Варианты субтилаз

Варианты субтилаз

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым вариантам субтилаз, демонстрирующим изменение одного или нескольких свойств, включающих моющую эффективность, термическую устойчивость, устойчивость при хранении или каталитическую активность, по сравнению с исходной субтилазой. Варианты по настоящему изобретению подходят для применения, например, в чистящих или моющих композициях, таких как стиральные порошки и составы для мытья посуды, включая составы для автоматического мытья посуды. Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным последовательностям ДНК, кодирующим варианты субтилаз, векторам экспрессии, клеткам-хозяевам, а также к способам получения и применения вариантов по настоящему изобретению. Помимо этого, настоящее изобретение относится к чистящим и моющим композициям, содержащим варианты по настоящему изобретению.

Предпосылки создания изобретения

В индустрии моющих средств уже в течение 30 лет практикуется включение ферментов в моющие композиции. Ферменты, применяемые в таких композициях, включают протеазы, липазы, амилазы, целлюлазы, маннозидазы, а также другие ферменты или их смеси. Наиболее важными с коммерческой точки зрения ферментами являются протеазы.

Все больше число протеаз, находящих коммерческое применение, представляет собой специально разработанные варианты природных протеаз дикого типа, например, DURAZIM(R), RELASE^®, ALCALASE^®, SAVINASE^®, PRIMASE^®, DURALASE^®, ESPERASE^®, OVOZYME^®, RELASE(R) и KANNASE^® (Novozymes A/S), AXAPEM(R) (Gist-Brocades N.V.), PURAFECT(R) (Genencor International, Inc.), MAXATASE^TM, MAXACAL^TM, MAXAPEM^TM, PROPERASE^TM, PURAFECT^TM, PURAFECT OxP^TM, FN2^TM, FN3^TM и FN4^TM (Genencor International, Inc.).

Далее, в данной области описан ряд вариантов, например, в WO 04/041979 (NOVOZYMES A/S) описаны варианты субтилазы, демонстрирующие измененные свойства, по сравнению с исходной субтилазой, например, моющую эффективность, термическую устойчивость, устойчивость при хранении или каталитическую активность. Эти варианты подходят для применения, например, в чистящих или моющих композициях.

Был описан ряд подходящих для применения вариантов протеаз, многие из которых обладают улучшенной активностью, стабильностью и растворимостью в различных моющих средствах. Однако разнообразные факторы делают желательным дальнейшее улучшение протеаз. Условия удаления загрязнений продолжают меняться, например, что касается температуры и pH, и многие загрязнения по-прежнему трудно удалить полностью в стандартных условиях. Таким образом, несмотря на интенсивные исследования по разработке протеаз, сохраняется потребность в новых улучшенных протеазах.

В силу этого, задача настоящего изобретения заключалась в разработке вариантов субтилизина с улучшенными свойствами по сравнению с исходным ферментом.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к вариантам исходных субтилизинов, которые могут представлять собой, например, субтилизин, такой как показано в SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов варианты по настоящему изобретению имеют, по меньшей мере, одно улучшенное свойство по сравнению с исходным субтилизином, например, представленным в SEQ ID NO:1, где указанные улучшенные свойства могут представлять собой, например, улучшенную моющую эффективность, например, улучшенную способность удаления пятен, улучшенную моющую эффективность при мойке твердых поверхностей, например, улучшенную эффективность мытья посуды, улучшенную стабильность, например, устойчивость при хранении или термическую устойчивость, или улучшенную каталитическую активность. В одном из аспектов настоящего изобретения варианты субтилизина обладают улучшенной способностью удалять остатки яиц, например, улучшенной способностью удалять вареные яичные желтки с твердых поверхностей.

Так, например, один из аспектов настоящего изобретения относится к варианту исходного субтилизина, включающему замены 9{R,K,H}, 15{G,A,S,T,M}, 68{G,A,S,T,M}, 218{D,S,G,V} и 245{R,K,H}, где данный вариант дополнительно включает, по меньшей мере, одну из следующих модификаций: 61{D,E}, 62{D,E}, 76{D,E}, *97aG, 98{G,S}, 99G, 101G, 120{V,Q,D}, 131{T,S}, 137H, 194P, 228V, 230V, 261D, где указанные положения соответствуют положениям в последовательности зрелого полипептида SEQ ID NO:2 [BPN’].

