Стабилизированные содержащие антитела жидкие композиции

Стабилизированные содержащие антитела жидкие композиции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение касается содержащих антитела композиций, в частности, устойчивых высококонцентрированных содержащих антитела композиций.

Уровень техники

В последние годы существует возрастающая потребность в разработке самоинъектируемых содержащих антитела композициях для подкожных инъекций в соответствии с медицинскими потребностями. Разработка содержащих антитела композиций для подкожных инъекций вызывает необходимость в повышении концентрации антитела во вводимом растворе, поскольку отдельные дозы антитела очень высоки (приблизительно от 100 до 200 мг), и объем инъекции для подкожного введения, как правило, ограничен.

Высококонцентрированные содержащие антитела растворы имеют склонность к самостоятельному образованию высоковязких растворов из-за межмолекулярного взаимодействия и макромолекулярные характеристики белка. Кроме того, явление деградации, например, агрегация, становится проблематичным, когда белки хранятся в виде высококонцентрированных растворов, и, таким образом, такую деградацию необходимо предотвратить. В частности, высококонцентрированные содержащие антитела растворы склонны к образованию агрегатов во время замораживания-оттаивания или при хранении в жидком или замороженном состояниях в течение длительного времени (непатентные документы 1 и 2).

В настоящее время такие высококонцентрированные содержащие антитела композиции, как правило, приготавливают традиционным способом концентрирования путем лиофилизации (патентный документ 1), который представляет собой способ стабилизации высококонцентрированных содержащих антитела композиций. Согласно этому способу, высококонцентрированные содержащие антитела композиции получают путем лиофилизации раствора антитела относительно низкой концентрации и растворения в объеме воды, меньшем, чем объем до лиофилизации. В этом случае проблему вызывает повышенная вязкость растворенных композиций, поскольку должен добавляться криопротектор, такой, как сахар, для получения лиофилизированных композиций.

В этом аспекте этой проблемы можно избежать, если жидкую композицию приготавливать без лиофилизации. Однако, как описано выше, высококонцентрированные содержащие антитела жидкие композиции склонны к образованию агрегатов. Несмотря на это, в таких композициях существует большая потребность, поскольку содержащие антитела жидкие композиции легче поддаются обработке по сравнению с лиофилизированными композициями и легче могут быть рецептированы в композиции для предварительного наполнения шприцев.

Проводились разные исследования по стабилизации высококонцентрированных содержащих антитела жидких композиций (непатентные документы 1-4). Как известно из сообщений, гистидиновый буфер и аргинин могут использоваться в качестве буфера и стабилизатора, соответственно, в содержащих антитела жидких композициях (патентные документы 2, 3, 4, 5 и 6). Гистидиновый буфер обычно применяется в форме соли хлористоводородной кислоты. Недавно сообщалось о том, что гистидин-ацетат демонстрирует больший стабилизирующий эффект по сравнению с гистидин гидрохлоридом, и, таким образом, уксусная кислота может применяться как разновидность противоиона в гистидиновом буфере (патентный документ 6). В то же время, аргинин в качестве стабилизатора, как правило, применяется в форме аргинин гидрохлорида. Однако в некоторых случаях, достаточная устойчивость не достигается, когда хлористоводородную кислоту или уксусную кислоту используют в качестве разновидности противоиона к гистидину или аргинину. Таким образом, нужны более эффективные разновидности противоиона.

Документы существующего уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: WO 1997/004801

Патентный документ 2: WO 2008/121615

Патентный документ 3: WO 2009/141239

Патентный документ 4: WO 2008/071394

Патентный документ 5: WO 2006/065746

Патентный документ 6: WO 2006/044908

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Challenges in the development of high protein concentration formulations, J Pharm Sci, 2004, 93(6), 1390-1402

Непатентный документ 2: Curr Opin Biotechnol. 2009 Dec; 20(6): 708-14. Epub 2009 Oct 31

Непатентный документ 3: Antibody structure, instability, and formulation, J Pharm Sci, 2007, 96(1), 1-26

Непатентный документ 4: Formulation and delivery issues for monoclonal antibody therapeutics, Adv Drug Del Rev, 2006, 58(5-6), 686-706

Описание изобретения

[Проблемы, решаемые благодаря изобретению]

Цель настоящего изобретения состоит в обеспечении устойчивых высококонцентрированных содержащих антитела композиций, подходящих для подкожного введения.

