. mitis и S. oralis, продуцирующие противомикробные пептиды, раскрытые в WO 20040072093 (18), были выделены из горла пациентов с кистозным фиброзом, а не из ротовой полости людей, не имеющих кариеса, как в случае пептидов и/или штаммов изобретения. Подобным образом, терапевтическое применение указанных пептидов направлено на лечение заболеваний дыхательных путей, а не кариеса, как в случае биологически активных пептидов, раскрытых в настоящем изобретении.

В связи с этим, основные технические характеристики, которые отличают бактериальные штаммы, выделенные и раскрытые в настоящем изобретении, от остальных штаммов, раскрытых в существующем уровне техники, заключаются в том, что эти штаммы можно культивировать с помощью общепринятых микробиологических методик; что они обладают ингибирующим действием в отношении организмов, которые вызывают инфекционные заболевания ротовой полости, предпочтительно кариес, без необходимости применения к ним генетической модификации; и что их выделяют из индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса. Следовательно, как сами противокариесные бактерии, так и биологически активные противокариесные соединения, предпочтительно пептиды, раскрытые в настоящем изобретении, могут быть применены в качестве пробиотических и/или пребиотических композиций как таковые, или как часть различных фармацевтических композиций, применяемых для лечения инфекций ротовой полости, таких, например, как кариес, периодонтит, и т.п., или даже в качестве функциональных пищевых продуктов. Кроме того, настоящее изобретение также раскрывает способ предупреждения и/или лечения инфекционных заболеваний ротовой полости, предпочтительно кариеса, который включает введение фармацевтически эффективного количества по меньшей мере одного из штаммов и/или по меньшей мере одного из противомикробных соединений, предпочтительно описанных выше пептидов, или пробиотических или фармацевтических композиций или функциональных пищевых продуктов, которые включают по меньшей мере один из штаммов и/или по меньшей мере одно из соединений, предпочтительно пептиды изобретения.

Описание изобретения

Раскрытие изобретения

Трудности, имеющиеся в существующем уровне техники при идентификации бактериальных штаммов, которые непосредственно ингибируют рост патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания ротовой полости, таким образом, возникают из-за большого количества бактериальных видов в указанной полости; следовательно, трудность, связанная с выделением из всех из них штаммов, которые непосредственно ингибируют рост патогенных видов, многие из которых представляют собой некультивируемые виды, приводит к тому, что эту задачу непросто решить до сих пор.

Настоящее изобретение решает эту проблему путем создания метагенома ротовой полости индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса. Создание указанного метагенома, с помощью массивного секвенирования, предпочтительно пиросеквенирования, ДНК, присутствующей в образцах, взятых из ротовой полости указанных индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса, позволяет идентифицировать роды и виды бактерий, которые наиболее часто встречаются в популяции бактерий, находящихся в ротовой полости указанных индивидуумов. Такая количественная оценка частоты встречаемости каждой из бактерий в образце путем применения культивирования, клонирования или ПЦР-методик была до настоящего времени невозможна, поскольку эти методики позволяют идентифицировать только часть бактерий, и в соотношения тех из них, которые были идентифицированы, из-за самих методик были внесены ошибки (в первую очередь это было связано с предпочтительным культивированием, клонированием или амплификацией определенных видов, соответственно).

В принципе, изобретение было основано на человеческом организме, но оно может быть применено к любому высшему млекопитающему, в особенности, к домашним животным или домашнему скоту или даже к представителям дикой фауны. Было бы достаточно определить характерный метагеном каждого вида у индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса, взятого в качестве типичного заболевания ротовой полости. После того как бактериальные штаммы, наиболее часто встречающиеся в ротовой полости здоровых индивидуумов, будут идентифицированы по данным, полученным из метагенома, можно приступить к разработке следующей стадии настоящего изобретения, которая заключается в культивировании образцов, полученных из ротовой полости этих индивидуумов, в благоприятной среде культивирования и в благоприятных условиях, таких чтобы могли развиваться наиболее часто встречающиеся роды и виды, идентифицированные в метагеноме исследуемых видов млекопитающих.