В одном из аспектов вариант по настоящему изобретению дополнительно включает замену G61E.

В одном из аспектов вариант по настоящему изобретению дополнительно включает замену A98S.

В одном из аспектов вариант по настоящему изобретению дополнительно включает замену S99G.

В одном из аспектов вариант по настоящему изобретению включает следующие замены S9R, A15T, G61E, V68A, A98S, S99G, N218D и Q245R.

В одном из аспектов исходный субтилизин является полипептидом, включающим аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80% идентичность с последовательностью SEQ ID NO:1.

В другом аспекте вариант по настоящему изобретению имеет одно или несколько улучшенных свойств по сравнению с исходным субтилизином, где улучшенные свойства включают моющую способность, стабильность, каталитическую активность и эффективность мытья посуды.

В следующем аспекте улучшенные свойства включают улучшенную моющую способность, например, улучшенную способность к удалению загрязнений, улучшенную эффективность при мытье твердых поверхностей, например, мытье посуды, улучшенную стабильность, например, устойчивость при хранении или термическую устойчивость, или улучшенную каталитическую активность. В одном из аспектов настоящего изобретения варианты имеют улучшенную способность к удалению остатков яиц, например, улучшенную способность к удалению остатков вареных яичных желтков с твердых поверхностей.

Другие аспекты изобретения относятся к способу получения варианта путем введения в исходный субтилизин следующих замен:

i. замену остатка в положении 9 остатками {R, K, H};

ii. замену остатка в положении 15 остатками {G, A, S, T, M};

iii. замену остатка в положении 68 остатками {G, A, S, T, M};

iv. замену остатка в положении 245 остатками {R, K, H}; и

v. замену остатка в положении 218 остатками {D, S, G или V},

и одной или нескольких из следующих модификаций: замену остатка в положении 61 остатками {D, E}, замену остатка в положении 62 остатками {D, E}, замену остатка в положении 76 остатками {D, E}, вставку остатка G в положение 97, замену остатка в положении 98 остатками {G, S}, замену остатка в положении 99 остатком G, замену остатка в положении 101 остатком G, замену остатка в положении 120 остатками {V, Q, D}, замену остатка в положении 131 остатками {T, S}, замену остатка в положении 137 остатком H, замену остатка в положении 194 остатком P, замену остатка в положении 228 остатком V, замену остатка в положении 230 остатком V, замену остатка в положении 261 остатком D, где указанные положения соответствуют положениям в последовательности зрелого полипептида SEQ ID NO:2 [BPN’].

Другой аспект настоящего изобретения относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим варианты субтилизинов, а также конструктам нуклеиновых кислот, векторам и клеткам-хозяевам, включающим эти полинуклеотиды.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к чистящим или моющим композициям, предпочтительно композициям для стирки или мытья посуды, включающим варианты по настоящему изобретению. Один из аспектов настоящего изобретения относится к применению данных вариантов в моющих средствах, например, для стирки или мытья посуды.

Подробное описание изобретения

Определения

Протеолитическая активность. Данный термин определяется в настоящем описании, как способность расщеплять протеины (белки) в ходе протеолиза, который представляет собой катаболизм белков, происходящий в результате гидролиза пептидных связей, соединяющих аминокислотные остатки друг с другом в полипептидную цепь с образованием белка. Таким образом, под действием протеаз, обладающих протеолитической активностью, белки расщепляются на аминокислоты. Термины «протеазная активность» или «протеолитическая активность» являются взаимозаменяемыми. См. также приведенное ниже по тексту определение «протеаз».

Вариант. Термин «вариант» определяется в настоящем описании, как полипептид, включающий изменение или модификацию(и), например, замену, вставку и/или делецию одного или более (нескольких) аминокислотных остатков в одном или более (нескольких) конкретных положениях. Измененные полинуклеотиды получают в результате вмешательства человека путем изменения полинуклеотидной последовательности. Эти варианты могут представлять собой вариант субтилизина, т.е. вариант субтилизина, имеющего, например, полинуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO:1, или гомологичную ей последовательность. Термины «вариант протеазы» или «вариант субтилизина» являются взаимозаменяемыми. Варианты по настоящему изобретению предпочтительно обладают протеазной активностью или протеолитической активностью. Термины «один или более», «один или несколько» и «по меньшей мере, один» являются взаимозаменяемыми.