[Средства решения проблем]

Для достижения вышеописанной цели авторы настоящего изобретения провели специальные исследования. В результате авторами настоящего изобретения было обнаружено, что значительно более высокий эффект стабилизации достигается благодаря применению кислой аминокислоты, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты в качестве разновидностей противоиона в гистидиновом буфере или трис(гидроксиметил)аминометановом буфере, т.е., гистидин-аспартатном буфере или гистидин-глутаматном буфере или трис(гидроксиметил)аминометан-аспартатном буфере или трис(гидроксиметил)аминометан-глутаматном буфере по сравнению с традиционными буферами для фармацевтических композиций, такими, как гистидин-гидрохлоридный буфер и гистидин-ацетатный буфер. Авторами настоящего изобретения также было обнаружено, что значительно более высокий эффект стабилизации достигается благодаря применению аргинин-аспартата или аргинин-глутамата в качестве стабилизатора, т.е., благодаря применению кислой аминокислоты, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты как разновидности противоиона к основной аминокислоте, такой, как аргинин, которая применяется в качестве стабилизатора, по сравнению с традиционными стабилизаторами для фармацевтических композиций, такими, как аргинин гидрохлорид. Таким образом, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что устойчивые высококонцентрированные содержащие антитела жидкие композиции могут быть получены путем их добавления в качестве стабилизатора, и, таким образом, было выполнено настоящее изобретение.

Конкретно настоящее изобретение обеспечивает:

[1] устойчивую содержащую антитело композицию, включающую основную аминокислоту-аспартат или основную аминокислоту-глутамат;

[2] композицию [1], включающую гистидин-аспартатный буфер или гистидин-глутаматный буфер, причем основной аминокислотой является гистидин;

[3] композицию [1], включающую аргинин-аспартат или аргинин-глутамат, причем основной аминокислотой является аргинин;

[4] устойчивую содержащую антитело композицию, включающую гистидин-аспартатный буфер или гистидин-глутаматный буфер и аргинин-аспартат или аргинин-глутамат;

[5] устойчивую содержащую антитело композицию, включающую трис(гидроксиметил)аминометан-аспартатный буфер или трис(гидроксиметил)аминометан-глутаматный буфер;

[6] устойчивую содержащую антитело композицию, включающую трис(гидроксиметил)аминометан-аспартатный буфер и трис(гидроксиметил)аминометан-глутаматный буфер;

[7] композицию в соответствии с любым из пунктов с [1] по [6], которая по сути не содержат иона хлорида и ион ацетата;

[8] композицию в соответствии с любым из пунктов с [1] по [7], которая дополнительно включает сахар;

[9] композицию в соответствии с любым из пунктов с [1] по [8], причем антитело является гуманизированным антителом или человеческим антителом;

[10] композицию в соответствии с любым из пунктов с [1] по [9], причем антитело было модифицировано для обеспечения изоэлектрической точки (pI) от 5 до 8;

[11] композицию в соответствии с любым из пунктов с [1] по [10], причем концентрация антитела составляет 50 мг/мл или более;

[12] композицию в соответствии с любым из пунктов с [1] по [10], причем концентрация антитела составляет от 50 до 250 мг/мл;

[13] композицию в соответствии с любым из пунктов с [1] по [12], которая является жидкой композицией;

[14] композицию в соответствии с [13], причем вязкость жидкой композиции составляет 30 мПа⋅с или менее;

[15] композицию в соответствии с [13] или [14], причем жидкая композиция является устойчивой при температуре от 2°С до 8°С в течение как минимум шести месяцев;

[16] композицию в соответствии с любым из пунктов с [13] по [15], которая не подвергалась лиофилизации во время приготовления композиции;

[17] композицию в соответствии с любым из пунктов с [13] по [16], которую хранят в замороженном виде при температуре от -30°С до -10°С;

[18] композицию в соответствии с любым из пунктов с [1] по [12], причем композиция является лиофилизированной композицией;