Вторая альтернатива для решения вышеуказанной проблемы заключается в попытке выделить соединения, в особенности, активные пептиды, секретируемые, среди прочего, бактериальными штаммами, присутствующими в ротовой полости индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса, и которые непосредственно ингибируют рост вызывающих кариес видов. В настоящем изобретении, прямую ингибирующую способность определяют, как способность полностью ингибировать рост, создавая зоны ингибирования на высаженных газоном культурах, указанных патогенных видов, в результате антибиотической активности штаммов и соединений, не исключая того факта, что помимо указанного ингибирования, обусловленного их действием как антибиотиков, штаммы и соединения могут проявить свой антимикробный эффект, предпочтительно противокариесный эффект, препятствуя кариесогенному действию другими способами, такими как изменение рН, оптимального для роста указанных, вызывающих кариес штаммов, препятствуя их прикреплению к зубам и т.п.

С этой целью, изобретение снова начинают от образцов ротовой полости, взятых у здоровых индивидуумов, но, в этой альтернативе, оно сосредоточено не только на соединениях бактериального происхождения, которые могут быть секретированы, среди прочего, вышеуказанными изолированными штаммами. Кроме того, могут существовать соединения, секретируемые другими бактериальными штаммами, которые нельзя культивировать и, следовательно, они не могут быть изолированы с помощью предложенной выше стратегии. Наконец, помимо соединений бактериального происхождения из популяции бактериальных штаммов, населяющих ротовую полость, указанная полость также содержит соединения, секретируемые клетками самих млекопитающих, в особенности, клетками человека, на которых предпочтительно основано настоящее изобретение. Некоторые из этих соединений могут обладать прямым ингибирующим действием на рост вызывающих кариес микроорганизмов. В связи с этим, образцы, полученных из ротовой полости здоровых индивидуумов, лизируют, из них экстрагируют ДНК, с указанными фрагментами конструируют фосмиды и клонируют их в клетку-хозяина, которая может быть культивирована и исследована в культурах вызывающих кариес видов, для того, чтобы обнаружить, образуются ли зоны ингибирования роста вызывающих кариес патогенных видов.

Следует отметить, что, хотя выделенные ингибирующие штаммы и соединения были получены из образцов ротовой полости и были активны в отношении патогенных вызывающих кариес (кариесогенных) бактериальных видов, проявляя свою ингибирующую способность в отношении роста патогенных бактерий, которые предпочтительно населяют ротовую полость, в принципе, выделенные бактериальные штаммы и соединения могут быть обнаружены в других частях организма и могут вызывать другие заболевания или могут быть с ними связаны. В связи с этим, цель настоящего изобретения заключается в применении штаммов и соединений, выделенных в качестве лекарственных средств, в особенности, в качестве противомикробных средств и, более конкретно, в качестве антибактериальных средств.

Следовательно, настоящее изобретение раскрывает выделение поддающихся культивированию бактериальных штаммов и соединений, в первую очередь, биологически активных пептидов, способных ингибировать рост патогенных микроорганизмов, вовлеченных в возникновение заболеваний ротовой полости. Во всем настоящем изобретении, возникновение кариеса было принято в качестве типичного заболевания для заболеваний, характерных для ротовой полости, но изобретение может быть применено к любому инфекционному заболеванию, вызываемому патогенными микроорганизмами ротовой полости. В связи с этим, настоящее изобретение предпочтительно направлено на выделение бактериальных штаммов и соединений, в первую очередь, биологически активных пептидов, способных ингибировать рост патогенных микроорганизмов, в особенности, тех, которые вовлечены в возникновение кариеса.

Способ выделения подающихся культивированию бактериальных штаммов, способных противодействовать возникновению кариеса, основан на получении метагенома ротовой полости индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса, с целью определения, какой тип бактерий у указанных индивидуумов наиболее часто присутствует в их ротовой полости, на анализе, какой из этих типов связан с хорошим состоянием ротовой полости, в результате ингибирования роста вызывающих кариес бактерий. Указанный способ позволил выделить, охарактеризовать, культивировать и депонировать в Испанской коллекции типовых культур (СЕСТ) различные штаммы с противокариесным действием: СЕСТ 7746, СЕСТ 7747, СЕСТ 7773, СЕСТ 7774 и СЕСТ 7775. На основании анализа гомологии последовательностей, был сделан вывод, что четыре штамма, которые обладали противокариесным действием и которые были депонированы в СЕСТ, в особенности, штаммы СЕСТ 7746, 7747, 7773 и 7775, принадлежат к одному и тому же роду бактерий: Streptococcus; следовательно, в дополнение к их функциональным характеристикам (противокариесное действие) и способу их получения, указанные штаммы связаны структурным и таксономическим сходством, так как они принадлежат, как уже упоминалось ранее, к одному и тому же роду бактерий, Streptococcus.