Модификация(и). Считается, что термин «модификация(и)» в настоящем описании включает химическую модификацию субтилазы, а также генетические операции с ДНК, кодирующей исходную протеазу. Модификация(и) может представлять собой замену(ы) боковой аминокислотной цепи(ей), замену(ы), делецию(и) и/или вставку(и) в представляющем интерес положении(ях) аминокислотной последовательности.

Фермент дикого типа. Термин вариант протеазы «дикого типа» означает вариант протеазы, экспрессируемой встречающимся в природе микроорганизмом, например, встречающимися в природе бактериями, дрожжами или мицеллярными грибами, т.е. полинуклеотид, кодирующий данный вариант протеазы, не был получен в результате человеческого вмешательства путем изменения полинуклеотидной последовательности.

Исходный фермент. Термин «исходный» вариант протеазы, например, «исходный» вариант субтилизина, в настоящем описании означает протеазу, например, субтилизин, в которой осуществляется модификация, например, замена(ы), вставка(и), делеция(и) и/или усечение(я), для получения вариантов фермента по настоящему изобретению. Данный термин относится также к полипептиду, с которым сравнивают или совмещают его вариант. Исходный вариант может быть природным полипептидом (дикого типа) или вариантом. Например, исходный полипептид может являться вариантом природного полипептида, аминокислотная последовательность которого подверглась модификации или изменению. Исходный полипептид может также являться аллельным вариантом, который представляет собой полипептид, закодированный любой из двух или нескольких альтернативных форм гена, занимающих один и тот же локус на хромосоме.

Выделенный вариант или полипептид. Термины «выделенный вариант» или «выделенный полипептид» в настоящем описании относятся к варианту или полипептиду, который выделен из своего источника. В одном из аспектов данный вариант или полипептид имеет, по меньшей мере, 1% чистоту, предпочтительно, по меньшей мере, 5% чистоту, более предпочтительно, по меньшей мере, 10% чистоту, более предпочтительно, по меньшей мере, 20% чистоту, более предпочтительно, по меньшей мере, 40% чистоту, более предпочтительно, по меньшей мере, 60% чистоту, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80% чистоту и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 90% чистоту по данным SDS-PAGE.

По существу чистый вариант или полипептид. Термин «по существу чистый вариант» или «по существу чистый полипептид» в настоящем описании означают полипептидный препарат, который содержит не более 10%, предпочтительно не более 8%, более предпочтительно, не более 6%, более предпочтительно, не более 5%, более предпочтительно, не более 4%, более предпочтительно, не более 3%, еще более предпочтительно не более 2%, наиболее предпочтительно, не более 1%, и еще более предпочтительно, не более 0,5% по массе других полипептидных материалов, с которыми он связан нативно или рекомбинантно. Следовательно, предпочтительно, чтобы по существу чистый вариант или полипептид имел чистоту не менее 92%, предпочтительно, не менее 94%, более предпочтительно, не менее 95%, более предпочтительно, не менее 96%, более предпочтительно, не менее 97%, более предпочтительно, не менее 98%, еще более предпочтительно, не менее 99%, наиболее предпочтительно не менее 99,5% и еще более предпочтительно, не менее 100% по массе от общей массы полипептидного материала, присутствующего в препарате. Варианты и полипептиды по настоящему изобретению предпочтительно находятся по существу в чистой форме. Этого можно добиться, например, получая вариант или полипептид с помощью хорошо известных рекомбинантных методик или классическими способами очистки.

Зрелый полипептид. Термин «зрелый полипептид» определяется в настоящем описании, как полипептид, обладающий активностью варианта протеазы, которая имеется у его конечной формы, после трансляции или любых посттрансляционных модификаций, например, N-концевого процессинга, C-концевого укорачивания, гликозилирования, фосфорилирования и т.д. В одном из аспектов зрелый полипептид представляет собой полипептид, соответствующий SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. Для предсказания зрелого полипептида можно применять программу SignallP3.0.