[19] композицию в соответствии с любым из пунктов с [2], [4] и с [7] по [18], причем концентрация буфера составляет от 5 до 100 мМ;

[20] композицию в соответствии с любым из пунктов с [3] и с [7] по [19], причем концентрация аргинина составляет от 5 до 300 мМ;

[21] композицию в соответствии с любым из пунктов с [1] по [20], причем антитело является антителом к рецептору IL-6;

[22] композицию в соответствии с любым из пунктов с [2], [4] и с [7] по [21], причем буфер по сути включает только аминокислоту(ы);

[23] композицию в соответствии с любым из пунктов с [1] по [22], которая предназначается для подкожного введения;

[24] способ подавления образования агрегатов во время хранения высококонцентрированной содержащей антитело композиции в замороженном виде путем применения аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты в качестве разновидности противоиона к буферу в композиции;

[25] способ подавления образования агрегатов во время хранения высококонцентрированной содержащей антитело композиции в виде жидкости путем применения аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты в качестве разновидности противоиона к буферу в композиции;

[26] способ подавления образования агрегатов во время хранения высококонцентрированной содержащей антитело композиции в замороженном виде путем применения аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты в качестве разновидности противоиона к стабилизатору в композиции; и

[27] способ подавления образования агрегатов во время хранения высококонцентрированной содержащей антитело композиции в виде жидкости путем применения аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты в качестве разновидности противоиона к стабилизатору в композиции.

Кроме того, настоящее изобретение касается применения основной аминокислоты-аспартата или основной аминокислоты-глутамата в производстве устойчивой содержащей антитело композиции; и аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты в качестве разновидности противоиона к буферу или стабилизатору в высококонцентрированной содержащей антитело композиции, которые применяются согласно способу подавления агрегации во время хранения композиции в замороженном виде или в виде жидкости.

[Эффект изобретения]

Настоящее изобретение обеспечивает содержащие антитела композиции, обладающие превосходной устойчивостью. Настоящее изобретение также может обеспечивать высококонцентрированные содержащие антитела композиции путем подавления образования агрегатов в замороженных и жидких композициях. Высококонцентрированные содержащие антитела композиции согласно настоящему изобретению могут сохранять устойчивость при хранении в жидком или замороженном состоянии в течение длительного периода. Кроме того, композиции согласно настоящему изобретению обладают повышенной устойчивостью к нагрузкам при замораживании-оттаивании. Кроме того, в отношении осмотического давления стабилизация может достигаться без повышения осмотического давления путем применения аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты вместо традиционно применяемых хлористоводородной кислоты и уксусной кислоты в качестве разновидности противоиона к гистидину, аргинину или трис(гидроксиметил)аминометану. Преимущество состоит в достижении стабилизации без повышения осмотического давления с целью получения почти изотонических, устойчивых композиций, таких, как композиции для подкожного (SC) введения.

Краткое описание фигур

Фиг.1 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время хранения Mab1 при 40°С на вертикальной оси.

Фиг.2 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время хранения Mab2 при 40°С на вертикальной оси.

Фиг.3 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время замораживания-оттаивания Mab1 на вертикальной оси.

Фиг.4 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время хранения Mab1 при 25°С на вертикальной оси.

Фиг.5 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время хранения Mab1 при 5°С на вертикальной оси.

Фиг.6 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время замораживания-оттаивания (от -20°С до комнатной температуры) Mab1 на вертикальной оси.

Фиг.7 представляет график, показывающий количество (%) агрегата после трех месяцев хранения Mab1 при -20°С на вертикальной оси.

Фиг.8 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время замораживания-оттаивания (-20°С до комнатной температуры) Mab2 на вертикальной оси.

Фиг.9 представляет график, показывающий количество (%) агрегата после хранения Mab1 при -20°С на вертикальной оси.

Фиг.10 представляет график, показывающий количество (%) агрегата после замораживания-оттаивания (-20°С до комнатной температуры) Mab1 на вертикальной оси.

Фиг.11 представляет график, показывающий количество (%) агрегата после трех месяцев хранения Mab1 при 25°С на вертикальной оси.