С другой стороны, способ выделения и характеристики биологически активных противокариесных пептидов основан на получении метагеномной фосмидной библиотеки от индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса. Применяя указанный способ, можно охарактеризовать пептиды с противокариесной способностью, продуцируемые бактериями, обнаруженными у индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса, включая неподдающиеся культивированию бактерии, а также противомикробные соединения, например, дефензин-подобные соединения, синтезируемые самими индивидуумами. Указанные пептиды анализируют с целью установить их ингибирующее действие на рост вызывающих кариес бактерий, таких, например, как S. mutans или S. sobrinus.

Другой аспект настоящего изобретения раскрывает различные специфические подающиеся культивированию бактериальные штаммы, СЕСТ 7746, СЕСТ 7747, СЕСТ 7773, СЕСТ 7774 и СЕСТ 7775, выделенные из индивидуумов с отличным состоянием ротовой полости, которые никогда не страдали от кариеса, характеризуемые тем, что они обладают ингибирующим действием в отношении организмов, которые вызывают инфекционные заболевания ротовой полости, предпочтительно в отношении вызывающих кариес микроорганизмов. По метагеному бактерий, присутствующих в зубном налете индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса, роды и виды бактерий, которые чаще всего появляются у здоровых индивидуумов, которые никогда не страдали от кариеса, идентифицируют по гомологии с существующими библиотеками бактериальной ДНК. Бактерии, которые чаще всего появляются у индивидуумов без кариеса, и которые, как оказалось, отсутствуют или встречаются с очень низкой частотой у индивидуумов с кариесом, принадлежат к одному из следующих родов: Rothia, Globicatella, Johnsonella, Kingella, Cardiobacterium, Phocoenobacter, Mannheimia, Haemophilus, Neisseria, Streptococcus и Aggregatibacter; причем род Streptococcus наиболее распространен. В связи с этим, предпочтительные бактериальные штаммы изобретения представляют собой штаммы СЕСТ 7746, СЕСТ 7747, СЕСТ 7773 и СЕСТ 7775, все они принадлежат к роду Streptococcus.

Другой аспект, раскрытый в настоящем изобретении, описывает биологически активные соединения, предпочтительно пептиды, которые ингибируют рост организмов, вызывающих инфекционные заболевания ротовой полости, предпочтительно микроорганизмов, вызывающих кариес. В особенности, он описывает пептиды, кодируемые последовательностями ДНК, включенными в любую из следующих фосмидных вставок, и ингибирующие организмы, вызывающие инфекционные заболевания ротовой полости, предпочтительно микроорганизмы, вызывающие кариес: SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.

Конкретнее, пептиды, кодируемые последовательностями ДНК, включенными в фосмидные вставки, и ингибирующие организмы, которые вызывают инфекционные заболевания ротовой полости: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, характеризуются тем, что они имеют бактериальное происхождение и имеют характеристики, аналогичные характеристикам бактериоцинов. Подобным образом, пептиды, кодируемые последовательностями ДНК, включенными в фосмидные вставки, и ингибирующие организмы, которые вызывают инфекционные заболевания ротовой полости: SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, характеризуются тем, что они происходят от человека и имеют характеристики, аналогичные характеристикам дефензинов.

В частности, изобретение раскрывает 2 специфических пептида: SEQ ID NO: 8, противомикробный пептид человеческого происхождения с характеристиками, аналогичными характеристикам дефензинов; и SEQ ID NO: 9, пептид бактериального происхождения с характеристиками, аналогичными характеристикам бактериоцинов.

Кроме того, изобретение раскрывает твердые, порошкообразные (для прямого поглощения или в растворе) или пастообразные композиции для гигиены ротовой полости, такие как зубная паста, жевательная резинка, конфеты, батончики и т.п., или жидкие растворы для полоскания рта, такие как растворы для полоскания рта, сиропы, напитки и т.п., или пробиотические и/или пребиотические пищевые композиции, композицию, в которую включают или штаммы, и/или соединения, предпочтительно пептиды изобретения, которые ингибируют рост организмов, вызывающие инфекционные заболевания ротовой полости, предпочтительно микроорганизмы, вызывающие кариес. В предпочтительном воплощении изобретения, штаммы и/или пептиды изобретения добавляют к композициям, которые обладают противомикробным действием в отношении флоры ротовой полости и которые доступны для приобретения, такие как растворы для полоскания типа Listerine®, указанные растворы для полоскания, демонстрирующие усовершенствованное ингибирующее действие в отношении организмов, которые вызывают инфекционные заболевания ротовой полости, предпочтительно в отношении микроорганизмов, вызывающих кариес, если к их композиции добавляют штаммы и/или пептиды изобретения.