Последовательность, кодирующая зрелый полипептид. Термин «последовательность, кодирующая зрелый полипептид» определяется в настоящем описании, как нуклеотидная последовательность, которая кодирует зрелый полипептид, обладающий активностью варианта протеазы. В одном из аспектов последовательность, кодирующая зрелый полипептид, представляет собой нуклеотиды, кодирующие SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4.

Идентичность. Сходство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром «идентичность».

Для целей настоящего изобретения, степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), реализованного в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16:276-277; http://emboss.org), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Используют следующие значения необязательных параметров: “gap open penalty” (штраф за делецию) устанавливают равным 10, “gap extension penalty” (штраф за продолжение делеции) устанавливают равным 0,5, и используют матрицу замен EBLOSUM62 (EMBOSS версия BLOSUM62). Результат работы программы Needle, именуемый “longest identity” («идентичность наибольшей протяженности») (полученный при включенной опции “Nobrief”), используют для определения идентичности в процентах, и вычисляют по следующей формуле:

(число идентичных остатков×100)/(длина выравнивания-общее количество делеций в выравнивании)

Для целей настоящего изобретения, степень идентичности между двумя дезоксирибонуклеотидными последовательностями определяют с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, см. выше), реализованного в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, см. выше; http://emboss.org), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Используют следующие значения необязательных параметров: “gap open penalty” (штраф за делецию) устанавливают равным 10, “gap extension penalty” (штраф за продолжение делеции) устанавливают на 0,5, и используют матрицу замен EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4). Результат работы программы Needle, именуемый “longest identity” («идентичность наибольшей протяженности») (полученный при включенной опции “nobrief”), используют для определения идентичности в процентах, и вычисляют по следующей формуле:

(число идентичных дезоксирибонуклеотидов×100)/(длина выравнивания-общее количество делеций в выравнивании)

Гомологичная последовательность. Термин «гомологичная последовательность» определяется в настоящем описании, как ожидаемый полипептид, который имеет значение E (или величину “expectancy score” (математического ожидания)) менее 0,001 в поисковой программе tfasty (Pearson, W.R., 1999 in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener and S.A. Krawetz, ed., pp.185-219) при сравнении с вариантом протеазы CBS 100236 Micrododhium nivale.

Полипептидный фрагмент. Термин «полипептидный фрагмент» определяется в настоящем описании, как полипептид, включающий один или более (несколько) аминокислотных остатков, удаленных с амино- и/или карбокси-конца зрелого полипептида; или гомологичная ему последовательность; где указанный фрагмент обладает активностью варианта протеазы.

Подпоследовательность. Термин «подпоследовательность» в настоящем описании определяется, как полинуклеотидная последовательность, включающая один или более (несколько) нуклеотидов, удаленных с 5’- и/или 3’-конца последовательности, кодирующей зрелый полипептид; или последовательность, гомологичную ей; где указанная последовательность кодирует полипептидный фрагмент, обладающий активностью варианта протеазы.

Аллельный вариант. Термин «аллельный вариант» в настоящем описании означает любую из двух или нескольких альтернативных форм гена, занимающих один и тот же локус на хромосоме. Аллельные варианты возникают естественным путем в результате мутаций и могут приводить к полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть «молчащими» (не приводить к изменениям в кодируемом полипептиде), или они могут кодировать полипептиды, имеющие измененные аминокислотные последовательности. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, закодированный аллельным вариантом гена.

Выделенный полинуклеотид. Термин «выделенный полинуклеотид» в настоящем описании относится к полинуклеотиду, который выделен из своего источника. В одном из аспектов выделенный полинуклеотид имеет, по меньшей мере, 1% чистоту, предпочтительно, по меньшей мере, 5% чистоту, более предпочтительно, по меньшей мере, 10% чистоту, более предпочтительно, по меньшей мере, 20% чистоту, более предпочтительно, по меньшей мере, 40% чистоту, более предпочтительно, по меньшей мере, 60% чистоту, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 80% чистоту, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 90% чистоту, и даже еще более предпочтительно, 95% чистоту по данным электрофореза в агарозном геле.