Фиг.12 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время хранения Mab2 при 25°С на вертикальной оси.

Фиг.13 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время хранения Mab3 при 25°С на вертикальной оси.

Фиг.14 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время замораживания-оттаивания (от -20°С до комнатной температуры) Mab3 на вертикальной оси.

Фиг.15 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время хранения Mab4 при 25°С на вертикальной оси.

Фиг.16 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время замораживания-оттаивания (от -20°С до комнатной температуры) Mab4 на вертикальной оси.

Фиг.17 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время хранения Mab1, Mab2 и Mab3 при 25°С на вертикальной оси.

Фиг.18 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время замораживания-оттаивания (от -20°С до комнатной температуры) Mab1, Mab2 и Mab3 на вертикальной оси.

Фиг.19 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время хранения Mab5 при 25°С на вертикальной оси.

Фиг.20 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время замораживания-оттаивания (от -20°С до комнатной температуры) Mab5 на вертикальной оси.

Фиг.21 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время хранения Mab1, Mab2, Mab3 Mab4, и Mab5 при 25°С на вертикальной оси.

Фиг.22 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время замораживания-оттаивания (от -20°С до комнатной температуры) Mab1, Mab2, Mab3, Mab4 и Mab5 на вертикальной оси.

Фиг.23 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время хранения Mab1, Mab2 и Mab3 при 25°С на вертикальной оси.

Фиг.24 представляет график зависящих от времени изменений количества (%) агрегата во время замораживания-оттаивания (от -20°С до комнатной температуры) Mab1, Mab2 и Mab3 на вертикальной оси.

Способ осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение описывается более подробно.

Настоящее изобретение обеспечивает устойчивые содержащие антитела композиции, включающие основную аминокислоту-аспартат или основную аминокислоту-глутамат. Согласно настоящему изобретению, к основным аминокислотам относятся, например, гистидин, аргинин и лизин. Кроме того, согласно настоящему изобретению, буферы основных аминокислот, такие, как трис(гидроксиметил)аминометан, также включаются в определение основных аминокислот согласно настоящему изобретению.

Так, настоящее изобретение обеспечивает устойчивые содержащие антитела композиции, включающие гистидин-аспартатный буфер или гистидин-глутаматный буфер, в которых основной аминокислотой является гистидин. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает устойчивые содержащие антитела композиции, включающие аргинин-аспартат или аргинин-глутамат в качестве стабилизатора, в которых основной аминокислотой является аргинин. Настоящее изобретение также обеспечивает устойчивые содержащие антитела композиции, включающие гистидин-аспартатный буфер или гистидин-глутаматный буфер и аргинин-аспартат или аргинин-глутамат. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает устойчивые содержащие антитела композиции, включающие трис(гидроксиметил)аминометан-аспартатный буфер или трис(гидроксиметил)аминометан-глутаматный буфер. Настоящее изобретение также обеспечивает устойчивые содержащие антитела композиции, включающие трис(гидроксиметил)аминометан-аспартатный буфер и трис(гидроксиметил)аминометан-глутаматный буфер. Содержащая антитела композиция согласно настоящему изобретению означает композицию, включающую антитело в качестве активного ингредиента и приготавливается в форме, обеспечивающей возможность введения животным, включая человека.

В контексте данного описания "устойчивая содержащая антитела композиция" означает композицию, в которой практически не образуются агрегаты белков, таких, как антитело, в частности, композицию, в которой деградация, например, образование нерастворимых и растворимых агрегатов, практически не происходит во время хранения в жидком или замороженном состоянии.

Концентрация антитела в композиции согласно настоящему изобретению особенно не ограничивается; однако композиция предпочтительно содержит высококонцентрированное антитело. Концентрация антитела предпочтительно составляет 50 мг/мл или более, более предпочтительно - 100 мг/мл или более, еще более предпочтительно - 120 мг/мл или более, еще более предпочтительно - 150 мг/мл или более, и еще более предпочтительно - 180 мг/мл или более. Конкретного верхнего предела концентрации антитела в композиции согласно настоящему изобретению не предусмотрено; однако предельное значение, как правило, составляет 250 мг/мл.