Предпочтительное воплощение изобретения представляет собой пробиотики/пребиотики или функциональные пищевые продукты, композиция, в которую включены штаммы и/или соединения, предпочтительно пептиды, изобретения, которые ингибируют рост организмов, вызывающие инфекционные заболевания ротовой полости, предпочтительно микроорганизмы, вызывающие кариес.Концепция пробиотиков или функциональных пищевых продуктов включает, не ограничиваясь этим: молочные продукты, такие как йогурты, например, соки, твердые пищевые продукты, такие как, например, конфеты, а также чаи, фиточаи и продукты парафармацевтики, такие как витаминные комплексы, продукты с пищевыми добавками и т.п.

Для целей настоящего изобретения, будут объяснены следующие термины:

Инфекционное заболевание ротовой полости: для целей настоящего изобретения, инфекционные заболевания ротовой полости предпочтительно представляют собой кариес, периодонтит, гингивит и неприятный запах изо рта.

Пробиотики: для целей настоящего изобретения, термин «пробиотик» означает применение живых микроорганизмов, которые добавляют к пищевым продуктам (молоку, йогуртам и т.п.), к пищевым добавкам (в форме капсул, таблеток, пилюль, порошка и т.п.) или к другому, и которые остаются активными и оказывают свое физиологическое воздействие на субъекта, который поглощает пищу, или аналогичный продукт, содержащий указанный пробиотик. Поступая в организм в достаточном количестве, они оказывают благотворное воздействие, в данном случае, на состояние здоровья ротовой полости.

Пребиотики: для целей настоящего изобретения, термин пребиотик означает применение веществ, которые добавляют к пищевым продуктам, жевательной резинке, пищевым добавкам или к другому, и которые оказывают влияние на композицию микробиоты ротовой полости, способствуя выживанию бактерий, которые полезны для состояния здоровья ротовой полости, и/или препятствуя выживанию патогенных бактерий.

Метагеном: представляет собой геномы всех бактерии, присутствующих в образце, индивидууме или экосистеме и т.п.

Микробиом: представляет собой набор микроорганизмов или бактерий, которые сосуществуют вместе с человеком.

Биологически активные противомикробные соединения: представляют собой соединения, такие как биологически активные пептиды, белки, антибиотики, пигменты и т.п., которые были обнаружены у позвоночных и беспозвоночных и которые действуют как природные антибиотики, представляя собой часть врожденного иммунного ответа. Некоторые из этих соединений, например, пептиды, такие как, например, среди прочего, дефензины и кателицидины, производятся людьми. Они активны в отношении бактерий, грибов и отдельных вирусов.

Бактериоцины: представляют собой биологически активные пептиды, секретируемые бактериями, которые обладают бактерицидными свойствами в отношении других видов, близко напоминающих продуцирующий штамм, или в отношении штаммов, которые филогенетически отдалены от продуцирующего штамма.

Фосмиды: кольцевые фрагменты ДНК, которые могут быть легко введены в клетки-хозяева, обычно бактериальные клетки, и которые транспортируют фрагменты бактериальной ДНК или ДНК человека.

Функциональные пищевые продукты: определяют как пищевые продукты, которые получают не только за их питательные характеристики, но также для выполнения специфической функции, такой как улучшение состояния здоровья или снижение риска заражения заболеваниями. В связи с этим, к ним добавляют биологически активные соединения, такие как минералы, витамины, жирные кислоты, бактерии с полезными эффектами, диетические волокна и антиоксиданты и т.п.

Поддающиеся культивированию бактериальные штаммы: считается, что поддающиеся культивированию бактериальные штаммы представляют собой те штаммы, которые растут в чистой культуре и сохраняют способность к стабильному росту в искусственной лабораторной среде культивирования в аэробных или в анаэробных условиях.

Описание чертежей

Фигура 1. А. Фотография чашки Петри, которая показывает первоначальный отбор клонов Е. coli, содержащих фосмиды из ДНК из зубного налета индивидуумов без кариеса, которые продуцируют области ингибирования роста на высеянной газоном культуре S. mutans. В. Фотография чашки Петри, которая показывает подтверждающий отбора клонов Е. coli, содержащих фосмиды из ДНК из зубного налета индивидуумов без кариеса, которые продуцируют области ингибирования роста на высеянной газоном культуре S. mutans.