По существу чистый полинуклеотид. Термин «по существу чистый полинуклеотид» в настоящем описании относится к полинуклеотидному препарату, свободному от других посторонних или нежелательных нуклеотидов, и находящемуся в форме, подходящей для применения в генно-инженерных системах выработки полипептидов. Так, например, по существу чистый полинуклеотид содержит не более 10%, предпочтительно не более 8%, более предпочтительно, не более 6%, более предпочтительно, не более 5%, более предпочтительно, не более 4%, более предпочтительно, не более 3%, еще более предпочтительно не более 2%, наиболее предпочтительно, не более 1%, и еще более предпочтительно, не более 0,5% по массе других полинуклеотидных материалов, с которыми он связан нативно или рекомбинантно. Тем не менее, по существу чистый нуклеотид может включать встречающиеся в природном продукте нетранслируемые 5’- и 3’-области, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительно, чтобы по существу чистый полинуклеотид имел чистоту по массе не менее 90%, предпочтительно, не менее 92%, более предпочтительно, не менее 94%, более предпочтительно, не менее 95%, более предпочтительно, не менее 96%, более предпочтительно, не менее 97%, еще более предпочтительно, не менее 98%, наиболее предпочтительно, не менее 99%, и даже еще более предпочтительно не менее 99,5%. Полинуклеотиды по настоящему изобретению предпочтительно находятся по существу в чистой форме, т.е. полинуклеотидный препарат в основном свободен от других полинуклеотидных материалов, с которыми он связан нативно или рекомбинантно. Полинуклеотиды могут иметь геномное, кДНК, РНК, полусинтетическое, синтетическое или комбинированное происхождение.

Кодирующая последовательность. В настоящем описании термин «кодирующая последовательность» означает полинуклеотид, который непосредственно определяет аминокислотную последовательность полипептидного продукта. Границы кодирующей последовательности, как правило, определяются открытой рамкой считывания, которая обычно начинается инициирующим кодоном ATG или альтернативными инициирующими кодонами, например, GTG и TTG, и заканчивается терминирующим кодонами, например, TAA, TAG и TGA. Указанная кодирующая последовательность может представлять собой ДНК, кДНК, синтетический или рекомбинантный полинуклеотид.

кДНК. Термин «кДНК» в настоящем описании означает молекулу ДНК, которую можно получить обратной транскрипцией из зрелой, сплайсированной молекулы мРНК, полученной из эукариотической клетки. кДНК не содержат интронных последовательностей, которые обычно присутствуют в соответствующей геномной ДНК. Исходный первичный транскрипт РНК является предшественником мРНК и в результате ряда промежуточных стадий превращается в зрелую сплайсированную мРНК. Эти стадии включают удаление интронных последовательностей в ходе процесса, называемого сплайсингом. Поэтому кДНК, образующаяся из мРНК, не содержит каких-либо интронных последовательностей.

Конструкт нуклеиновой кислоты. Термин «конструкт нуклеиновой кислоты» в настоящем описании относится к одно- или двухцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, которая выделена из природного гена или подверглась такой модификации, что она содержит фрагменты нуклеиновых кислот, расположенные в таком порядке, который, в ином случае, не мог бы существовать в природе, или является синтетическим. Термин «конструкт нуклеиновой кислоты» является синонимом термину «кассета экспрессии», если конструкт нуклеиновой кислоты содержит управляющие последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности по настоящему изобретению.

Управляющие последовательности. Термин «управляющие последовательности» в настоящем описании включает все компоненты, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид по настоящему изобретению. Каждая из управляющих последовательностей может являться нативной или чужеродной по отношению к нуклеотиду, кодирующему полипептид, кроме того они могут быть нативными или чужеродными по отношению друг к другу. Указанные управляющие последовательности включают, но, не ограничиваясь ими, лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. В минимальном варианте управляющие последовательности включают промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. Управляющие последовательности могут быть снабжены линкерами, облегчающими сшивание управляющих последовательностей с кодирующими участками полинуклеотида, кодирующего полипептид, с целью введения определенных сайтов рестрикции.