В отношении антител, используемых согласно настоящему изобретению, особенных ограничений нет, и главным условием является их связывание с нужным антигеном. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными антителами; однако моноклональным антителам отдается предпочтение, поскольку они могут устойчиво вырабатываться как гомогенные антитела.

К моноклональным антителам, используемым согласно настоящему изобретению, относятся не только антитела, взятые из организма животных, включая человека, мышей, крыс, хомяков, кролей, овец, верблюдов и обезьян, но и искусственно модифицированные гены рекомбинантных антител, таких, как химерные антитела, гуманизированные антитела и биспецифические антитела. К антителам согласно настоящему изобретению также относятся гены рекомбинантных антител, полученные в результате искусственной модификации постоянных областей антитела для изменения физических свойств молекулы антитела (в частности, изменения изоэлектрической точки (pI), улучшения аффинности к Fc-рецептору и т.п.) с целью улучшения устойчивости в крови и in vivo фармакокинетики.

Иммуноглобулиновый класс антител, используемых согласно настоящему изобретению, особенно не ограничивается; и этот класс может быть любым классом, включающим IgG, например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA, IgD, IgE и IgM. Однако предпочтение отдается IgG и IgM.

Антитела, используемые согласно настоящему изобретению, также включают не только целые антитела, но и фрагменты антител, такие, как Fv, Fab, и F(ab)2, и мини-антитела (антитела с низкой молекулярной массой), такие, как одновалентные или двухвалентные одноцепочечные Fv, возникающие в результате связывания вариабельных областей антитела через линкер, такой, как пептидный линкер (scFv, sc(Fv)2, диатела, такие, как димер scFv, и т.п.).

Вышеописанные антитела, используемые согласно настоящему изобретению, могут быть получены способами, известными специалистам в данной области.

Как правило, вырабатывающие моноклональные антитела гибридомы могут быть получены описанными ниже традиционными способами. В частности, иммунизацию осуществляют традиционным способом иммунизации, применяя нужный антиген или клетки, экспрессирующие нужный антиген как сенсибилизирующий антиген. Подготовленные иммуноциты сливают с известными родительскими клетками, применяя традиционный способ слияния клеток. Слитые клетки отбирают на вырабатывающие моноклональные антитела клетки (гибридомы) традиционными способами отбора. Гибридомы могут быть получены, например, согласно способу, описанному в публикации Milstein et al. (Kohler, G. и Milstein, С., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46). Если антиген обладает низкой иммуногенностью, иммунизация может производиться с применением антигена, связанного с иммуногенными макромолекулами, такими, как альбумин.

В альтернативном варианте возможно использование генов рекомбинантных антител, полученных с применением технологий рекомбинации генов, при которых гены антител клонируют из гибридом и вставляют в соответствующие векторы, и полученные в результате векторы вводят в организмы-хозяева (см., например, Carl, А.К. Borrebaeck, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, Published in the United Kingdom by Macmillan Publishers, 1990). Так, кДНК для вариабельных областей (V-областей) антитела синтезируют из мРНК гибридом с использованием обратной транскриптазы. Когда получают ДНК, кодирующую нужную V-область антитела, ДНК связывают с ДНК, кодирующей нужную константную область (С-область) антитела. Полученную в результате последовательность вставляют в вектор экспрессии. В альтернативном варианте Кодирующая V-область антитела ДНК может быть вставлена в вектор экспрессии, включающий ДНК С-области антитела. Полученную в результате последовательность вставляют в вектор экспрессии таким образом, чтобы она экспрессировалась под контролем участка регулирования экспрессии, например, энхансера и промотора. Затем клетки-хозяева трансформируют вектором экспрессии для экспрессии антитела.

Согласно настоящему изобретению, искусственно модифицированные гены рекомбинантных антител, таких, как химерные и гуманизированные антитела, могут применяться для снижения гетерологической антигенности против человека. Такие модифицированные антитела могут вырабатываться с применением известных способов. Химерное антитело является антителом, имеющим вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи антитела из организма отличного от человека млекопитающего, такого, как мышь, и тяжелой цепи и легкой цепи константных областей человеческого антитела. Химерное антитело может быть получено путем связывания ДНК, кодирующей вариабельные области антитела мыши с ДНК, кодирующей константные области человеческого антитела, вставки лиганда в вектор экспрессии с последующей вставкой вектора в организм-хозяин для экспрессии.