Фигура 2. Кривые роста вызывающих кариес бактерий S. mutans (положительный контроль, без добавления ингибитора кариогенеза, представленные на графике в виде сплошной линии) в среде BHI (сердечно-мозговая вытяжка), и в среде BHI, обогащенной 100 мкл (пунктирная линия из точек), 150 мкл (линия с короткими штрихами), 200 мкл (линия с короткими штрихами и точками), 300 мкл (линия с длинными штрихами) или 400 мкл (линия с длинными штрихами и двойными точками) 3-10-кДа фракции концентрированного супернатанта, полученного, соответственно, из 5, 2,25, 3,0, 4,5 и 6 мл культур клеток, несущих фосмиду S12E, содержащую противомикробный бактериоцин-подобный пептид изобретения бактериального происхождения. Данные, регистрируемые каждые полчаса в течение 19-ти часов, представляют собой среднее из 3-х экспериментов. На оси Х графика показано время, выраженное в часах, и на оси Y показана оптическая плотность (OD) бактериальных культур.

Фигура 3. Кривые роста вызывающих кариес бактерий S. mutans в среде BHI (сплошная линия, положительный контроль без добавления ингибитора кариогенеза) и в среде BHI с 50 мкл (пунктирная линия из штрихов) и 100 мкл (пунктирная линия из точек) 0-3-кДа фракции концентрированного супернатанта, полученного, соответственно, из 2 и 4 мл культур клеток, несущих фосмиду Т5А, содержащую противомикробный дефензин-подобный пептид изобретения человеческого происхождения. Данные, регистрируемые каждые полчаса в течение 12-х часов, представляют собой среднее из 3-х экспериментов. На оси Х графика показано время, выраженное в часах, и на оси Y показана оптическая плотность (OD) бактериальных культур.

Фигура 4. Кривые роста вызывающих кариес бактерий S. mutans в присутствии Listerine® и S12E, ингибитора бактериального происхождения. Данные регистрировали в течение 19-ти часов при температуре, равной 37°C, в культуральной среде BHI и представляли как среднее из 3-х экспериментов. Сплошная линия показывает негативный контроль, без бактерий. Линия с короткими штрихами показывает положительный контроль, рост S. mutans в отсутствии Listerine® и ингибитора S12E. Линия с длинными штрихами показывает рост S. mutans в присутствии 100 мкл Listerine®. Пунктирная линия из точек показывает рост S. mutans в присутствии 100 мкл ингибитора S12E. Линия с короткими штрихами и точками показывает рост S. mutans в присутствии 100 мкл Listerine® + 100 мкл ингибитора S12E. На оси Х графика показано время, выраженное в часах, и на оси Y показана оптическая плотность (OD) бактериальных культур.

Фигура 5. Кривые роста вызывающих кариес бактерий S. mutans в присутствии ингибитора S12E (противомикробный бактериоцин-подобный пептид изобретения бактериального происхождения), синтезированного химическим способом в лаборатории и ресуспендированного в 0,1%-ном ТСА. Результаты показывают рост S. mutans, измеренный как поглощение при 600 нм в течение 30-ти минут на протяжении 30-ти часов при температуре, равной 37°C, в 100 мкл культуральной среды BHI, в трех независимых экспериментах. Сплошная линия показывает негативный контроль, без бактерий. Линия с черными квадратами показывает рост S. mutans в культуральной среде BHI. Пунктирная линия из точек показывает положительный контроль, рост S. mutans в культуральной среде BHI в присутствии 10 мкл 0,1%-ного ТСА. Линия с короткими штрихами и точками показывает рост S. mutans в культуральной среде BHI в присутствии 0,3 мг пептида S12E ресуспендированного в 10 мкл 0,1%-ного ТСА. Линия с короткими штрихами показывает рост S. mutans в культуральной среде BHI в присутствии 0,03 мг пептида S12E, ресуспендированного в 10 мкл 0,1%-ного ТСА. На оси Х графика показано время, выраженное в часах, и на оси Y показана оптическая плотность (OD) бактериальных культур.