Функционально связанный. Термин «функционально связанный» в настоящем описании означает конфигурацию, в которой управляющая последовательность находится в надлежащем положении по отношению к кодирующей последовательности полинуклеотидной последовательности, так что управляющая последовательность управляет экспрессией кодирующей последовательности полипептида.

Экспрессия. Термин «экспрессия» включает любые стадии, вовлеченные в выработку полипептида, включающие, но, не ограничиваясь ими, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Вектор экспрессии. Термин «вектор экспрессии» в настоящем описании относится к линейной или кольцевой молекуле ДНК, которая включает полинуклеотид, кодирующий полипептид по настоящему изобретению, и функционально связана с дополнительными нуклеотидами, которые обеспечивают экспрессию кодирующего полинуклеотида.

Клетка-хозяин. Термин «клетка-хозяин» в настоящем описании включает любые типы клеток, которые восприимчивы к трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п. конструктом нуклеиновой кислоты или вектором экспрессии, включающим полинуклеотид по настоящему изобретению. Термин «клетка-хозяин» охватывает любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке вследствие мутаций, происходивших при репликации.

Улучшенное свойство. Термин «улучшенное свойство» определяется в настоящем описании, как характеристика, относящаяся к варианту по настоящему изобретению, которая улучшена по сравнению с соответствующей характеристикой исходного варианта протеазы. Такие улучшенные свойства включают, но, не ограничиваясь перечисленным, моющую эффективность, например, эффективность в отношении загрязнений, например, загрязнений, содержащих белок, эффективность удаления загрязнений, например, удаления остатков яиц, устойчивость, например, термическую устойчивость, устойчивость в кислой или щелочной среде, или устойчивость в порошке, жидких или гелевых моющих композициях или композициях для мытья посуды, измененный профиль зависимости активности от температуры, зависимости активности от pH, специфичности к субстратам, специфичности к продуктам, и химическую стабильность. В одном из вариантов осуществления улучшенные свойства включают улучшенную эффективность стирки или мытья посуды, например, удаления белковых загрязнений, таких как остатки яиц.

Моющая эффективность. В контексте настоящего описания термин «моющая эффективность» используется в отношении способности фермента удалять белковые или органические загрязнения, присутствующие на объекте, который предполагается очистить во время, например, мытья или чистки твердой поверхности. Улучшение моющей эффективности может быть количественно охарактеризовано путем вычисления величины, так называемой интенсивности (Int), определенной в примере 3 настоящего описания. См. также тест на моющую эффективность в примере 3 настоящего описания.

Улучшенная моющая эффективность. Термин «улучшенная моющая эффективность» в настоящем описании относится к варианту фермента, демонстрирующему изменение моющей эффективности варианта протеазы по отношению к моющей эффективности исходного варианта протеазы, например, за счет увеличения эффективности удаления загрязнений. Термин «моющая эффективность» включает моющую эффективность при стирке, а также, например, при мытье посуды.

Очистка твердых поверхностей. Данный термин включает «мытье посуды» и относится к очистке твердых объектов, например, обычных объектов мытья посуды, которые включают, но, не ограничиваясь ими, тарелки, чашки, стаканы, миски и столовые приборы, например, ложки, ножи, вилки, сервировочный инвентарь, керамическую посуду, пластиковую посуду, металлическую посуду, фарфоровые изделия, стеклянную посуду и акриловые изделия.

Композиция для мытья посуды. Термин «композиция для мытья посуды» относится ко всем формам композиций для очистки твердых поверхностей. Настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным типом композиции для мытья посуды или каким-либо конкретным моющим компонентом.

Протеазы

Ферменты, расщепляющие амидные связи в белковых субстратах, относят к протеазам или (что имеет эквивалентное значение) к пептидазам (см. Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3).

Нумерация положений аминокислот/остатков

Если не имеется каких-либо других указаний, нумерация аминокислотных остатков, используемая в настоящем описании, соответствует нумерации последовательности субтилазы BPN’ (BASBPN). Для более подробного ознакомления с последовательностью BPN’, см. SEQ ID NO:2 или Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737.