Гуманизированное антитело также называют реконструированным человеческим антителом, получаемым путем замещения гипервариабельного участка (CDR) человеческого антитела гипервариабельным участком антитела, взятого из организма отличного от человека млекопитающего, например, мыши. Традиционные технологии рекомбинации генов известны. Так, последовательность ДНК конструируют таким образом, чтобы она включала CDR антитела мыши, связанный с каркасным участком (FR) человеческого антитела, и синтезируют путем PCR с применением нескольких олигонуклеотидов, предусмотренных с перекрывающимися участками на концах. Полученную ДНК лигируют с ДНК, кодирующей константную область человеческого антитела, а затем вставляют в вектор экспрессии. Вектор экспрессии включают в организм-хозяин для образования гуманизированного антитела (см., Публикацию европейской патентной заявки № ЕР 239400 и WO 96/02576). FR CDR-связанного человеческого антитела выбирают таким образом, чтобы гипервариабельный участок образовывал предпочтительный антиген-связывающий домен. Аминокислоты в каркасном участке вариабельной области антитела могут быть замещены в соответствии с требованием, таким образом, чтобы гипервариабельный участок реконструированного человеческого антитела образовывал соответствующий антиген-связывающий домен (Sato, К. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Существуют способы замещения аминокислот в антителах для улучшения активности антител, их физических свойств, фармакокинетики, безопасности и т.п. Примеры таких способов описываются ниже. К антителам согласно настоящему изобретению также относятся имеющие такие аминокислотные замещения.

Описываются способы замещения аминокислот в вариабельных областях IgG-антител, и к ним относятся гуманизация (Tsurushita N, Hinton PR, Kumar S., Design of humanized antibodies: from anti-Tac to Zenapax., Methods. 2005 May; 36(1): 69-83); матричного созревания для повышения активности связывания через замещение аминокислот в гипервариабельном участке (CDR) (Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Jun 14; 102(24): 8466-71); и улучшения физико-химической устойчивости через замещение аминокислот в каркасе (FR) (Ewert S, Honegger A, Pluckthun A., Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering., Methods. 2004 Oct; 34(2): 184-99. Review). Также известны способы повышения опосредованной антителами клеточной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC) путем замещения аминокислот в Fc-домене IgG-антитела (Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31; 20(1): 17-29. Review). Кроме того, помимо способов повышения эффекторных функций, существуют публикации о способах улучшения времени полужизни антитела в крови путем замещения аминокислот в Fc (Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1; 176(1): 346-56; Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul; 15(7): 637-40). Другая известная технология включает способ замещения аминокислот для контроля изоэлектрической точки (pI) антитела с целью улучшения устойчивости в крови или in vivo фармакокинетики, в частности, способ модификации аминокислотных остатков, открытых на поверхности антитела, для контроля pI антитела (документ WO 07/114319). Также известны различные способы замещения аминокислот в константных областях с целью улучшения физических свойств антитела (документ WO 09/41613).

Снижение дозы антитела в качестве фармацевтического средства или увеличение интервала введения антитела, очевидно, можно обеспечить путем увеличения периода полужизни антитела или его удерживания в плазме. Перспективные технологии, позволяющие этого достичь включают способ уменьшения изоэлектрической точки антитела (документ WO 07/114319). Композиции согласно настоящему изобретению обладают высоким стабилизирующим эффектом для антител с измененной изоэлектрической точкой. PI-модифицированное антитело означает модифицированное антитело, pI которого ниже, чем показатель исходного антитела, на один или более, предпочтительно два или более, и более предпочтительно - три или более. Как правило, предполагается, что природные (или обычные) антитела имеют изоэлектрическую точку в пределах от 7,5 до 9,5. Композиции согласно настоящему изобретению имеют высокое стабилизирующее влияние, в частности, на антитела с низкой изоэлектрической точкой, которая вряд ли существует в природе. Изоэлектрическая точка таких антител может составлять от 5,0 до 8,0, предпочтительно от 5,0 до 7,5, более предпочтительно - от 5,0 до 7,0, и еще более предпочтительно - от 5,5 до 6,5. Как описывается ниже в Примерах, изоэлектрическая точка Mab1, полученного путем модификации аминокислотной последовательности Mab2 (изоэлектрическая точка = 9,3) для контроля изоэлектрической точки, составляла 5,8.