Фигура 6. Кривые роста вызывающих кариес бактерий S. mutans (А) и S. sobrinus (В) в присутствии ингибитора S12E (противомикробный бактериоцин-подобный пептид изобретения бактериального происхождения), синтезированного химическим способом в лаборатории, и ресуспендированного в воде высшей степени очистки. Результаты показывают рост S. mutans, измеренный как поглощение при 600 нм в течение 30-ти минут на протяжении 48-ми часов при температуре, равной 37°C, в 200 мкл культуральной среды BHI, и представлены как среднее из трех независимых экспериментов. На обоих графиках, графике А и графике В, сплошными линиями показан негативный контроль, без бактерий;

пунктирными линиями из точек показан рост S. mutans (А) или S. sobrinus (В) в культуральной среде BHI. Линия с короткими штрихами показывает положительный контроль, рост S. mutans (А) или S. sobrinus (В) в культуральной среде BHI в присутствии воды. Линия с черными квадратами показывает рост S. mutans (А) или S. sobrinus (В) в культуральной среде BHI в присутствии 0,23 мг пептида изобретения S12E, ресуспендированного в воде высшей степени очистки. Линия с черными ромбами показывает рост S. mutans (А) или S. sobrinus (В) в культуральной среде BHI в присутствии 0,047 мг пептида S12E изобретения, ресуспендированного в воде высшей степени очистки. Линия с черными треугольниками показывает рост S. mutans (А) или S. sobrinus (В) в культуральной среде BHI в присутствии 0,094 мг пептида S12E изобретения, ресуспендированного в воде высшей степени очистки. На оси Х графика показано время, выраженное в часах, и на оси Y показана оптическая плотность (OD) бактериальных культур.

Фигура 7. Кривые роста вызывающих кариес бактерий S. mutans в присутствии 4 мкг, 40 мкг и 80 мкг ингибитора изобретения T5A, синтезированного химическим способом в лаборатории и ресуспендированного в воде высшей степени очистки. Результаты показывают рост S. mutans, измеренный как поглощение при 600 нм, в течение 30-ти минут на протяжении 44-х часов при температуре, равной 37°C в 200 мкл культуральной среды BHI, и представлены как среднее из трех независимых экспериментов. Сплошная линия показывает негативный контроль, без клеток. Линия с короткими штрихами показывает рост S. mutans в культуральной среде BHI (положительный контроль) с водой высшей степени очистки. Линия с черными квадратами показывает рост S. mutans в культуральной среде BHI в присутствии 1 мкл пептида изобретения T5A (противомикробный дефензин-подобный пептид, происходящий от человека). Линия с черными ромбами показывает рост S. mutans в культуральной среде BHI в присутствии 10 мкл пептида изобретения T5A. Линия с черными треугольниками показывает рост S. mutans в культуральной среде BHI в присутствии 20 мкл пептида изобретения T5A. На оси Х графика показано время, выраженное в часах, и на оси Y показана оптическая плотность (OD) бактериальных культур.

Фигура 8. Кривые роста вызывающих кариес бактерий S. mutans в жидкой культуральной среде в присутствии супернатантов, сконцентрированных в 10 раз и выделенных в зависимости от их молекулярной массы, произведенных культурами бактериальных клеток Е. coli, несущих фосмиду W4D, которая включает полинуклеотидную последовательность SEQ IDNO: 13, кодирующую противомикробный дефензин-подобный пептид изобретения человеческого происхождения. Данные, регистрируемые каждые полчаса в течение 24-х часов, представляют собой среднее из 3-х экспериментов. В качестве контроля, на графике показана кривая роста S. mutans в присутствии сконцентрированного супернатанта нетрансформированной бактериальной культуры Е. coli epi300. На оси Х графика показано время, выраженное в часах, и на оси Y показана оптическая плотность (OD) бактериальных культур.

Фигура 9. Кривые роста вызывающих кариес бактерий S. mutans в жидкой культуральной среде в присутствии супернатантов, сконцентрированных в 10 раз и выделенных в зависимости от их молекулярной массы, произведенных культурами бактериальных клеток Е. coli, несущих фосмиду T5H, которая включает полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14, кодирующую противомикробный дефензин-подобный пептид изобретения человеческого происхождения. Данные, регистрируемые каждые полчаса в течение 24-х часов, представляют собой среднее из 3-х экспериментов. В качестве контроля, на графике показана кривая роста S. mutans в присутствии сконцентрированного супернатанта нетрансформированной бактериальной культуры Е. coli epi300. На оси Х графика показано время, выраженное в часах, и на оси Y показана оптическая плотность (OD) бактериальных культур.

Фигура 10. Кривые роста вызывающих кариес бактерий S. mutans в жидкой культуральной среде в присутствии супернатантов, сконцентрированных в 10 раз и выделенных в зависимости от их молекулярной массы, произведенных культурами бактериальных клеток Е. coli, несущих фосмиду A5D11, которая включает полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6, кодирующую противомикробный дефензин-подобный пептид изобретения человеческого происхождения. Данные, регистрируемые каждые полчаса в течение 24-х час