Сериновые протеазы

Сериновая протеаза представляет собой фермент, катализирующий гидролиз пептидных связей, в котором ключевую роль в активном центре играют остатки серина (White, Handler and Smith, 1973 “Principles of Biochemistry”, Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp.271-272).

Бактериальные сериновые протеазы имеют молекулярные массы в диапазоне от 20000 до 45000 Дальтон. Их активность ингибируется диизопропилфторфосфатом. Они гидролизуют простые концевые сложноэфирные группы и похожи по своей активности на химотрипсин эукариотов, который также является сериновой протеазой. Более узкий термин, а именно, «щелочная протеаза», который охватывает подгруппу сериновых протеаз, отражает высокие оптимальные значения pH для некоторых сериновых протеаз, а именно от 9,0 до 11,0, (для ознакомления с обзором, см. Priest (1977) Bacteriological Rev. 41711-753).

Субтилазы

Подгруппа сериновых протеаз, условно называемых субтилазами, была предложена в работах Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 и Siezen et al., Protein Science 6 (1997) 501-523. Они определены с помощью гомологического анализа более 170 аминокислотных последовательностей сериновых протеаз, называвшихся ранее субтилизин-подобными протеазами. Ранее субтилизин часто определяли, как сериновую протеазу, вырабатываемую грамположительными бактериями или грибками, и, согласно Siezen и соавторам, сейчас его относят к подгруппе субтилаз. Был идентифицирован широкий круг субтилаз, и для ряда субтилаз были определены аминокислотные последовательности. С более подробным описанием таких субтилаз и их аминокислотных последовательностей можно ознакомиться в приведенной работе Siezen et al. (1997).

Одна подгруппа субтилаз, а именно I-S1 или «настоящие» субтилизины, включает «классические» субтилизины, например, субтилизин 168 (BSS168), субтилизин BPN’, субтилизин Carlsberg (ALCALASE®, NOVOZYMES A/S) и субтилизин DY (BSSDY).

Еще одна подгруппа субтилаз, а именно I-S2 или высокощелочные субтилизины, выявлена Siezen и соавторами (см. выше). Протеазы подгруппы I-S2 описаны как высокощелочные субтилизины и включают такие ферменты, как субтилизин PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Genencor International Inc.), субтилизин 309 (SAVINASE®, NOVOZYMES A/S), субтилизин 147 (BLS147) (ESPERASE®, NOVOZYMES A/S) и щелочную эластазу YaB (BSEYAB).

“SAVINASE^®”

SAVINASE^® поставляется на рынок NOVOZYMES A/S. Этот продукт представляет собой субтилизин 309 из B. Lentus, и отличается от BAALKP только в одном положении (N87S). SAVINASE^® имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.

Исходная субтилаза

Термин «исходная субтилаза» описывает субтилазу, определенную в соответствии с работами Siezen и соавторов (1991 и 1997). Для ознакомления с дополнительными подробностями см. описание «субтилаз» выше по тексту. Исходная субтилаза может также являться субтилазой, выделенной из природного источника, где при сохранении характеристик субтилазы осуществлялись последующие модификации. Кроме того, исходная субтилаза может являться субтилазой, которая получена по методике перестановок в ДНК, например, описанной J.E.Ness et al., Nature Biotechnology, 17, 893-896 (1999).

Альтернативно, термин «исходная субтилаза» может быть заменен термином «субтилаза дикого типа».

Для справки ниже приведена таблица акронимов различных субтилаз, указанных в настоящем описании, и для ознакомления с другими акронимами, см. Siezen et al., Protein Engng.4 (1991) 719-737 и Siezen et al., Protein Science 6 (1997) 501-523.