Способы получения человеческих антител также известны. Например, нужные человеческие антитела с антигенсвязывающей активностью могут быть получены путем сенсибилизации человеческих лимфоцитов нужным антигеном или клетками, экспрессирующими нужный антиген in vitro; и слияния сенсибилизированных лимфоцитов с клетками человеческой миеломы, такими, как U266 (см. Публикацию японской патентной заявки Kokoku № (JP-B) Н01-59878 (прошедшая экспертизу утвержденная японская патентная заявка, опубликованная для противопоставления)). В альтернативном варианте нужные человеческие антитела также могут быть получены путем иммунизации трансгенных животных, имеющих полный набор генов человеческих антител, антигеном (см. документы WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735). Кроме того, известны способы получения человеческих антител путем пэннинга с библиотекой человеческих антител. Например, вариабельные области человеческих антител могут экспрессироваться как одноцепочечные антитела (scFvs) на поверхности фагов с применением фаг-дисплейного метода, и затем могут отбираться фаги, связывающиеся с антигеном. Гены отобранных фагов анализируют для определения последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области человеческих антител, которые связываются с антигеном. При распознавании последовательностей ДНК scFvs, которые связываются с антигеном, могут быть построены соответствующие векторы экспрессии, включающие эти последовательности, для получения человеческих антител. Такие способы уже хорошо известны. См. документы WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388. Антитела, применяемые согласно настоящему изобретению, также включают такие человеческие антитела.

Когда гены антител выделяют и вводят в соответствующие организмы-хозяева для вырабатывания антител, хозяева и векторы экспрессии могут использоваться в соответствующих комбинациях. Если в качестве хозяев используются эукариотные клетки, могут использоваться животные клетки, растительные клетки и грибковые клетки. К животным клеткам относятся: (1) клетки млекопитающих, такие, как СНО, COS, клетки миеломы, клетки почек новорожденного хомяка (ВНК), HeLa и Vero; (2) клетки земноводных, такие, как ооциты шпорцевой лягушки Xenopus; и (3) клетки насекомых, такие, как sf9, sf21 и Tn5. К известным растительным клеткам относятся клетки, полученные из рода Nicotiana, например, Nicotiana tabacum, которые могут культивироваться в виде каллюса. К известным грибковым клеткам относятся дрожжи, например, рода Saccharomyces, например, Saccharomyces cerevisiae, и нитчатые грибы, например, рода Aspergillus, например, Aspergillus niger. Если используются прокариотные клетки, могут использоваться продукционные системы, в которых используются бактериальные клетки. К известным бактериальным клеткам относятся Escherichia coli (E.coli) и Bacillus subtilis. Антитела могут быть получены путем введения нужных генов антител в эти клетки при помощи трансформации с последующим культивированием трансформированных клеток in vitro.

Антитела, применяемые согласно настоящему изобретению, также включают фрагменты антител, мини-антитела и модифицированные антитела. К таким фрагментам антител и мини-антителам относятся, например, Fab, F(ab’)2, Fv или одно-, двух- или многовалентные одноцепочечные Fv (scFv, sc(Fv)2 и т.п.), образующиеся в результате связывания Н-цепочечных и L-цепочечных Fv через соответствующие линкеры (Huston J.S. et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5879-5883). В частности, такие фрагменты антител образуются при обработке антител ферментом, таким, как папаин или пепсин. В альтернативном варианте ген, кодирующий фрагмент антитела, строят, вставляют в вектор экспрессии и экспрессируют в соответствующих клетках-хозяевах (см., например, Со, М.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. и Horwitz, A.H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, А. и Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R.E. и Walker, B.W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

К модифицированным антителам относятся антитела, связанные с полиэтиленгликолем (PEG) или разными молекулами, такими, как цитотоксические средства (Farmaco. 1999 Aug 30; 54(8): 497-516; Cancer J. 2008 May-Jun; 14(3): 154-69). К "антителам" согласно настоящему изобретению также относятся такие модифицированные антитела. Такие модифицированные антитела могут быть приготовлены путем химической модификации полученных антител. Такие способы являются традиционными в данной области.