Таблица III
	Фермент	Акроним
Микроорганизм бактерия: грамположительная
Bacillus subtilis 168	субтилизин I168, apr	BSS168
Bacillus amyloliquefaciens	субтилизин BPN’(NOVO)	BASBPN
Bacillus subtilis DY	субтилизин DY	BSSDY
Bacillus licheniformis	субтилизин Carlsberg	BLSCAR
Bacillus lentus	субтилизин 309	BLSAVI
Bacillus lentus	субтилизин 147	BLS147
Bacillus alcalophilus PB92	субтилизин PB92	BAPB92
Bacillus YaB	щелочная эластаза YaB	BYSYAB
Bacillus sp. NKS-21	субтилизин ALP I	BSAPRQ
Bacillus sp. G-825-6	субтилизин Sendai	BSAPRS
Thermoactinomyces vulgaris	термитаза	TVTHER

Модификация(и) субтилазы

Имеется в виду, что термин «модификация(и)» включает химическую модификацию субтилазы, а также генетические операции с ДНК, кодирующей субтилазу. Модификация(и) может представлять собой замену(ы) аминокислотной боковой цепи(ей), замену(ы), делецию(и) и/или вставку(и) в и/или по представляющему интерес аминокислотному остатку(ам).

Вариант субтилазы

Термин «вариант» и термин «вариант субтилазы» определены выше.

Гомологичные последовательности субтилаз

Гомология между двумя аминокислотными последовательностями в данном контексте для целей настоящего изобретения описывается параметром «идентичность», где степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяется с применением алгоритма Нидлмана-Вунша, как описано выше. Результатом применения данного алгоритма, помимо выравнивания аминокислотных последовательностей, является вычисление «идентичности в процентах» между двумя последовательностями.

Выявление подходящих гомологичных субтилаз, которые можно модифицировать согласно настоящему изобретению, является стандартной операцией для специалиста в данной области техники на основании настоящего описания.

В одном из аспектов исходная протеаза включает аминокислотную последовательность, имеющую степень идентичности с SEQ ID NO:1 предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно, не менее 81%, более предпочтительно, не менее 82%, более предпочтительно не менее 83%, более предпочтительно, не менее 84%, более предпочтительно, не менее 85%, более предпочтительно, не менее 86%, более предпочтительно, не менее 87%, более предпочтительно, не менее 88%, более предпочтительно, не менее 89%, еще более предпочтительно, не менее 90%, более предпочтительно, не менее 91%, более предпочтительно, не менее 92%, более предпочтительно, не менее 93%, более предпочтительно, не менее 94%, наиболее предпочтительно не менее 95%, и еще более предпочтительно не менее 96%, не менее 97%, не менее 98% или не менее 99%, или даже 100% идентичность с SEQ ID NO:1.

По существу гомологичные варианты исходной протеазы могут иметь одну или более (несколько) замен, делеций и/или вставок аминокислотных остатков, где в контексте настоящего описания термин «одна или более» является взаимозаменяемым с термином «несколько». Эти изменения предпочтительно носят несущественный характер, т.е. представляют собой консервативные замены аминокислотных остатков, как описано выше, и другие замены, которые не оказывают существенного влияния на укладку трехмерной структуры или активность белка или полипептида; небольшие делеции, как правило, от одного до примерно 30 аминокислотных остатков; и небольшие удлинения амино- и карбокси-концов, например, введение амино-концевого метионинового остатка, небольшого линкерного пептида длиной примерно до 20-25 остатков, или небольшого удлинения, облегчающего очистку (аффинной метки), например, полигистидинового фрагмента или белка A (Nilsson et al., 1985, EMBO J. 4:1075; Nilsson et al., 1991, Methods Enzymol. 198:3. См. также, для общей информации, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2:95-107).

Хотя описанные выше изменения предпочтительно носят несущественный характер, эти изменения могут также носить и существенный характер, например, включать встраивание крупных полипептидов размером до 300 аминокислотных остатков или более в качестве амино- или карбокси-концевых удлинений.

Исходная протеаза может включать или состоять из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1 или ее аллельных вариантов; или их фрагментов, имеющих протеолитическую активность. В одном из аспектов исходная протеаза включает или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.

Варианты субтилаз

Настоящее изобретение относится к новым вариантам субтилаз, демонстрирующим изменения одного или нескольких свойств по сравнению с исходной субтилазой, а именно: моющей эффективности, например, демонстрирующим улучшенную способность удаления загрязнений, моющей эффективности при очистке твердых поверхностей, например, при мытье посуды, устойчивости, например, при хранении или термической уст