К антителам, которые могут содержаться в композициях согласно настоящему изобретению, помимо прочих, относятся антитела против тканевого фактора, антитела против рецептора IL-6, антитела против IL-6, моноклональные антитела против HM1.24-антигена, антитела против родственного паратиреоидному гормону пептида (антитела против PTHrP), антитела против глипикана-3, антитела против ганглиозида GM3, антитела против агониста ТРО-рецептора, антитела в качестве функционального заместителя фактора коагуляции VIII, антитела против рецептора IL31, антитела против HLA, антитела против AXL, антитела против CXCR4, антитела против NR10 и биспецифические антитела против фактора IX и фактора X.

К предпочтительным реконструированным гуманизированным антителам, применяемым согласно настоящему изобретению, относятся гуманизированные антитела против рецептора интерлейкина 6 (IL-6) (тоцилизумаб, hPM-1 и MRA) (см. документ WO 92/19759), гуманизированные моноклональные антитела против НМ1.24-антигена (см. документ WO 98/14580), гуманизированные антитела против родственного паратиреоидному гормону пептида (антитела против PTHrP) (см. документ WO 98/13388), гуманизированные антитела против тканевого фактора (см. документ WO 99/51743), гуманизированные антитела против глипикана-3 IgG1κ (см. документ PCT/JP 05/013103) и гуманизированные антитела против NR10 (см. документ WO 2009/072604). Особое предпочтение среди гуманизированных антител, применяемых согласно настоящему изобретению, отдается гуманизированным антителам против рецептора IL-6.

К предпочтительным человеческим IgM-антителам относятся рекомбинантные человеческие IgM-антитела против ганглиозида GM3 (см. документ WO 05/05636).

К предпочтительным мини-антителам относятся диатела против агониста ТРО-рецептора (см. документ WO 02/33072) и диатела против агониста CD47 (см. документ WO 01/66737).

Кроме того, к антителам с улучшенной изоэлектрической точкой относятся, например, Mab1 (Н-цепь/SEQ ID NO: 1; L-цепь/SEQ ID NO: 2), которое является антителом к рецептору IL-6, описанным в документе WO 2009/041621, гуманизированные антитела против NR10 и полностью гуманизированные антитела NS22, получаемые при помощи способа, описанного в Примере 12 документа WO 2009/072604.

В предпочтительном варианте осуществления буфер композиции согласно настоящему изобретению (например, гистидин-аспартатный буфер, гистидин-глутаматный буфер, трис(гидроксиметил)аминометан-аспартатный буфер или трис(гидроксиметил)аминометан-глутаматный буфер) получают путем титрования водного раствора, содержащего основную аминокислоту, такую, как гистидин или трис(гидроксиметил)аминометан, в форме свободной аминокислоты водным раствором, содержащим аспарагиновую кислоту и/или глутаминовую кислоту в форме свободной аминокислоты. В альтернативном варианте буфер может быть получен путем добавления ингредиентов в обратном порядке или путем прямого титрования с порошками.

В предпочтительном варианте осуществления аргинин-аспартат или аргинин-глутамат в композиции согласно настоящему изобретению представляет собой соль, приготовленную путем титрования водного раствора, содержащего аспарагиновую кислоту (свободную аминокислоту) и/или глутаминовую кислоту (свободную аминокислоту) в форме свободной аминокислоты с водным раствором, содержащим аргинин (свободное основание) в форме свободной аминокислоты. В альтернативном варианте соль может быть получена путем добавления ингредиентов в обратном порядке или путем прямого титрования с порошками.

Авторы настоящего изобретения осуществляли исследование с замораживанием-оттаиванием, исследование с термическим ускорением, исследование долгосрочной устойчивости и исследование хранение в замороженном состоянии для оценки влияния различных добавок на устойчивость высококонцентрированных комп